基于生物信息學(xué)分析銀屑病基因表達(dá)差異及潛在中藥*

劉小琨,張蒼,王翊同

1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100020; 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院皮膚科/北京市趙炳南皮膚病醫(yī)療研究中心,北京 100010

銀屑病是一種免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病,典型皮損表現(xiàn)為鱗屑性紅斑或斑塊,局限或廣泛分布[1]。銀屑病的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,目前臨床普遍認(rèn)為銀屑病是T細(xì)胞和樹突細(xì)胞介導(dǎo)的多基因疾病,以遺傳背景為基礎(chǔ),以外界環(huán)境對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激為誘因,以角質(zhì)細(xì)胞的異常增生和局部炎癥為主要病理表現(xiàn)[2-3],感染、吸煙、寒冷干燥、焦慮、睡眠障礙等均是本病的危險(xiǎn)因素[4-5]。1984—2017年間,我國(guó)的銀屑病發(fā)病率由0.123%上升到0.500%[6-7],且該病具有難治愈、高復(fù)發(fā)、病程長(zhǎng)的特點(diǎn)[8]。銀屑病尚無(wú)治愈方法,目前的治療手段主要包括維A酸類、維生素D3類、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、生物制劑和光療等[9]。上述治療方法雖可有效緩解銀屑病的病情,但長(zhǎng)期使用存在感染風(fēng)險(xiǎn)增加、患惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)升高、引發(fā)代謝性疾病和治療費(fèi)用昂貴等問(wèn)題。在保證安全性的前提下,長(zhǎng)期控制病情、提高患者生活質(zhì)量,是當(dāng)前治療銀屑病的目標(biāo)。預(yù)防和延緩銀屑病的復(fù)發(fā)是長(zhǎng)期改善患者生活質(zhì)量的有效途徑,也是治療的難點(diǎn)。因此,進(jìn)一步探究銀屑病的發(fā)病機(jī)制,開發(fā)新的藥物是有必要的。

銀屑病屬中醫(yī)“白疕”范疇。筆者認(rèn)為,“內(nèi)有蘊(yùn)熱、郁于血分”是銀屑病的基本病機(jī),“從血論治”是銀屑病的基本治則。中醫(yī)辨證施治銀屑病,一般分為“血熱、血瘀、血燥”3種證型論治,對(duì)改善銀屑病的長(zhǎng)期預(yù)后、預(yù)防銀屑病復(fù)發(fā)存在一定優(yōu)勢(shì)[1]。本研究從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus,GEO)獲得原始數(shù)據(jù),通過(guò)生物信息學(xué)方法探索與銀屑病相關(guān)的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs),并對(duì)其中的核心基因進(jìn)行功能和通路的富集分析,探究銀屑病的病理機(jī)制與治療靶點(diǎn),再將核心基因與中藥相互映射,為對(duì)銀屑病治療靶點(diǎn)有潛在干預(yù)作用的中藥提供理論支持,為銀屑病病理機(jī)制和潛在中藥的研究提供思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)提取在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)中心的CEO[10]中檢索與銀屑病相關(guān)的數(shù)據(jù)集,提取GSE161683、GSE193128、GSE137218數(shù)據(jù)集的原始數(shù)據(jù),所有數(shù)據(jù)集中樣本均取自銀屑病患者,其中銀屑病組為受累皮損,對(duì)照組為非受累的正常皮膚,僅保留基線期未進(jìn)行干預(yù)的組織學(xué)樣本進(jìn)行DEGs篩選。各基因芯片的芯片平臺(tái)、樣本例數(shù)、組織類型等詳細(xì)信息見表1。

