高通量測(cè)序聯(lián)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探索復(fù)方澤漆顆粒治療銀屑病的作用機(jī)制*

董同同,王久香,吳敏,劉濤峰

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué),安徽 合肥 230031; 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,安徽 合肥 230031

銀屑病(psoriasis,Ps)是一種易復(fù)發(fā)的皮膚病,又稱(chēng)“牛皮癬”,以紅斑鱗屑為臨床特征,其發(fā)病機(jī)制與環(huán)境、遺傳及免疫細(xì)胞等多種因素相關(guān)[1]。此外,精神刺激、氣候變化、吸煙飲酒、不良飲食習(xí)慣等也是本病的誘發(fā)或加重因素[2]。Ps的全球發(fā)病率約為0.09%～5.10%[3],中國(guó)發(fā)病率約為0.47%[4]。西醫(yī)治療Ps主要采用甲氨蝶呤、環(huán)孢素、激素類(lèi)藥物、生物制劑等,這些療法均具有一定療效,但不能根治Ps。相比之下,中藥復(fù)方可以整體調(diào)節(jié),針對(duì)多個(gè)生物過(guò)程或靶點(diǎn)發(fā)揮作用,逐漸成為臨床治療Ps的關(guān)注點(diǎn)。

復(fù)方澤漆顆粒(皖藥制字BZ20080004號(hào))在臨床上應(yīng)用多年,療效顯著,且無(wú)明顯副作用。前期研究發(fā)現(xiàn),復(fù)方澤漆顆粒能夠改善Ps患者臨床癥狀、降低銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(psoriasis area and severity index,PASI)評(píng)分、降低血清白細(xì)胞介素-17(interleukin-17,IL-17)水平[5-8],但其具體作用機(jī)制尚不清楚。因此,本研究基于人體皮膚組織高通量測(cè)序結(jié)果,采用復(fù)方澤漆顆粒對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的Ps小鼠模型進(jìn)行干預(yù),觀察小鼠皮損組織c-Fos、c-Jun表達(dá)情況和表皮層病理學(xué)變化,探索復(fù)方澤漆顆?？筆s的潛在分子機(jī)制。

1 材料

1.1 臨床資料健康組:安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科就診的非Ps患者;Ps組:2020年2月至2021年12月在安徽省中醫(yī)院皮膚科就診的Ps患者(n=10)。臨床試驗(yàn)獲安徽中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),倫理審批號(hào):2021AH-50。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c小鼠60只,體質(zhì)量18～22 g,由杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供,許可證號(hào):SCXK(浙)2019-0004。動(dòng)物飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房,溫度20～26 ℃,相對(duì)濕度30%～50%,通風(fēng)良好。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),倫理審批號(hào):2023023。

1.3 藥物與試劑復(fù)方澤漆顆粒[6](由澤漆、白花蛇舌草、大青葉、板藍(lán)根、雞血藤、土茯苓、半枝蓮、貫眾、龍膽草、黃芩、莪術(shù)、五味子組成,安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑部提供,批號(hào):20220305);GAPDH抗體、山羊抗兔IgG HRP、山羊抗小鼠IgG HRP(Proteintech公司,貨號(hào):60004-1-1、SA00001-1、SA00001-2);c-Fos抗體、c-Jun抗體(成都正能生物,貨號(hào):340249、R23335);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海新貝生物,貨號(hào):R202-02);RNA提取試劑盒(上海奕杉生物,貨號(hào):RN001);濃縮型正常山羊血清、熒光標(biāo)記山羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司,貨號(hào):AR1009、BA1032);DAPI(碧云天,貨號(hào):C1002)。

1.4 儀器二維電泳系統(tǒng)(天能公司,型號(hào):VE-180);化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(耶拿公司,型號(hào):CheStudio515);全光譜波段酶標(biāo)儀(上海賽默飛公司,型號(hào):SkyHigh);熒光定量PCR儀(美國(guó)羅氏公司,型號(hào):LightCycler 480Ⅱ);倒置熒光顯微鏡(Olympus 公司,型號(hào):CK40-F200);低速離心機(jī)(可成公司,型號(hào):L4-5K);高速冷凍離心機(jī)(Kendro公司,型號(hào):D3752)。

2 方法

2.1 臨床皮膚組織制備健康組:取患者的正常皮膚組織;Ps組:治療前,切取患者的皮損組織。采用復(fù)方澤漆顆粒治療,溫開(kāi)水沖服,飯后30 min服用,每次1袋(10 g),每日3次。經(jīng)臨床評(píng)估皮損癥狀好轉(zhuǎn)后,留取患者的皮膚組織。

