中藥炮制輔料煉蜜制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

劉小鳴,曹文文,王瑞生,3,張振凌,3

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450008; 2.河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州 450046;3.河南省中藥特色炮制技術(shù)工程研究中心,河南 鄭州 450008

蜂蜜又稱“巖蜜”“石飴”,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》:“石蜜……主心腹邪氣,諸驚癇庢,安五臟,諸不足,益氣補(bǔ)中,止痛解毒,除眾病,和百藥。久服,強(qiáng)志輕身,不饑不老[1]?！薄吨腥A人民共和國藥典》記載:蜂蜜,甘,平。歸肺、脾、大腸經(jīng)。補(bǔ)中,潤燥,止痛,解毒。外用生肌斂瘡,外治瘡瘍不斂、水火燙傷;用于脘腹虛痛、肺燥干咳、腸燥便秘,解烏頭類藥毒[2]。蜂蜜作為輔料與藥物共制時需煉制,即煉蜜,其與藥物具有協(xié)同作用,發(fā)揮增強(qiáng)藥物療效、解毒、緩和藥物性能、矯味矯臭等作用[3-5]。陶弘景《本草經(jīng)集注》云:“凡蜜,皆先上火煎,掠去其沫,令色微黃,則丸經(jīng)久不壞,掠之多少,隨蜜精粗[6]?！崩顣r珍《本草綱目》曰:“凡煉沙蜜,每斤入水四兩,銀石器內(nèi),以桑柴火慢煉,掠去浮沫,至滴水成珠不散,乃用,謂之水火煉法?！币虼?煉蜜的方法為:銀石器加約四分之一水,掠去雜質(zhì),煉制至“色微黃”或“滴水成珠”。古代煉蜜多采用敞口容器直火加熱的方式,煉蜜質(zhì)量常依據(jù)操作者的經(jīng)驗判斷?，F(xiàn)代煉蜜采用夾層蒸汽鍋,能夠控制煉制溫度和時間,確保煉蜜受熱均勻。

文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn),常有學(xué)者將炮制輔料煉蜜與中藥制劑煉蜜混淆。傳統(tǒng)制劑煉蜜根據(jù)水分、密度和煉制溫度,分為“嫩蜜”“中蜜”和“老蜜”,但炮制輔料煉蜜沒有明確區(qū)分。目前,各省市炮制輔料煉蜜的炮制工藝差異較大,有以滴水成珠為度者,有以用棒挑起綿綿不斷為度者,有以用手捻之拉黃絲為度者,有以煉至紅黃色小金泡為度者[7-8]。正如《江西省中藥飲片炮制規(guī)范》(2023年版)的煉蜜炮制方法為:取原藥材,加熱,趁熱過濾,去雜質(zhì)及泡沫,置鍋內(nèi)熬至起“米篩花”泡狀,呈黃棕色,能“滴水成珠”為度[9]?！栋不帐≈兴庯嬈谥埔?guī)范》(2019年版)的煉蜜炮制方法為:取凈蜂蜜,置鍋內(nèi),文火熬煉至黃棕色,滴水成珠[10]?！逗幽鲜≈兴庯嬈谥埔?guī)范》(2022年版)的煉蜜炮制方法為:取凈蜂蜜置適宜容器內(nèi),用文火熬煉,濾去沫,煉至“搭絲”,取出,放涼。取濾過的蜂蜜加3%～5%水,蜜溫90～96 ℃煉制8～10 min[11]。因此,本研究基于既往文獻(xiàn),設(shè)計正交試驗,旨在優(yōu)化炮制輔料煉蜜的制備工藝,并為煉蜜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑生蜂蜜(河南省許昌市鄢陵縣某蜂廠,批號:20200107),質(zhì)量符合《中華人民共和國藥典》(2020年版)質(zhì)量要求;D-葡萄糖、果糖、D-無水葡萄糖(成都普思生物科技股份有限公司,純度>96%,批號:PS010303、PS160708-11、PS160816-08);碘(成都市科隆化學(xué)品有限公司,批號:20180922);碘化鉀(青島金海碘化有限公司,批號:20200520);乙酸銨、可溶性淀粉(天津市登科化學(xué)試劑有限公司,批號:20180406、20180512);酚酞(西安化學(xué)試劑廠,批號:20180720);氫氧化鈉(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司,批號:20191105);甲醇、乙醇(分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司,批號:20210408、20210316);磷酸(色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,批號:20151025);甲醇、乙腈(色譜純,安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?批號:20201018、20201116);濃硫酸、濃鹽酸、濃氨水(煙臺市雙雙化工有限公司,批號:20160608、20151018、20150526);苯酚(上海麥克林生物科技有限公司,批號:20161115);溴代萘(上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司,批號:20201025)。

