石墨烯及其衍生物在骨組織工程中的研究進(jìn)展

常新代 孫蘇靜 彭東新 王小慧 張振琳

1燕山大學(xué)亞穩(wěn)材料制備技術(shù)與科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，材料科學(xué)與工程學(xué)院，河北秦皇島 066004；2軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院衛(wèi)生勤務(wù)與血液研究所，北京 100850

1 引言

隨著世界人口老齡化增加，對(duì)骨修復(fù)和再生的需求呈急劇上升趨勢(shì)。創(chuàng)傷、先天性骨畸形和其他疾病引起的骨缺損每年多達(dá)20萬人[1-3]。骨組織具有自然的愈合能力，但較嚴(yán)重的骨缺損需要人工干預(yù)才能愈合。常見的骨修復(fù)方法包括用同種異體或自體骨移植物替換有缺陷的骨來進(jìn)行治療，但這些骨缺損治療會(huì)受到自體骨供應(yīng)不足、同種異體骨移植物的免疫排斥和高昂的醫(yī)療費(fèi)用的限制，因此需要尋找更有效的骨移植替代方案[4]。為了滿足這一醫(yī)療需求，骨組織工程已成為一種很有前途的選擇，而且細(xì)胞、生長(zhǎng)因子和骨工程支架通常認(rèn)為是骨組織工程中的三個(gè)關(guān)鍵因素[5-6]。

間充質(zhì)干細(xì)胞是非造血基質(zhì)多能干細(xì)胞，具有自我更新和分化潛力，可通過分化成不同的組織細(xì)胞修復(fù)組織損傷。作為多能干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞不僅能夠分化成人體多種細(xì)胞[7-9]，還能夠分泌生長(zhǎng)因子，這些生物活性因子能夠在局部形成復(fù)雜的生物活性因子網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)體內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定[10]，為干細(xì)胞發(fā)揮緩解炎癥[11]、免疫調(diào)節(jié)[12]、組織再生[13]等功能提供了適宜的環(huán)境。在眾多的生長(zhǎng)因子之中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）、和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2（fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2）在骨生成過程中扮演了不可或缺的角色[14-15]。具體來說，BMP-2能夠誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的定向分化與增殖，進(jìn)一步促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化與成熟，從而在骨生長(zhǎng)、發(fā)育和再生過程中起到關(guān)鍵作用，加速骨損傷的修復(fù)。而FGF-2作為一種細(xì)胞遺傳促進(jìn)因子，在傷口愈合與組織損傷修復(fù)中都有顯著的作用。目前常見的生物材料如生物活性陶瓷因具有生物相容性、良好的機(jī)械性能、低毒性和易于加工等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于骨組織工程中[16-18]。然而，單純的生物材料存在降解時(shí)間過長(zhǎng)以致無法達(dá)到材料降解速度與骨再生速度相匹配的理想效果。這些性能上的不足極大地限制了生物材料在骨組織工程中的應(yīng)用。為了克服這些不足，最常見的方法是將生物材料與具有互補(bǔ)特性并提供協(xié)同效應(yīng)的材料相結(jié)合，制備為多功能復(fù)合材料。

近年來，納米尺度新材料在這一方面表現(xiàn)出了一些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[19-20]。石墨烯及其衍生物（graphene derivatives，GDs）具有良好的導(dǎo)電性能、大的表面積、高機(jī)械強(qiáng)度和優(yōu)異的生物相容性、獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)，不僅可以為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支撐，還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和遷移。石墨烯及其衍生物主要包括石墨烯（graphene）、氧化石墨烯（graphene oxide，GO）和還原氧化石墨烯（reduced graphene oxide，rGO），它們會(huì)在功能上模擬天然骨骼的特性，在骨組織工程中具備較大潛力。此外，GDs也可以與多種生物醫(yī)學(xué)材料復(fù)合，如聚合物或生物活性陶瓷，從而制備出具有良好生物相容性的復(fù)合材料[21-23]。因此GDs近年來被研究者們廣泛用來調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，有望成為骨組織工程中最有前途的支架材料之一。