2.2 Ps小鼠模型制備實(shí)驗(yàn)前一天刮掉小鼠背部毛發(fā),面積約2 cm×3 cm。在小鼠剃毛部位涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg,連續(xù)7 d,每天1次。造模第7天,小鼠背部出現(xiàn)紅斑、鱗屑,提示Ps模型建立成功。

2.3 小鼠分組與給藥將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、復(fù)方澤漆顆粒組、甲氨蝶呤組,每組15只。除空白組外,其余各組采用“2.2”項(xiàng)方法進(jìn)行造模。造模首日開(kāi)始灌胃,劑量按人與小鼠體表面積換算,復(fù)方澤漆顆粒、甲氨蝶呤的灌胃劑量為 1 mg·kg-1,空白組與模型組給予等劑量生理鹽水,早晚各1次。

2.4 小鼠皮膚組織制備末次給藥后,1%戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠(60 mg·kg-1),切取小鼠背部皮膚組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)Ps患者皮膚組織差異表達(dá)mRNA健康組和Ps患者治療前后的皮膚組織經(jīng)Trizol裂解后提取總RNA,使用微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度。檢測(cè)合格的RNA樣品經(jīng)過(guò)DNase I消化,使用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA,打斷成為短片段,加入隨機(jī)引物合成cDNA一鏈、二鏈,連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng),進(jìn)而構(gòu)建RNAseq文庫(kù),并使用Illumina二代測(cè)序技術(shù)上機(jī)檢測(cè)。采用DESeq2軟件對(duì)有生物學(xué)重復(fù)的樣本進(jìn)行分析,使用R軟件中的phyper函數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),以|log2FC|≥1、P<0.05篩選差異表達(dá)mRNA。通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)差異表達(dá)mRNA的靶基因,物種設(shè)置為Homo sapiens,參考基因組版本為GCF_000001405.39_GRCh38.p13。借助R軟件中的phyper函數(shù)對(duì)靶基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,以FDR≤0.05篩選KEGG通路。

2.6 Western blot檢測(cè)小鼠皮膚組織c-Fos、c-Jun蛋白表達(dá)水平使用RIPA裂解緩沖液(PIPAPMSF=1001)提取小鼠皮膚組織總蛋白,配制12%分離膠,行凝膠電泳,轉(zhuǎn)移蛋白至0.22 μm PVDF膜(低溫,220 mA,1.5 h),使用5%脫脂牛奶封閉2 h。加入c-Fos抗體(1800)、c-Jun抗體(1800),4 ℃孵育過(guò)夜。使用磷酸鹽緩沖液(PBST)洗膜3次,每次10 min。二抗(15 000)室溫孵育2 h,PBST洗膜3次,每次10 min。ECL化學(xué)發(fā)光液顯影,曝光和拍照。運(yùn)用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.7 qPCR檢測(cè)小鼠皮膚組織c-FosmRNA、c-JunmRNA表達(dá)水平從小鼠皮膚組織提取總RNA,將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取5 μL cDNA作為模板,進(jìn)行PCR反應(yīng),15 μL擴(kuò)增體系1 μL模板cDNA、上下游引物各0.25 μL、7.5 μL SYBR Green混合液、6 μL水;擴(kuò)增條件:95 ℃ 2 min預(yù)變性,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,45個(gè)循環(huán)。以Tubulin作為內(nèi)參基因,以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物,由上海新貝生物科技有限公司合成引物,引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.8 HE染色觀察小鼠皮膚表皮層病理學(xué)變化切取各組小鼠背部皮損區(qū)域皮膚組織或正常皮膚組織,用4%多聚甲醛溶液固定過(guò)夜;組織樣本使用酒精梯度脫水、浸蠟包埋,行組織切片(厚度5 μm);石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟,蘇木精、伊紅染色,光學(xué)顯微鏡下觀察皮膚組織表皮層病理學(xué)改變。

3 結(jié)果

3.1 Ps患者治療前后皮膚組織高通量測(cè)序結(jié)果與治療前比較,Ps患者治療后的皮膚組織中mRNA下調(diào)9 670個(gè),mRNA上調(diào)8 570個(gè),見(jiàn)圖1A。KEGG結(jié)果表明,IL-17信號(hào)通路可能是復(fù)方澤漆顆粒治療銀屑病的關(guān)鍵通路,見(jiàn)圖1B。