表1 本研究所提取銀屑病組及對(duì)照組數(shù)據(jù)集的基本信息

1.2 DEGs篩選下載數(shù)據(jù)集與平臺(tái)文件后,用芯片平臺(tái)中的注釋文件對(duì)原始數(shù)據(jù)中的基因探針進(jìn)行注釋,剔除沒有匹配到基因名(Gene symbol)的探針;若多個(gè)不同探針檢測(cè)同一基因,則選取這些探針的均值作為該基因的最終表達(dá)量。應(yīng)用R語(yǔ)言“l(fā)immar”包篩選3個(gè)數(shù)據(jù)集中銀屑病組織和正常組織的DEGs[11-12],以校正后P<0.05,log2FC的絕對(duì)值>1.0篩選DEGs,log2FC為正數(shù)表示基因表達(dá)上調(diào),log2FC為負(fù)數(shù)表示基因表達(dá)下調(diào),應(yīng)用R語(yǔ)言“ggplot2”包制作DEGs的熱圖和火山圖[13]。對(duì)3個(gè)數(shù)據(jù)集的DEGs取交集以增加結(jié)果的穩(wěn)定性,并繪制3個(gè)芯片DEGs的韋恩圖。

1.3 差異基因的功能注釋將DEGs導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)[14](DAVID 6.8,http:://David.ncifcrf.gov)進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能、京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,以校正后的P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GO功能富集分析包含3個(gè)方面:細(xì)胞組分(cell component,CC)、分子功能(molecular function,MF)和生物過(guò)程(biological process,BP)。用R語(yǔ)言“ggplot2”包對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction network,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因篩選應(yīng)用String數(shù)據(jù)庫(kù)[15](https://string-db.org/)構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò),篩選標(biāo)準(zhǔn)為 combined score>0.7,深入了解DEGs所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)在功能上的聯(lián)系,為深入認(rèn)識(shí)疾病的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。將PPI網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0[16],應(yīng)用Cytoscape的CytoHubba插件[17]和MCODE插件[18]篩選核心基因。CytoHubba插件根據(jù)節(jié)點(diǎn)(本研究中為基因)在網(wǎng)絡(luò)中的屬性進(jìn)行排名,根據(jù)Degree值對(duì)基因進(jìn)行排序,Degree值更高的基因更傾向于是關(guān)鍵基因。將Degree值較高的基因應(yīng)用MCODE插件進(jìn)行模塊分析,篩選條件為MCODE score>5,degree cutoff=2,node score cutoff= 0.2,Haircut=true,Fluff=false,Max depth=100,K-score=2。

1.5 靶點(diǎn)對(duì)接及中藥預(yù)測(cè)將篩選出的核心基因映射到Coremine Medical數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.coremine.com/),篩選出與核心基因相關(guān)的中藥,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEGs篩選結(jié)果基于GSE161683、GSE193128、GSE137218數(shù)據(jù)集分別獲得557、3 898、3 200個(gè)DEGs,DEGs分別以火山圖和熱圖展示(見圖1、圖2),3個(gè)數(shù)據(jù)集的共同DEGs有474個(gè),其中包括306個(gè)上調(diào)基因,168個(gè)下調(diào)基因,DEGs韋恩圖見圖3。

圖1 DEGs的聚類熱圖

注:橫坐標(biāo)軸為log2 FC,縱坐標(biāo)軸表示-log10(Padj.)。

圖3 DEGs韋恩圖

2.2 DEGs的GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果GO功能和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),上調(diào)的DEGs主要與角化作用、殺傷其他生物的細(xì)胞、固有免疫應(yīng)答、角質(zhì)形成細(xì)胞分化、對(duì)病毒的防御反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程相關(guān),與角質(zhì)包膜、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外隙、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外泌體等細(xì)胞組分相關(guān),與絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、2′-5′-寡腺苷酸合成酶(OASs)活性、CXCR趨化因子受體結(jié)合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶激活劑活性、趨化因子活性等分子功能相關(guān),富集在白細(xì)胞介素-17(interleukin-17,IL-17)信號(hào)通路、核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide oligomerization domain like receptor,NLR)信號(hào)通路、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、甲型流感等信號(hào)通路,見圖4。

