血型CD59基因在胰腺癌中的表達及臨床意義

周仁龍 黃國清 李凌波 唐丹丹

1深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院輸血科，廣東 518110；2吉林省健康管理學會、深圳愛康生物科技股份有限公司；3深圳市南山區(qū)醫(yī)療集團總部，廣東 518055

目前，胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）是導(dǎo)致患者死亡的第三大癌癥[1]，是一種預(yù)后極差、全球發(fā)病率不斷上升的惡性腫瘤[2-5]。手術(shù)干預(yù)是提高患者長期生存率的唯一途徑[6]；標準的放化療并不能明顯延長PAAD患者的壽命，大約80%～85%的PAAD患者出現(xiàn)了無法手術(shù)切除的廣泛轉(zhuǎn)移[7]。此外，PAAD在早期通常沒有明顯癥狀[8-9]，大約需要6個月才能被診斷出來。同一臨床階段的患者可能會出現(xiàn)不同的臨床特征和治療結(jié)果[10]，這表明基于傳統(tǒng)臨床指標的腫瘤預(yù)后并不完全準確。傳統(tǒng)的預(yù)后指標包括TNM分期、病理分級和組織學分級?；颊叩呐R床分期決定了化療和免疫治療策略。因此，為PAAD患者確定新的預(yù)后指標以提高他們的生活質(zhì)量至關(guān)重要。

CD59血型抗原是一種膜表面糖蛋白，2014年，鑒于CD59相關(guān)的基因位點、分子生物學結(jié)構(gòu)、免疫血清學反應(yīng)等已基本確定，國際輸血協(xié)會（international society of blood transfusion，ISBT）將其確認為一個新的血型系統(tǒng)[11]，編號為35號。從20世紀50年代至今，研究發(fā)現(xiàn)血型與癌癥、糖尿病、消化性潰瘍、心腦血管疾病等多種疾病的發(fā)生具有某種聯(lián)系。血型CD59抗原由編碼基因CD59編碼，它是一種高頻抗原，在人群中的分布超過99%?？乖砦晃挥贑D59抗原糖蛋白肽鏈的N末端。

CD59基因與腫瘤的相關(guān)研究已有不少報道[12]，王衛(wèi)東等學者[13]研究發(fā)現(xiàn)，CD59低表達的肺癌患者生存時間更短。孫偉等學者[14]研究發(fā)現(xiàn)CD59在胃癌組織中低表達可能對胃癌的早期診斷具有意義。在泌尿系統(tǒng)腫瘤中，CD59血型抗原的表達較高[15]。在腸道腫瘤[16]、前列腺癌[17]和卵巢癌[18]中CD59也有高表達。研究表明，腫瘤細胞過度表達CD59血型抗原可使其免受攻擊，這被稱為腫瘤細胞逃逸性[15]。這主要是因為CD59血型抗原是補體末端調(diào)節(jié)蛋白，在正常情況下，它可以保護細胞免受攻擊而避免溶血。然而，這也使得腫瘤細胞逃脫了免疫監(jiān)視和靶向作用，從而使抗腫瘤藥物失效。目前，CD59與PAAD的研究報道較少，本研究旨在通過生物信息學研究CD59基因在PAAD中的表達及其臨床意義。

資料與方法

1 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析

GEPIA數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）是一款新開發(fā)的交互式網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，用于使用標準處理管道分析TCGA和GTEx項目中9736個腫瘤和8587個正常樣本的RNA測序表達數(shù)據(jù)[19]。GEPIA提供可定制的功能，如腫瘤、正常差異表達分析、根據(jù)癌癥類型或病理分期進行分析、患者生存分析、相似基因檢測和相關(guān)性分析等。本研究運用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析CD59在PAAD和正常組織中的表達差異。使用log2（TPM+1）作為對數(shù)轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行繪圖。檢索方法：①Box Plot中輸入CD59基因；②腫瘤類型PAAD。

2 HPA數(shù)據(jù)庫分析

HPA數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org/）[20]是基于蛋白組學，轉(zhuǎn)錄組學以及系統(tǒng)生物學數(shù)據(jù)，可以繪制組織、細胞、器官等圖譜。不僅收錄了腫瘤組織，也涵蓋了正常組織的蛋白表達情況。本研究通過HPA數(shù)據(jù)庫分析了CD59在PAAD以及癌旁組織蛋白表達情況。