1.2 儀器UV-3200S型紫外可見分光光度計(上海美譜達(dá)儀器有限公司);Waters 1525-2489高效液相色譜儀(美國Waters公司);UM5000蒸發(fā)光散射檢測器(上海通微分析技術(shù)有限公司);Prevail Carbohyrate ES色譜柱(美國Alltech公司);HH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司);LX3611箱式高溫電阻爐(天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司);BT25S型十萬分之一天平、BSA224S-CW型萬分之一天平(賽多利斯科技儀器有限公司);KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);DTC-22B型真空泵(日本愛發(fā)科株式會社);UPT-Ⅱ-10T型優(yōu)普系列超純水器(成都超純科技有限公司);BT1000L型蠕動泵(保定雷弗流體科技有限公司);BM-2W型阿貝折射儀(上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司);Agilent 1260 Infinity Ⅱ Prime液相色譜儀、InfinityLab Poroshell 120 ES-C18色譜柱(德國Agilent公司,3.0 mm×150.0 mm,2.7 μL);DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);1174B搖擺式四兩裝高速中藥粉碎機(jī)(瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)。

2 方法

2.1 煉蜜制備工藝研究查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),不同地市中藥飲片炮制規(guī)范中炮制輔料煉蜜的煉制工藝有較大差異,煉制溫度有70～90 ℃,也有110 ℃以上。通過前期的預(yù)實驗,以保持微沸至出現(xiàn)淡黃色“魚眼泡”為標(biāo)準(zhǔn),采用單因素考察,優(yōu)選加熱溫度為 80 ℃,加熱時間為8 min,每100 g生蜂蜜加水5 g。在單因素考察結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計正交試驗,優(yōu)選最佳煉蜜制備工藝。

2.1.1 正交試驗設(shè)計將加熱溫度、加熱時間、加水量作為考察因素,采用L9(34)設(shè)計正交試驗,A代表加熱溫度,設(shè)置為70 ℃、80 ℃、90 ℃;B代表加熱時間,設(shè)置為6 min、8 min、10 min;C代表每100 g蜂蜜的加水質(zhì)量,設(shè)置為3 g、5 g、8 g;制備9批煉蜜樣品,實驗設(shè)計見表1、表2。

表1 正交因素水平表

表2 正交試驗表

2.1.2 水分含量測定方法取9批煉蜜樣品1～2滴,分別滴于棱鏡上,棱鏡預(yù)先連接阿貝折光計與恒溫水浴鍋,水浴溫度為(40.0±0.1)℃;用標(biāo)準(zhǔn)物品校正折光計的折光指數(shù),并根據(jù)折光指數(shù)計算樣品中的水分含量[12-15]。

水分含量={100-[78+390.7(n-1.476 8)]}×100%(n為折光指數(shù))。

2.1.3 總糖含量測定方法

2.1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作準(zhǔn)確稱取D-無水葡萄糖6.00 mg于150 mL容量瓶中,加蒸餾水溶解后定容,制成標(biāo)準(zhǔn)溶液;分別抽取0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,均以蒸餾水補(bǔ)足至2.0 mL,制成標(biāo)準(zhǔn)稀釋液,并按順序編號;分別加入6%苯酚溶液1.0 mL、濃硫酸5.0 mL,搖勻,冷卻,制成標(biāo)準(zhǔn)待測液;常溫放置30 min,用紫外分光光度計在490 nm波長下測定標(biāo)準(zhǔn)待測液的吸光度。以2.0 mL蒸餾水作為標(biāo)準(zhǔn)稀釋液的對照,經(jīng)過相同的顯色操作后作為空白組。以標(biāo)準(zhǔn)稀釋液濃度為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)待測液吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.3.2 總糖含量測定精密稱量煉蜜樣品0.1 g于100 mL容量瓶中,加蒸餾水溶解后定容,制成樣品液;取樣品液0.2 mL,加蒸餾水4.8 mL,制成樣品稀釋液;取樣品稀釋液2.0 mL,加入6%苯酚溶液1.0 mL、濃硫酸5 mL,搖勻,冷卻,制成樣品待測液;常溫放置30 min,用紫外分光光度計在490 nm波長下測定樣品待測液的吸光度[16];以蒸餾水同法顯色為空白對照,代入回歸方程后計算總糖含量。