圖4 上調(diào)DEGs的GO功能和KEGG通路富集分析

2.3 PPI的構(gòu)建和關(guān)鍵基因的篩選在String數(shù)據(jù)庫(kù)中導(dǎo)入上調(diào)DEGs構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),選擇combined score>0.7為PPI關(guān)系的閾值,導(dǎo)出相關(guān)TSV格式文件,使用Cytoscape軟件的CytoHubba插件進(jìn)行進(jìn)一步分析。根據(jù)Degree值定義前15個(gè)關(guān)鍵基因:STAT1、RSAD2、IFIT3、IFI44L、IFIT1、CXCL10、MX1、CDK1、IFI44、OASL、OAS1、OAS2、OAS3、CCNA2、CCNB1。15個(gè)關(guān)鍵基因的PPI網(wǎng)絡(luò)見圖5。然后使用Cytoscape軟件的MCODE插件對(duì)15個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行模塊分析,模塊分析后得到一個(gè)重要模塊:STAT1、RSAD2、IFIT3、IFI44L、IFIT1、CXCL10、MX1、IFI44、OASL、OAS1、OAS2、OAS3,見圖6。

2.4 中藥預(yù)測(cè)結(jié)果將上述12個(gè)核心基因映射到Coremine Medical數(shù)據(jù)庫(kù),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,篩選治療銀屑病的潛在中藥,共篩選出中藥56種,這些中藥可能為治療銀屑病藥物的潛在來(lái)源,見表2。

表2 關(guān)鍵基因的中藥預(yù)測(cè)結(jié)果

3 討論

銀屑病是由多種遺傳及環(huán)境因素引起的慢性炎癥性皮膚病。一般認(rèn)為,銀屑病是由IL-17介導(dǎo)的免疫疾病,涉及IL-17、IL-23、TNF-α等細(xì)胞因子[19]。在外界免疫刺激下,樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生 IL-23,從而誘導(dǎo)Th-17等細(xì)胞產(chǎn)生IL-17、IL-22 和IFN-α等促炎細(xì)胞因子,誘導(dǎo)多種炎癥和角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖[20]。長(zhǎng)期定植于外周組織的組織常駐記憶T細(xì)胞產(chǎn)生IL-17并促進(jìn)局部的皮膚炎癥則與銀屑病的頻繁復(fù)發(fā)相關(guān)[20]。

3.1 核心基因的功能與免疫炎癥、角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增生、抗病毒感染相關(guān)遺傳是銀屑病發(fā)病的重要因素,大約40%的銀屑病或銀屑病關(guān)節(jié)炎患者有家族史[21]。全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)確定了60多個(gè)易感基因座,其中許多包含參與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的基因[22]。本研究結(jié)果提示,銀屑病患者的皮損與正常皮膚之間的基因表達(dá)存在顯著差異。富集分析提示,上調(diào)的DEGs主要與免疫炎癥及角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增生相關(guān),還與病毒感染等銀屑病的誘發(fā)因素有關(guān),這與既往的研究結(jié)果一致[23-24]。

STAT1和STAT3是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和免疫反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子,在常見細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的下游被激活,一般認(rèn)為它們之間存在拮抗作用[25]。STAT1和STAT3可通過(guò)JAK/STAT通路調(diào)節(jié)包括IL-17等細(xì)胞因子的表達(dá),介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)。與健康人相比,尋常型銀屑病患者的STAT1、STAT3和IL-17表達(dá)水平較高,而經(jīng)過(guò)烏司奴單抗治療40周后,這些基因的轉(zhuǎn)錄活性降低[26]。

RSAD2、MX1與Ⅰ型干擾素信號(hào)通路介導(dǎo)的固有免疫的抗病毒反應(yīng)相關(guān),IFIT3及IFIT1的抗病毒作用則與NOD樣受體信號(hào)通路相關(guān)[27]。體外實(shí)驗(yàn)顯示,抑制IFIT3可降低角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力和CXCL1、CCL20、IL-1β和IL-6的分泌[28]。Raposo等[29]發(fā)現(xiàn),這些抗病毒基因在銀屑病皮損局部表達(dá)上調(diào)。這可以解釋為什么銀屑病患者皮損合并感染的風(fēng)險(xiǎn)顯著小于特應(yīng)性皮炎患者。一方面,病毒感染、外傷等免疫刺激誘發(fā)銀屑病;另一方面,銀屑病皮損局部的抗病毒免疫增強(qiáng)。這一有趣的現(xiàn)象強(qiáng)調(diào)了在銀屑病發(fā)病過(guò)程中免疫系統(tǒng)的主導(dǎo)作用。目前,這些抗病毒基因在銀屑病皮損形成過(guò)程中起到的具體作用尚不明確,有待于進(jìn)一步研究。