3 TIMER數(shù)據(jù)庫分析

TIMER數(shù)據(jù)庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer）是利用RNA-Seq表達譜數(shù)據(jù)檢測腫瘤組織中免疫細胞的浸潤情況[21]。TIMER則提供6種免疫細胞（B 細胞， CD4+ T細胞，CD8+ T細胞，中性粒細胞（Neutrphils），巨噬細胞（Macrophages）和樹突狀細胞（Dendritic cells）的浸潤情況。本研究通過TIMER數(shù)據(jù)庫分析了CD59在PAAD中6種免疫細胞相關(guān)性。檢索方法：①基因CD59；②腫瘤類型PAAD；③6種免疫細胞。

4 UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析

UALCAN數(shù)據(jù)庫（https://ualcan.path.uab.edu/index.html）是一個綜合的數(shù)據(jù)庫[22]?；诎┌Y基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）的數(shù)據(jù)，尋找在特定癌癥中高或低表達的基因；分析感興趣的基因、miRNA和lncRNA在癌癥中的表達、對患者生存的影響；探究基因的啟動子甲基化水平以評估基因表達的表觀遺傳調(diào)控；泛癌分析等。基于CPTAC的數(shù)據(jù)，UALCAN為研究者提供了包括總/磷酸蛋白在內(nèi)的臨床蛋白質(zhì)組學聯(lián)合數(shù)據(jù)分析?；贑BTTC的數(shù)據(jù)，還能對兒科腦腫瘤的基因表達和蛋白質(zhì)表達進行分析。本研究主要分析CD59在PAAD中參與信號通路和蛋白表達。給定癌癥類型的樣本中值的標準差。Z值表示給定癌癥類型的樣本中值的標準差。檢索方法：①基因CD59；②選擇癌癥類型為PAAD。探索CD59在PAAD患者中的蛋白表達與正常癌旁組織的表達差異。

5 String數(shù)據(jù)庫分析

String數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org/）是一個可以用來檢索已知蛋白和預(yù)測蛋白之間相互作用的數(shù)據(jù)庫[23]。本研究主要是通過數(shù)據(jù)庫分析CD59與上下游蛋白的關(guān)系，獲得相應(yīng)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。檢索方法：①基因CD59；②物種選擇“homo sapiens”；③相互作用選擇連接數(shù)10。

6 單因素和多因素相關(guān)性分析

從TCGA數(shù)據(jù)集（https://portal.gdc.com）獲得了CD59在PAAD的RNAseq數(shù)據(jù)（level3）和相應(yīng)的臨床信息。單變量和多變量Cox回歸分析并通過“forestplot” 包使用森林圖來顯示每個變量（P值，HR和95%CI）。根據(jù)多變量Cox比例風險分析的結(jié)果，通過與每個風險因素相關(guān)性來計算患者的預(yù)后風險。

7 基因集功能富集分析

對于基因集功能富集分析我們使用R軟件包org.Hs.eg.db （version 3.1.0）中基因的KEGG和GO注釋，以此作為背景，將基因映射到背景集合中，使用R軟件包clusterProfiler （version 3.14.3）進行富集分析，以獲得基因集富集的結(jié)果。設(shè)定最小基因集為5，最大基因集為5 000，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

8 統(tǒng)計學處理

本研究采用t檢驗比較CD59mRNA表達差異，采用Log-rank檢驗比較不同表達水平的生存差異從而得出P值，免疫細胞的浸潤采用Sperman's相關(guān)性檢驗，*表示P＜0.05，以P＜0.05表明結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 CD59在PAAD以及正常組織表達情況

本研究使用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析了CD59血型基因在正常組織和PAAD中的mRNA表達水平，并利用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析了CD59在正常組織和PAAD中的蛋白表達水平。GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，CD59的mRNA在PAAD患者中呈表達顯著升高，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1A）。UALCAN數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，在74例正常組織和137例PAAD中，CD59蛋白在PAAD患者中也顯示出上調(diào)（圖1B）表達差異顯著，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 CD59在PAAD 中的表達

2 CD59在PAAD組織以及正常癌旁組織中蛋白表達水平

本研究使用HPA數(shù)據(jù)庫在線分析了CD59在PAAD和人癌旁胰腺組織中的免疫組織化學染色結(jié)果。結(jié)果顯示，癌組織免疫組化染色較正常組織更深，在正常癌旁中CD59的染色水平較低，而在PAAD中CD59的染色強度較高（見圖2）。這一結(jié)果與GEPIA和UALCAN數(shù)據(jù)庫在PAAD中CD59表達上調(diào)的結(jié)果一致。據(jù)此可以得出結(jié)論，CD59蛋白在PAAD中的表達上調(diào)。

