基于生物信息學(xué)篩選慢性腎臟病進展中自噬關(guān)鍵基因及潛在中藥預(yù)測研究

桑田，王億平

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，安徽合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，安徽合肥 230031

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）是一種漸進性疾病，其特點是由于各種原因造成的腎臟結(jié)構(gòu)和功能的改變[1]。全世界約有10%的成年人受到某種形式的CKD 的影響，每年造成120 萬人死亡和2800 萬人的生命損失[2-3]。然而，CKD的致病基因和分子機制尚未完全闡明。識別與該病相關(guān)的新的關(guān)鍵風(fēng)險基因?qū)τ诎l(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點具有重要意義，有助于深入理解CKD 的病理、生理過程，且對提升CKD 的早期診斷和治療具有顯著意義。自噬是一種關(guān)鍵的穩(wěn)態(tài)機制，可清除各種受損或不需要的細胞內(nèi)成分，以在應(yīng)激條件下保護腎細胞。另外，自噬缺乏會增加腎臟損傷的易感性，導(dǎo)致腎功能下降、線粒體受損蓄積、嚴重腎纖維化和早期腎衰竭[4-5]。據(jù)報道，雙酚A（bisphenol A，BPA）可通過升高的自噬相關(guān)基因5（autophagyrelated gene 5，Atg5）、自噬相關(guān)基因7（autophagyrelated gene 7，Atg7）、微管相關(guān)蛋白1A/1B 輕鏈3B（Map1lc3b/ Lc3b）和Beclin-1 基因水平調(diào)節(jié)自噬過程，加劇慢性腎損傷[6]。因此，需進一步研究來明確自噬相關(guān)基因在CKD 進展中的作用，挖掘潛在的治療中藥，對CKD 的診斷與治療具有重要意義。

本研究旨在通過從基因表達總表（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫下載的整合基因表達譜數(shù)據(jù)來探索自噬相關(guān)基因在腎纖維化中的作用。利用支持向量機（support vector machine，SVM）模型確定關(guān)鍵自噬關(guān)鍵基因，對關(guān)鍵基因預(yù)測可能的治療中藥。本研究為研究CKD 的分子機制和探索治療性中藥提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)搜集

通過人類自噬數(shù)據(jù)庫獲得參與自噬的基因。利用GEO 數(shù)據(jù)庫獲得包含8 名健康對照者和54 例CKD患者的腎組織樣本的GSE66494 數(shù)據(jù)集，基于平臺注釋文件將數(shù)據(jù)集中的探針標(biāo)識轉(zhuǎn)換為基因名，進行批次矯正后用于后續(xù)篩選差異表達基因。

1.2 差異表達分析和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析

使用R 包“l(fā)imma”分析232 個自噬相關(guān)基因在健康對照者和CKD 患者之間的差異表達水平，在|log2FC|>2 和校正后的P<0.05 的標(biāo)準(zhǔn)下，得到不同的自噬相關(guān)差異表達基因（differentially expressed autophagy-related genes，DEARGs），并利用ggplot2和pheatmap 包進行可視化處理。通過使用用于檢索相互作用基因的搜索工具（STRING 11.0）研究DEARGs 的功能相互作用。然后通過Cytoscape 3.9.1構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction networks，PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.3 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

為進一步研究自噬相關(guān)基因DEG 的富集途徑和功能，將基因?qū)隓AVID 6.8，并通過使用R 中的“ggplot2”包進一步可視化富集結(jié)果。

1.4 機器學(xué)習(xí)篩選關(guān)鍵基因

利用基于e1071 包的支持向量機-遞歸特征消除（support vector machine-recursive feature elimination，SVM-RFE）算法從重要DEG 中篩選特征基因，同時根據(jù)關(guān)鍵基因在正常樣本和CKD 患者樣本中的表達情況。利用受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC 曲線）評估關(guān)鍵基因診斷CKD 的有效性，并使用pROC 包繪制關(guān)鍵基因的ROC 曲線。