CXCL10是一種趨化因子,在銀屑病中可介導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞向真皮乳頭的遷移、募集中性粒細(xì)胞和Th1細(xì)胞放大炎癥反應(yīng),角質(zhì)細(xì)胞形成CXCL10依賴于STAT1。銀屑病患者血清中的CXCL10水平升高,CXCL10可作為監(jiān)測(cè)銀屑病活動(dòng)的血清學(xué)標(biāo)志物[24,30]。

OASs是一組具有多種抗病毒活性的IFN誘導(dǎo)酶家族,包括OAS1、OAS2、OAS3和OASL。在銀屑病中,OAS1、OAS2和OAS3可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和增強(qiáng)IFN-1誘導(dǎo)的JAK信號(hào)通路促進(jìn)表皮角質(zhì)細(xì)胞增殖[31]。

3.2 預(yù)測(cè)中藥是治療銀屑病的潛在藥物本研究篩選的可干預(yù)銀屑病的潛在中藥大致可分為5類:清熱藥(黃芩、水牛角、大青葉等)、理血藥(當(dāng)歸、赤芍、牡丹皮等)、滋陰藥(何首烏、生地黃、墨旱蓮、鱉甲膠等)、燥濕藥(天南星、半夏等)和溫陽(yáng)藥(淫羊藿、鹿茸等)。

既往研究提示,清熱涼血類中藥可通過(guò)降低血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和抑制表皮細(xì)胞過(guò)度增殖等改善銀屑病皮損[32-33]。黃芩苷可以通過(guò)抑制STAT1磷酸化起到抗炎作用[34],并可抑制新生血管生成[35]。芍藥總苷可通過(guò)抑制STAT1和STAT3磷酸化以抑制Th17的分化與角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖,減輕動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被誘導(dǎo)的銀屑病炎癥反應(yīng)[36]。由生地黃、何首烏、白芍等養(yǎng)血滋陰藥組成的當(dāng)歸飲子,可降低銀屑病患者外周血中IFN-γ、IL-17A的表達(dá)水平,改善銀屑病皮損[37]。淫羊藿苷可使基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1蛋白表達(dá)下調(diào),可能通過(guò)此機(jī)制起到抑制銀屑病新生血管生成的作用[38]。

中醫(yī)治療銀屑病多從血論治,有血熱、血瘀、血燥等證型。一般認(rèn)為,尋常型銀屑病的進(jìn)行期以血熱證為主,靜止期及消退期則以血虛及血瘀為主。在銀屑病進(jìn)行期,患者的皮損色鮮紅、不斷擴(kuò)大,全身癥狀見舌紅苔黃、脈弦滑數(shù)、心煩燥熱、便秘溲赤等,此時(shí)當(dāng)用苦寒截?cái)嗖∏?扭轉(zhuǎn)病勢(shì)。在疾病發(fā)展過(guò)程中,血熱證是證型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。熱邪擾動(dòng)血分,毒熱煎熬陰血,氣血運(yùn)行不暢而成血瘀,耗傷陰血?jiǎng)t成血虛,生風(fēng)化燥而為血燥等證型變化[39]。因此,目前關(guān)于中藥干預(yù)銀屑病的分子機(jī)制研究更多集中于清熱涼血藥物。