2.1.4 最佳煉蜜制備工藝篩選以9批煉蜜樣品中的水分含量、總糖含量為檢測指標(biāo),分別賦予權(quán)重0.3、0.7,計算水分含量隸屬度、總糖含量隸屬度以及綜合評分,綜合評分?jǐn)?shù)值最大者即為最佳制備工藝[17-19]。

水分含量隸屬度=(最大值-變量值)/(最大值-最小值);

總糖含量隸屬度=(變量值-最小值)/(最大值-最小值);

綜合評分=水分含量權(quán)重×水分含量隸屬度+總糖含量權(quán)重×總糖含量隸屬度。

2.2 煉蜜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

2.2.1 樣品制備根據(jù)“2.1.4”實驗結(jié)果優(yōu)選最佳煉蜜制備工藝,制備10批煉蜜樣品,依次編號為 Y1-Y10。

2.2.2 性狀鑒別參照各省市中藥飲片炮制規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn),運用感官(眼看、鼻嗅、口嘗、手摸等)對10批煉蜜樣品的形狀、顏色、質(zhì)地、氣味、滋味等逐一鑒別,從而總結(jié)煉蜜樣品的性狀特征。

2.2.3 酸度、成分、密度測定方法

2.2.3.1 酸度測定取煉蜜樣品10 g,加入新沸過的冷水50 mL,混勻,加酚酞指示液2滴與氫氧化鈉滴定液(0.1 mol·L-1)4 mL,觀察樣品的顏色變化[20]。

2.2.3.2 淀粉、糊精測定取煉蜜樣品2 g,加水10 mL,加熱煮沸,冷卻,加碘溶液1滴,觀察樣品的顏色變化[21]。

2.2.3.3 水分含量測定同“2.1.2”項方法。

2.2.3.4 灰分含量測定取大小適宜的瓷坩堝置馬弗爐中,在550 ℃下灼燒30 min,冷卻至200 ℃以下后取出,放入干燥器中冷卻至室溫,準(zhǔn)確稱量,并重復(fù)灼燒至恒量。用坩堝稱量約3.000 0 g蜂蜜后,將坩堝放入馬弗爐中,小火加熱,使蜂蜜充分炭化至無煙。然后在550 ℃下灼燒4 h,冷卻至200 ℃以下,取出,放入干燥器中冷卻30 min,準(zhǔn)確稱量;重復(fù)灼燒2次,根據(jù)第3次灼燒后質(zhì)量計算灰分含量[22-24]。

灰分含量=m(總灰分)/m(樣品)×100%,其中m(總灰分)=m(灰化后)-m(恒重坩堝)

2.2.3.5 相對密度測定取潔凈、干燥并精密稱定質(zhì)量的比重瓶,裝滿煉蜜樣品(溫度低于20 ℃)后,插入中心有毛細(xì)孔的瓶塞,用濾紙除去從塞孔溢出的液體;置20 ℃恒溫水浴中,隨時用濾紙將瓶塞頂端擦干;待液體不再由塞孔溢出,迅即將比重瓶自水浴中取出,用濾紙將比重瓶外面擦凈并精密稱定,減去比重瓶的質(zhì)量即為樣品質(zhì)量;將樣品傾去,洗凈比重瓶,裝滿新沸過的冷水,再照上法測得同一溫度時水的質(zhì)量。

相對密度=樣品質(zhì)量/水的質(zhì)量[25]