在本篇綜述中，首先介紹了GDs作為骨工程支架和藥物載體的體內(nèi)應(yīng)用，還總結(jié)了基于不同動(dòng)物模型的體內(nèi)外研究，以便充分驗(yàn)證GDs的誘骨效應(yīng)。隨后著重總結(jié)了成骨分化相關(guān)信號(hào)通路如Wnt/β-catenin信號(hào)通路，MAPK信號(hào)通路以及BMP信號(hào)通路，并梳理了這些信號(hào)通路各自發(fā)揮的作用及各條通路之間的相互關(guān)系，對(duì)闡明成骨分化調(diào)控機(jī)制具有重要意義。最后列舉了GDs在應(yīng)用于臨床之前存在一些挑戰(zhàn)與建議，以期為其向臨床轉(zhuǎn)化提供科學(xué)數(shù)據(jù)和參考。相信在不久的將來，以GDs為代表的新型二維納米材料可以在骨修復(fù)的治療中大放異彩。

2 石墨烯及其衍生物

石墨烯是由物理學(xué)家安德烈·蓋姆和康斯坦丁·諾沃肖洛夫在2004年利用微機(jī)械剝離法從石墨中分離出來的，它是由碳原子以sp2雜化方式形成六邊形蜂巢狀結(jié)構(gòu)的典型二維納米材料。石墨烯的每個(gè)碳原子都與三個(gè)其他碳原子以共價(jià)鍵相連，而第四個(gè)電子則形成π電子，自由地分布在蜂巢結(jié)構(gòu)之上[24-25]，由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，石墨烯顯示出獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)。例如，優(yōu)異的機(jī)械性能可以提供一個(gè)堅(jiān)固而穩(wěn)定的基底，支撐細(xì)胞的增長(zhǎng)、擴(kuò)散和分化；同時(shí)還能為細(xì)胞提供一個(gè)近似于天然骨骼的微環(huán)境，這有助于間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化和成熟[26]。良好的導(dǎo)電性可以改善相關(guān)生物分子和蛋白質(zhì)之間的電化學(xué)以及電子傳導(dǎo)聯(lián)系，進(jìn)而加速間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和骨形成[27]。此外，大的比表面積還使其成為一個(gè)有效的載荷和控制釋放藥物和生長(zhǎng)因子的平臺(tái)。這種釋放可以與電刺激相結(jié)合，進(jìn)一步增強(qiáng)成骨分化[28]。

如前所述，石墨烯的衍生物包括GO、rGO和由其他官能團(tuán)修飾的功能化石墨烯等[29-30]。其中， GO是通過對(duì)石墨烯進(jìn)行化學(xué)氧化得到的衍生物。在這一過程中，石墨烯的表面引入了多種氧化物官能團(tuán)，如羥基（-OH）、醚鍵（-O-）和羧基（-COOH）。上述官能團(tuán)雖然破壞了石墨烯的原本的π結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其導(dǎo)電性下降。但這些官能團(tuán)也帶來了一些優(yōu)勢(shì)。例如，這些官能團(tuán)促使GO在水中分散均勻，形成穩(wěn)定的膠體溶液。此外還能通過氫鍵、共價(jià)鍵以及靜電作用與蛋白質(zhì)結(jié)合，并能通過結(jié)構(gòu)化功能修飾參與復(fù)合生物材料的構(gòu)建[31-32]。rGO是GO經(jīng)過一系列化學(xué)還原得到的，在此過程中大部分的含氧官能團(tuán)被去除，部分π結(jié)構(gòu)得以恢復(fù)，致使rGO的導(dǎo)電性遠(yuǎn)高于氧化石墨烯，但低于石墨烯。值得注意的是，rGO的表面仍保留一些含氧官能團(tuán)，這些官能團(tuán)賦予rGO與蛋白質(zhì)、細(xì)胞和其他生物分子結(jié)合的能力，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞黏附、擴(kuò)散和分化，使得GDs成為骨組織工程和骨再生醫(yī)學(xué)中的理想候選材料[33-34]。

綜上所述，無論是石墨烯、GO還是rGO首先要具有可功能化修飾的含氧基團(tuán)便于形成復(fù)合型骨工程支架材料。其次要具有出色的機(jī)械性能，這可以為干細(xì)胞成骨分化提供一個(gè)堅(jiān)固和穩(wěn)定的基底，促進(jìn)了間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化。此外還應(yīng)具有良好的導(dǎo)電性，可增強(qiáng)細(xì)胞與其周圍環(huán)境之間的電信號(hào)交流從而影響間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、遷移和分化?？傊鲜鼋Y(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)使得GDs在成骨分化領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，為組織工程和再生醫(yī)學(xué)提供了新的可能性。