注:A:差異表達(dá)mRNA火山圖;B:KEGG通路富集氣泡圖。

3.2 Ps患者治療前后皮膚組織c-FosmRNA、c-JunmRNA水平比較激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)是IL-17的下游基因,其家族蛋白(c-Fos、c-Jun)水平降低可導(dǎo)致Ps的發(fā)生。高通量測(cè)序結(jié)果顯示,與健康組比較,Ps患者皮膚組織c-FosmRNA、c-JunmRNA水平降低(P<0.001);與治療前比較,Ps患者治療后c-FosmRNA、c-JunmRNA水平升高(P<0.05),見(jiàn)圖2。

注:與健康組比較,**P<0.001;與Ps患者治療前比較,# P<0.05。

3.3 各組小鼠皮膚組織c-Fos、c-Jun蛋白表達(dá)水平比較與空白組比較,模型組小鼠皮膚組織 c-Fos、c-Jun表達(dá)水平降低(P<0.001);與模型組比較,復(fù)方澤漆顆粒組、甲氨蝶呤組小鼠皮膚組織c-Fos、c-Jun表達(dá)水平升高(P<0.05),見(jiàn)圖3。

注:與空白組比較,**P<0.001;與模型組比較,# P<0.05。

3.4 各組小鼠皮膚組織c-FosmRNA、c-JunmRNA水平比較與空白組比較,模型組小鼠皮膚組織c-FosmRNA、c-JunmRNA表達(dá)水平下調(diào)(P<0.001);與模型組比較,復(fù)方澤漆顆粒組、甲氨蝶呤組小鼠皮膚組織c-FosmRNA、c-JunmRNA表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05),見(jiàn)圖4。

注:與空白組比較,** P<0.001;與模型組比較,#P<0.05。

3.5 各組小鼠皮膚表皮層病理學(xué)變化比較HE染色結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組小鼠表皮層明顯增厚,伴有表皮角化過(guò)度、表皮突規(guī)則向下延伸、棘層增厚;與模型組比較,復(fù)方澤漆顆粒組、甲氨蝶呤組小鼠表皮層和棘層變薄,表皮角化程度減輕,見(jiàn)圖5。

圖5 各組小鼠皮膚組織HE染色圖片(×400)

4 討論

中醫(yī)學(xué)尚無(wú)Ps病名,依據(jù)其臨床癥狀,將其歸屬于“白疕”范疇。近代皮膚外科專(zhuān)家趙炳南認(rèn)為本病多因素體血熱或郁久化熱,生風(fēng)化燥,日久熱結(jié)血瘀,客于肌膚,因此提出“從血論治”[9]。復(fù)方澤漆顆粒以澤漆、白花蛇舌草、大青葉為君藥,板藍(lán)根涼血清熱,雞血藤養(yǎng)血活血,土茯苓清熱利濕,半枝蓮清熱解毒,黃芩、龍膽草清熱燥濕,貫眾清氣分血,莪術(shù)破血行氣、消血瘀,諸藥合用可有效清除體內(nèi)熱毒,達(dá)到清熱涼血、解毒散瘀的目的[6]。

研究表明,IL-17與角質(zhì)形成細(xì)胞相互作用介導(dǎo)炎癥反應(yīng),從而參與Ps的病理改變。IL-17與IL-17受體或特定的膜結(jié)合蛋白相互作用,誘導(dǎo)下游形成核因子κB激活劑1(nuclear factor kappa B activator 1,ACT1)-腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6,TRAF6)復(fù)合物,導(dǎo)致AP-1家族蛋白水平降低,從而促使Ps發(fā)生[10-11]。AP-1家族是一個(gè)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子家族,由c-Jun、Jun B、Jun D、c-Fos、FosB、Fra-1、Fra-2等構(gòu)成[12],其中c-Fos和c-Jun是主要成員,他們?cè)诓溉閯?dòng)物中形成異源二聚體。研究表明,銀屑病進(jìn)行期皮損組織中c-Fos和c-Jun表達(dá)明顯下降,導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、分化不全及表型異常;在恢復(fù)期c-Fos和c-Jun蛋白表達(dá)升高[13-14]。另外,c-Jun升高可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖[15],c-Fos降低可影響真皮間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力[16]。c-Fos、c-Jun降低在IL-17通路介導(dǎo)的Ps病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述,本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn) IL-17 信號(hào)通路可能是復(fù)方澤漆顆粒治療Ps的關(guān)鍵通路,c-Fos和c-Jun可能是復(fù)方澤漆顆粒治療Ps的關(guān)鍵靶點(diǎn)。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證復(fù)方澤漆顆?？赡芡ㄟ^(guò)上調(diào)皮膚組織c-Fos、c-Jun表達(dá)水平從而治療Ps。