2.2.4 果糖、D-葡萄糖含量測定方法

2.2.4.1 色譜條件以Prevail Carbohyrate ES(250.0 mm × 4.6 mm,5 μm)為色譜柱;流動相:乙腈-水(7030);流速:1 mL·min-1;柱溫:40 ℃;檢測波長:254 nm。UM5000蒸發(fā)光檢測器,載氣:氮氣;流速:2 mL·min-1;漂移管溫度:90 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。理論塔板數(shù)按果糖峰計算應(yīng)不低于 2 000。

2.2.4.2 供試品溶液制備精密稱取煉蜜樣品0.3 g,蒸餾水稀釋,轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶,加水定容,過濾,取濾液,即得供試品溶液。

2.2.4.3 對照品溶液制備精密稱取果糖 21.76 mg、D-葡萄糖27.81 mg,分別加雙蒸水溶解,轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶,定容,過濾,取濾液,即得果糖對照品溶液和D-葡萄糖對照品溶液[26]。

2.2.4.4 方法學(xué)考察

2.2.4.4.1 線性關(guān)系考察取果糖對照品溶液 8 μL、10 μL、12 μL、14 μL、16 μL,取D-葡萄糖對照品溶液4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL,分別注入液相色譜儀,測量對照品溶液質(zhì)量和峰面積值。以對照品溶液質(zhì)量為橫坐標(biāo),峰面積值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算線性回歸方程。

2.2.4.4.2 精密度實驗取果糖對照品溶液、D-葡萄糖對照品溶液,分別進(jìn)樣10 μL,重復(fù)進(jìn)樣6次,測定峰面積并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。

2.2.4.4.3 穩(wěn)定性實驗選取Y1號煉蜜樣品,按照“2.2.4.2”項方法制備供試品溶液,分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h進(jìn)樣,測定果糖、D-葡萄糖的峰面積并計算RSD。

2.2.4.4.4 重復(fù)性實驗選取Y1號煉蜜樣品6份,按照“2.2.4.2”項方法制備供試品溶液,測定果糖、D-葡萄糖的峰面積并計算RSD。

2.2.4.4.5 加樣回收實驗取煉蜜樣品6份,每份約0.1 g,分別精密加入1 mL果糖對照品溶液(42.15 g·L-1)、1 mL D-葡萄糖對照品溶液(32.50 g·L-1),按照“2.2.4.2”項方法進(jìn)行操作,然后測量果糖、D-葡萄糖含量,并計算加樣回收率RSD。

2.2.4.5 果糖、D-葡萄糖含量測定按照“2.2.4.2”項方法制備Y1-Y10煉蜜樣品供試品溶液,進(jìn)樣10 μL,測量峰面積,代入線性回歸方程,計算果糖和D-葡萄糖含量。

3 結(jié)果

3.1 煉蜜制備工藝

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程是y=0.019 7x-0.031 7,R2=0.999 6;總糖濃度在8～36 mg·L-1范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好,見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.1.2 最佳煉蜜制備工藝正交試驗結(jié)果表明,最佳煉蜜制備工藝組合為:A3B3C2,即加熱溫度為90 ℃,加熱時間為10 min,每100 g生蜂蜜加水5 g,見表3。

表3 正交試驗結(jié)果

3.2 煉蜜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

3.2.1 性狀鑒別結(jié)果煉蜜樣品為半透明、帶光澤、濃稠的液體,呈淺黃色,無結(jié)晶;氣芳香,味極甜。

3.2.2 酸度、成分、密度測定結(jié)果

3.2.2.1 酸度煉蜜樣品均呈粉紅色且10 s內(nèi)不褪去,說明樣品保存較好,沒有發(fā)酵變酸。

3.2.2.2 淀粉、糊精煉蜜樣品均不顯藍(lán)色、綠色或紅褐色,說明樣品中沒有摻入淀粉或糊精。

3.2.2.3 水分、灰分、相對密度煉蜜水分含量為16.217 6%～17.819 5%,灰分含量為0.052 3%～0.087 0%,相對密度為1.463 6～1.466 0。根據(jù)測定結(jié)果,建議煉蜜水分含量不得過24%,灰分不得過0.2%,相對密度不低于1.349,見表4。