1.5 基于Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫的中藥篩選

利用Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫作為分析工具，將篩選得到的關(guān)鍵基因輸入該數(shù)據(jù)庫進行進一步分析。通過設(shè)置統(tǒng)計學(xué)顯著性閾值P<0.05，對基因與相應(yīng)中藥之間的關(guān)聯(lián)性進行映射，以識別具有潛在治療效果的中藥。

2 結(jié)果

2.1 差異表達分析和蛋白質(zhì)相互作用分析

從GEO 數(shù)據(jù)庫提取232 個自噬相關(guān)基因進行差異分析，得到67 個DEARGs，見圖1A。然后使用STRING 11.0 研究67 個DEARGs 的功能相互作用，通過Cytoscape 3.9.0 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，如圖1B。

圖1 DEG 的篩選及PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

2.2 GO 生物功能富集分析與KEGG 途徑富集化分析

為進一步探索67 個DEARGs 的富集途徑和功能，將基因?qū)隓AVID 6.8，并使用R 中的“ggplot2”包進一步可視化富集結(jié)果。這些基因主要參與大自噬、位于自噬體、主要表現(xiàn)為泛素?樣蛋白連接酶結(jié)合，見圖2A。KEGG 分析表明139 個DEARGs 主要參與巨自噬、自噬調(diào)節(jié)、細胞對外部刺激的反應(yīng)等，見圖2B。

圖2 GO 生物功能富集分析與KEGG 途徑富集化分析結(jié)果

2.3 SVM 篩選關(guān)鍵基因

為進一步縮小自噬相關(guān)基因的范圍，使用SVMRFE 算法對67 個CKD 的DEARGs 進行進一步篩選，見圖3A，得到2 個自噬關(guān)鍵基因ATF6、GNAI3。繪制ROC 曲線對關(guān)鍵基因的診斷效能進行評估，ROC曲線顯示ATF6、GNAI3在曲線下面積（area under the curve，AUC）均接近1，即篩選出的2 個關(guān)鍵基因?qū)^(qū)分CKD 患者與健康對照者具有較高的診斷效能，見圖3B、圖3D。

圖3 機器學(xué)習(xí)篩選核心基因

2.4 中藥預(yù)測結(jié)果

將2 個關(guān)鍵基因定位到Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)P<0.05 為條件篩選治療CKD 的潛在中藥，獲得姜黃、澤瀉、丹參、地黃、五味子等多味中藥，見表1。

表1 關(guān)鍵基因相關(guān)中藥預(yù)測

3 討論

各種慢性進展性腎病的最終表現(xiàn)均為腎纖維化，腎纖維化是導(dǎo)致CKD 發(fā)展到終末期腎臟疾?。╡nd-stage kidney disease，ESRD）的主要病理基礎(chǔ)，而自噬在纖維化相關(guān)的CKD 的進展中起關(guān)鍵作用[7]。因此，探索和發(fā)現(xiàn)自噬參與腎纖維化的潛在機制對于發(fā)現(xiàn)CKD 的潛在治療靶點極為重要。

本研究獲得67 個差異表達的自噬相關(guān)基因，并用于GO 功能和KEGG 通路分析，綜合DEARGs 的富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因主要與巨自噬密切相關(guān)。在應(yīng)激條件下，巨自噬作為一種生存機制發(fā)揮重要作用，主要負責(zé)大分子、細胞膜和細胞器的更新，維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[8]。這一過程通過循環(huán)利用受損和有毒的細胞組分，轉(zhuǎn)化為細胞的構(gòu)建模塊，從而支持細胞抵御應(yīng)激反應(yīng)并維持能量平衡[9]。此外，巨噬細胞在調(diào)控炎癥反應(yīng)和纖維化過程中扮演著關(guān)鍵角色[10]。因此，自噬相關(guān)基因可能在腎纖維化的進程中起重要作用。