圖2 CD59蛋白在正常癌旁胰腺組織中以及在PAAD中的表達水平

3 CD59在PAAD中與免疫浸潤細胞的相關(guān)性分析

腫瘤和免疫之間的相互作用是醫(yī)學研究的熱點，免疫細胞能夠通過其抗腫瘤免疫力殺死腫瘤細胞。因此，本研究利用TIMER數(shù)據(jù)庫分析了CD59基因表達與PAAD中免疫細胞浸潤的相關(guān)性。在對CD8+T細胞、B細胞、CD4+ T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞，進行腫瘤純度（Purity）校正后，結(jié)果顯示（見圖3和表1），在PAAD中CD8+ T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的浸潤與CD59基因表達呈正相關(guān)（P＜0.05）。

表1 CD59基因表達水平與PAAD免疫細胞浸潤水平的關(guān)系

圖3 CD59基因表達水平與PAAD免疫細胞浸潤水平的關(guān)系

4 CD59在PAAD參與信號通路

本研究利用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析了CD59在PAAD和正常組織中的表達水平與mTOR和Hippo信號通路的相關(guān)性。研究結(jié)果顯示，與正常組織相比，PAAD患者的mTOR和Hippo信號通路存在顯著相關(guān)性（圖4A和B，P＜0.05）。

圖4 CD59在PAAD參與mTOR和Hippo信號通路

5 CD59相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)分析

使用String數(shù)據(jù)庫分析CD59蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)多個蛋白與CD59相互作用（見圖5），包括C9、VTN、CD46、CR1、CD2、CD55、PIGA、CAV1、CFH、C3。CD59是一種細胞表面蛋白，它與多種其他蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，包括調(diào)節(jié)補體系統(tǒng)的蛋白質(zhì)、參與細胞膜信號傳導(dǎo)的蛋白質(zhì)、參與細胞膜糖脂合成的酶等。

圖5 CD59的相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)圖

6 單因素和多因素Cox回歸結(jié)果分析

單變量Cox回歸結(jié)果顯示PAAD患者的發(fā)生和發(fā)展與CD59、分期（pT-stage、pN-stage）、分級（Grade）相關(guān)P＜0.05，而與分期（pM-stage、pTNM-stage）無關(guān)（圖6A，P＞0.05）。多變量Cox回歸分析顯示PAAD患者的發(fā)生和發(fā)展與分期（pN-stage）、分級（Grade）相關(guān)P＜0.05，而與CD59、分期（pT-stage、pM-stage、pTNM-stage）無關(guān)（圖6B，P＞0.05）。這些結(jié)果表明，CD59可能在PAAD的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮一定的作用，但其作用可能還受到其他因素的影響。

圖6 單因素和多因素Cox回歸分析

圖7 CD59表達與PAAD患者生存曲線圖

7 CD59表達與PAAD患者預(yù)后的關(guān)系

本研究運用TCGA數(shù)據(jù)庫中的臨床預(yù)后數(shù)據(jù)分析了PAAD患者CD59表達量與患者生存期之間的相關(guān)性，根據(jù)最佳截斷值將PAAD患者分成高（High）低（Low）兩組。分別對總生存期（overall survival，OS），疾病特異性生存期（disease free survival，DSS），無進展間隔期（progression free interval，PFI ），無疾病間隔期（disease free interval，DFI）進行分析。結(jié)果表明CD59高表達與PAAD患者OS、DSS、PFI、DFI（圖A、B、C和D，P＜0.05）的不良預(yù)后相關(guān)，而低表達患者的預(yù)后好。

8 KEGG和GO富集分析結(jié)果

為了明確CD59基因在KEGG和GO通路中的富集情況，進一步理解基因的生物學功能和調(diào)控機制做了KEGG和GO富集分析，KEGG富集分析結(jié)果顯示，候選基因參與了補體和凝血級聯(lián)、粘著斑、蛋白多糖與腫瘤、金黃色葡萄球菌感染、造血細胞譜系、糖基磷脂酰肌醇錨定生物合成、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、肌動蛋白細胞骨架的調(diào)控、Ecm受體相互作用和上皮細胞的細菌侵襲等，其中占主導(dǎo)地位的是補體和凝血級聯(lián)通路（圖8A）。GO富集分析結(jié)果顯示候選基因參與了蛋白質(zhì)加工的調(diào)控、蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控和急性炎癥反應(yīng)蛋白過程補體激活的調(diào)節(jié)等。其中蛋白質(zhì)加工的調(diào)控信號通路占主導(dǎo)地位（圖B）。