熱為無(wú)形之邪,濕為有形之邪。銀屑病具有皮損肥厚的特點(diǎn),因頑濕聚集,則形成斑塊浸潤(rùn)。濕邪所致皮膚病的病程多呈發(fā)作期與緩解期交替的過(guò)程,病程漫長(zhǎng),反復(fù)不愈[40]。這與銀屑病慢性易復(fù)發(fā)的病程特征相符合。銀屑病患者常合并濕邪內(nèi)蘊(yùn),此時(shí)則需燥濕藥物祛除病理產(chǎn)物。濕邪在銀屑病反復(fù)不愈的過(guò)程中起到重要作用,是證型轉(zhuǎn)化的另一關(guān)鍵因素。濕性黏滯,濕熱伴生導(dǎo)致熱邪內(nèi)伏,疾病纏綿不愈或反復(fù)發(fā)作;濕邪阻滯津液輸布代謝,濕邪日久作為病理因素導(dǎo)致陰虛的生成。

銀屑病患者皮損多表現(xiàn)為冬重夏輕,日光浴作為輔助療法有助于銀屑病緩解,這提示在“熱、瘀、濕”等實(shí)邪之外,患者尚有陽(yáng)虛的一面[41]。衛(wèi)陽(yáng)虧虛則皮損多由外感誘發(fā);冬季腠理閉塞,陽(yáng)氣難以外達(dá),則皮損加重;夏季或日光浴促使腠理疏通,陽(yáng)氣外達(dá),則皮損易愈。既往研究顯示,陽(yáng)虛外寒證占尋常型銀屑病27%左右[42]。多種因素可導(dǎo)致銀屑病患者成為陽(yáng)虛證:一方面為素體陽(yáng)氣虧虛;另一方面,長(zhǎng)期應(yīng)用清熱涼血藥物、久病陰損及陽(yáng)、不適當(dāng)應(yīng)用激素及免疫抑制劑導(dǎo)致元?dú)馓摀p。對(duì)于陽(yáng)虛型銀屑病患者而論,陽(yáng)虛為本虛,血熱為標(biāo)實(shí),其病情復(fù)雜,為本虛標(biāo)實(shí)之證。其“火”為“虛火”“伏火”,平素陽(yáng)氣相對(duì)充實(shí),則伏火潛藏不發(fā)病;若因種種誘因傷及陽(yáng)氣,陽(yáng)虛則伏火不能潛藏,虛陽(yáng)浮越而發(fā)為熱毒,表現(xiàn)為肌膚腠理的“血熱”。此時(shí)若僅清熱涼血?jiǎng)t更傷陽(yáng)氣,因此需補(bǔ)益脾腎陽(yáng)氣,元陽(yáng)充盛則虛火不生,衛(wèi)陽(yáng)充盛則可御外邪、腠理調(diào)和。

本研究的結(jié)果與臨床治療銀屑病的方向大致相同,養(yǎng)陰清熱與溫陽(yáng)看似相反的治療方向,卻是對(duì)于不同病機(jī)患者的最恰當(dāng)治療方式,突出中醫(yī)“辨證論治”的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。生物信息學(xué)分析的結(jié)果也提示,“清熱類”與“溫陽(yáng)類”等藥物通過(guò)不同靶點(diǎn)均能對(duì)銀屑病皮損起到有效干預(yù)的可能,為中醫(yī)藥辨證治療銀屑病提供了理論依據(jù)。另外,本研究結(jié)果中部分藥物在臨床上并不常用或較少應(yīng)用于銀屑病的治療,為開發(fā)銀屑病新藥提供參考。目前,關(guān)于中藥治療銀屑病的機(jī)制研究主要集中在清熱解毒、涼血活血類藥物方面,對(duì)于燥濕化痰和溫陽(yáng)補(bǔ)腎類藥物治療銀屑病的分子機(jī)制尚須更多研究證實(shí)。

本研究提示,銀屑病患者皮損中上調(diào)的DEGs主要參與免疫炎癥、角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增生、抗病毒感染等生物學(xué)過(guò)程,涉及IL-17、NOD樣受體、病毒感染等信號(hào)通路,其中的關(guān)鍵基因在銀屑病皮損的形成過(guò)程中起到核心作用,預(yù)測(cè)的中藥為治療銀屑病的潛在藥物,為后續(xù)銀屑病分子機(jī)制及其藥物的研究提供了潛在靶標(biāo),未來(lái)尚需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相關(guān)中藥及其活性成分的作用,進(jìn)一步探索銀屑病的潛在治療靶點(diǎn)。