SVM 模型的進一步構(gòu)建鑒定出2 個自噬關(guān)鍵基因ATF6和GNAI3。ATF6（激活轉(zhuǎn)錄因子6）是一種重要的傳感器，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)時被激活。研究發(fā)現(xiàn)miR-185-5p可通過下調(diào)ATF6改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達并抑制上皮去分化，進而改善腎纖維化[11]。其亞型ATF6α下調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體α 促進脂毒性誘導(dǎo)的腎小管間質(zhì)纖維化[12]。因此ATF6可能成為防治CKD 的有效靶點。GNAI3（G 蛋白亞基αI3）是一種蛋白質(zhì)編碼基因。與GNAI3相關(guān)的疾病包括耳髁綜合征1和耳髁綜合征[13-14]。有研究表明GNAI3可作為胰腺癌預(yù)后的獨立預(yù)測因子和治療非酒精性脂肪性肝病的潛在新靶點，還被鑒定為川崎病和結(jié)腸炎相關(guān)腫瘤的關(guān)鍵調(diào)控基因[15-18]。然而，GNAI3在CKD 中的作用尚未報道，需要對該基因進行進一步研究。同時，本研究繪制數(shù)據(jù)集的ATF6、GNAI3的ROC 曲線結(jié)果顯示，ATF6和GNAI3的ROC AUC 接近1，表明這2 個標(biāo)志物在區(qū)分CKD 患者和非患者方面顯示出高度的診斷效能。但由于樣本量的限制，關(guān)鍵基因的診斷價值可能需要進一步檢驗。

近年來中醫(yī)藥在CKD 防治中受到了更多的關(guān)注，在CKD 的發(fā)展至ESRD 的過程中，中醫(yī)藥在緩解臨床表現(xiàn)、減緩疾病進展速度及延后腎臟替代療法啟動時間等方面展現(xiàn)出顯著的療效優(yōu)勢。本文以自噬關(guān)鍵基因篩選治療CKD 的潛在中藥，得到丹參、澤瀉、地黃、姜黃和五味子等多味中藥。研究發(fā)現(xiàn)姜黃中的姜黃素具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤等作用，并可通過腺苷酸激活蛋白激酶信號通路促進自噬從而減輕大鼠糖尿病腎病的腎臟纖維化[19]。地黃的主要活性成分地黃多糖通過緩解CKD 大鼠冠脈鈣化，抑制冠脈血管平滑肌細胞中TRPC1/6 蛋白的表達并促進自噬[20]。在單側(cè)輸尿管梗阻誘導(dǎo)的大鼠腎臟病理模型中，丹參的主要活性成分丹酚酸B 通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白的表達來發(fā)揮作用。具體而言，丹酚酸B 可通過上調(diào)LC3-Ⅱ和Beclin1 的表達，同時下調(diào)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的表達，從而激活自噬過程，并對抗腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展[21]。另外，澤瀉在此模型中展現(xiàn)出對腎小管上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的顯著抑制作用，減輕腎間質(zhì)纖維化，并觀察到腎小管上皮細胞中C3 蛋白表達的下調(diào)，這表明澤瀉可能通過影響C3 途徑來抑制間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的過程[22]。五味子中的有效成分五味子乙素可能通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白LC3 對缺氧/復(fù)氧腎小管上皮細胞的凋亡有一定的保護作用[23]。木通中的有效成分馬兜鈴酸在低劑量引起的腎損傷過程中可能發(fā)生自噬，且自噬減輕腎臟損傷；馬兜鈴酸高劑量引起的腎損傷過程中可能發(fā)生過度自噬，且自噬加重腎臟損傷，其作用機制可能與調(diào)節(jié)p53 蛋白表達相關(guān)[24]。

總之，本研究通過生物信息學(xué)的方法，為CKD與自噬之間聯(lián)系的進一步研究提供新的見解和潛在靶點。篩選的關(guān)鍵基因及中藥可為后續(xù)深入理解CKD 的分子機制和開發(fā)治療藥物奠定理論基礎(chǔ)。本研究存在一定的不足，如關(guān)鍵基因ATF6、GNAI3的表達水平，可能需要進一步的定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和免疫印跡或免疫組織化學(xué)驗證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。