圖8 富集分析KEGG和GO圖

討 論

PAAD是一種高度致命的癌癥，五年生存率約為11%，隨著發(fā)病率的增加，預(yù)計到2030年，它將成為美國癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[24-25]。PAAD治療選擇方式是有限的，只有15%～20%的患者接受前期手術(shù)；其余患者表現(xiàn)為不可切除遠處轉(zhuǎn)移。深入了解PAAD的分子發(fā)病機制，開辟多種治療途徑，如靶向治療、細胞治療和免疫療法，將進一步提高PAAD的生存率[26]。PAAD的診治相對復(fù)雜且異質(zhì)性較高，因此尋找與PAAD預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因?qū)τ谠缙诒O(jiān)測和治療靶點的研究具有重要意義[27]。多項研究發(fā)現(xiàn)血型與癌癥發(fā)生存在一定的關(guān)聯(lián)。黃彬亮等學者[28]報道，ABO血型與不同良惡性疾病的發(fā)生和預(yù)后相關(guān)，例如結(jié)直腸癌[29]、過敏性鼻炎和支氣管哮喘[30]、靜脈血栓栓塞癥[31]胰腺癌[32]、肝癌[33]、胃癌[34]等。血型作為人類的一種穩(wěn)定和非常獨特的遺傳標志[35]，不僅在紅細胞表面表達，而且在許多其他組織中也有表達，腫瘤細胞表面血型抗原的修飾表達可以改變腫瘤細胞的運動性、耐藥性、細胞凋亡和免疫逃逸能力。

紅細胞CD59血型抗原，屬于膜分化抗原，通過生物信息學研究它與胰腺癌之間的相關(guān)性，有望提高對PAAD發(fā)病機制的認識。CD59是一種膜結(jié)合蛋白，可抑制補體膜攻擊復(fù)合物（membrane attack complex，MAC）的形成，從而促進腫瘤細胞免疫逃逸[36]。有研究報道，在前列腺癌癥患者骨轉(zhuǎn)移中CD59的表達水平高于原發(fā)性前列腺癌癥病變，這表明CD59可能在癌癥前列腺骨轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[36]。CD59還可以抑制腫瘤的細胞凋亡和新生血管形成[37-38]。CD59在大多數(shù)腫瘤中過表達，并非常有效地保護腫瘤細胞免受補體攻擊[39]。

本研究基于臨床大樣本數(shù)據(jù)庫分析CD59血型基因在PAAD患者中mRNA和蛋白均高表達，CD59在PAAD中表達水平與CD8+ T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞在PAAD中呈正相關(guān)（P＜0.05），這個結(jié)果表明CD59可能在PAAD的免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。CD59的高表達水平可能與免疫細胞的活化、浸潤以及免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)有關(guān)，有望為進一步探究PAAD的免疫逃逸機制和新的治療策略提供線索。對腫瘤的生存期研究有重要的臨床意義，了解腫瘤患者的生存期可以幫助醫(yī)生評估疾病的預(yù)后，并為制定個體化的治療方案提供依據(jù)。生存曲線結(jié)果顯示與CD59低表達組相比高表達的PAAD患者預(yù)后不良。PI3K/Akt/mTOR信號通路是在癌癥患者中最常見的失調(diào)信號通路之一，在促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療中起著至關(guān)重要的作用[40]。Hippo通路在許多生物過程的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，如細胞增殖和分化、器官生長、胚胎發(fā)生和組織再生/傷口愈合。Hippo通路的失調(diào)可導(dǎo)致多種疾病，包括癌癥、眼部疾病、心臟疾病、肺部疾病、腎臟疾病、肝臟疾病和免疫功能障礙[41]。CD59表達水平在PAAD中參與mTOR和Hippo信號通路影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，mTOR通路是一種受多種細胞信號調(diào)控的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，而Hippo信號通路則參與了多項生物學功能，包括細胞增殖、凋亡、干細胞自我更新等。CD59在PAAD中的表達與這兩個信號通路存在相關(guān)性，并可能對該腫瘤的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生重要的影響。本研究結(jié)果顯示CD59與C9、VTN、CD46、CR1、CD2、CD55、PIGA、CAV1、CFH、C3等蛋白具有相互作用。這些相互作用可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、促進細胞黏附和遷移、影響細胞膜的形成和信號傳導(dǎo)，從而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，CD59參與PAAD的發(fā)生與發(fā)展，其有望作為PAAD的預(yù)測及治療靶點。然而，本研究存在一定局限性，研究所用的臨床數(shù)據(jù)均來自公共數(shù)據(jù)庫，沒有進一步做細胞和組織實驗的驗證，因此CD59在PAAD中的具體作用機制、預(yù)后評估以及治療靶點的價值需要進一步深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突