表4 水分含量、灰分含量、相對密度測定結(jié)果

3.2.3 果糖和D-葡萄糖含量測定結(jié)果

3.2.3.1 方法學(xué)考察

3.2.3.1.1 線性關(guān)系考察果糖對照品的線性回歸方程是y=208 299.023 4x-1643 097.400 00,R2=0.999 3,果糖對照品在34.816～69.630 μg質(zhì)量范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好,見表5、圖2;D-葡萄糖對照品的線性回歸方程是y=231 659.268 2x-2 141 443.200 0,R2=0.999 4,D-葡萄糖對照品在22.248～66.744 μg質(zhì)量范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好,見表6、圖3。

圖2 果糖線性回歸圖

圖3 D-葡萄糖線性回歸圖

表5 果糖線性關(guān)系考察結(jié)果

表6 D-葡萄糖線性關(guān)系考察結(jié)果

3.2.3.1.2 精密度實驗果糖對照品、D-葡萄糖對照品的峰面積RSD分別為1.3%、1.9%,表明儀器精密度良好。

3.2.3.1.3 穩(wěn)定性實驗Y1煉蜜樣品在不同時間果糖、D-葡萄糖的峰面積RSD分別為2.5%、3.0%,表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.3.1.4 重復(fù)性實驗6份Y1煉蜜樣品中果糖、D-葡萄糖的峰面積RSD分別為1.1%、0.8%,表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.3.1.5 加樣回收實驗煉蜜樣品中果糖的平均加樣回收率為98.97%,RSD為1.8%;D-葡萄糖的平均加樣回收率為97.27%,RSD為1.8%,表明加樣回收率良好,該方法準(zhǔn)確可靠。

3.2.3.2 果糖、D-葡萄糖含量煉蜜樣品中果糖和D-葡萄糖含量總和為74.187 9%～75.578 5%,平均值為74.945 3%;果糖含量/D-葡萄糖含量比值為1.26～1.31,平均比值為1.29。因此,建議煉蜜的果糖、D-葡萄糖含量總和不少于60%,果糖含量/D-葡萄糖含量比值不小于1,見表7。

表7 果糖、D-葡萄糖含量測定結(jié)果

4 討論

研究發(fā)現(xiàn),蜂蜜主要由果糖、葡萄糖、蔗糖和水分等組成。其中,果糖和葡萄糖約占其總量的 65%～80%,蔗糖含量約占5%。此外,蜂蜜中含有多種酶類、維生素、氨基酸和有機(jī)酸等。常見的蜂蜜品種包括槐花蜜、棗花蜜、椴樹蜜、荊條蜜以及油菜蜜等。顧雪竹等[27]指出蜂蜜具有潤腸、護(hù)肝、護(hù)心、抗菌、抗炎等作用,同時列舉蜂蜜在腸道、肝臟、心臟、神經(jīng)系統(tǒng)、外傷感染等方面的應(yīng)用。蔣多亮等[28]總結(jié)蜂蜜在創(chuàng)傷、小兒痱子、口腔潰瘍、消化性潰瘍、便秘、肛腸疾病、咳嗽、干燥性鼻炎、靜脈炎、角膜炎、角膜潰瘍等疾病中的應(yīng)用,顯示出蜂蜜具有廣泛的藥理作用。

蜂蜜不僅單獨作為藥用成分,也是中藥炮制中不可或缺的輔料。在中藥制備過程中,蜂蜜經(jīng)常與其他藥物共制,以實現(xiàn)協(xié)同增效的目的。例如,經(jīng)過蜜炙的麻黃、白前、款冬花、紫菀、百部、旋覆花、枇杷葉等中藥,其潤肺止咳功效顯著提升,故有“蜜炙甘緩而潤肺”之說。蜂蜜作為中藥炮制輔料,在使用前必須經(jīng)過嚴(yán)格的煉制過程。《中華人民共和國藥典》(2020版)規(guī)定,制作蜜炙中藥飲片時須用煉蜜,并且應(yīng)在加入適量水稀釋后使用,但藥典并未規(guī)定煉蜜的具體方法、煉制程度及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?；诖?本研究優(yōu)化炮制輔料煉蜜的制備工藝,鑒別其性狀,檢查其酸度、淀粉和糊精情況,測定其水分、灰分含量和相對密度,采用高效液相色譜法測定果糖、D-葡萄糖含量,從而為煉蜜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供依據(jù)。