3 石墨烯及其衍生物在骨組織工程中的應(yīng)用與研究

3.1 新型復(fù)合支架的增強(qiáng)組分

傳統(tǒng)骨組織工程材料如聚合物和生物活性陶瓷由于機(jī)械性能欠佳，生產(chǎn)成本高，生物活性低等缺點(diǎn)導(dǎo)致應(yīng)用不理想。因此研發(fā)出良好的生物相容性、和機(jī)械強(qiáng)度高和能促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化的新型復(fù)合支架具有重要意義。GDs可以作為很多生物材料的增強(qiáng)組分，例如將rGO與生物陶瓷（例如羥基磷灰石，HA）結(jié)合后可有效提高骨組織工程支架的性能[35]。研究報(bào)道，rGO摻入到多孔的HA以及形狀記憶聚氨酯（shape memory polyurethane，SMPU）/HA/精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸（RGD肽）復(fù)合材料中，通過合成新型納米復(fù)合材料以提高其間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附性，促進(jìn)新組織形成和與周圍骨組織的整合[36-37]。此外，KANG等人[38]還比較了氧化石墨烯薄片/膠原蛋白支架與作為對(duì)照組的膠原蛋白支架的成骨潛力。由于GO有較多含氧官能團(tuán)為其提供了更多的活性位點(diǎn)，與膠原蛋白之間的粘附作用得到增強(qiáng)，進(jìn)一步促進(jìn)了間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、遷移和成骨分化，而將GO加入到聚（L-乳酸-乙醇酸共聚物）（poly（L-lactic-co-glycolic acid），PLGA） /HA納米纖維支架中也觀察到了類似的效果[39]。以上結(jié)論表明石墨烯及其衍生物作為新型骨組織工程復(fù)合支架的潛在價(jià)值，而且還為其在骨修復(fù)和骨組織工程中的應(yīng)用提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3.2 藥物載體

石墨烯基納米材料在被用作新型復(fù)合骨工程支架的同時(shí)還兼具藥物載體的功能。大的比表面積使其具有較強(qiáng)的藥物攜帶能力，同時(shí)還可以通過精巧設(shè)計(jì)讓它對(duì)所裝載的藥物實(shí)現(xiàn)一定的控制釋放。具體來講，石墨烯衍生物的表面的分子結(jié)構(gòu)以及一些修飾基團(tuán)，使其可以通過π-π堆積、氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用等方式搭載藥物或生物分子（如核酸、肽鏈等）[40-41]。例如，KACHOUSANGI等[42]研究者利用一種基于氧化石墨烯的pH敏感納米復(fù)合材料作為藥物載體，評(píng)估其在不同的pH值下對(duì)藥物阿霉素（DOX）負(fù)載量和釋放量。結(jié)果表明該復(fù)合材料在pH=5.5時(shí)的釋放量是pH=7.5時(shí)釋放量的兩倍，而且該復(fù)合材料的載藥率高達(dá)79%，有效改善了DOX釋放量及負(fù)載量。此外，WANG等人[43]還將功能化的GO和絲素蛋白（silk fibroin，SF）底物通過冷凍干燥法制備了 GO/SF復(fù)合支架材料用于負(fù)載大劑量的丹酚酸（salvianolic acid B，SB），在持續(xù)釋放SB的同時(shí)還保持了SB的生物活性，顯著促進(jìn)了大鼠骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，這證實(shí)GDs在作為骨工程支架的同時(shí)又是藥物遞送的良好候選者。此外，體內(nèi)結(jié)果還顯示GO具有促進(jìn)血管再生的功能，而血管化骨組織再生一直以來都是骨組織工程研究領(lǐng)域的難點(diǎn)，提示GO用于實(shí)現(xiàn)血管化骨組織再生具有很大的潛力[43]。

3.3 基于不同動(dòng)物模型的研究

如前所述，石墨烯及其衍生物在細(xì)胞水平表現(xiàn)出其作為骨組織工程材料的應(yīng)用潛力，但距離實(shí)際應(yīng)用于臨床修復(fù)骨缺損仍需大量體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。為了充分說明石墨烯及其衍生物的誘骨效應(yīng)，如下介紹了基于不同動(dòng)物模型的關(guān)于石墨烯及其衍生物在骨組織工程方面的應(yīng)用研究。

大鼠和小鼠是骨修復(fù)研究中成熟的動(dòng)物模型，經(jīng)常被用來證實(shí)石墨烯及其衍生物的誘骨效應(yīng)。最近，Zhou等人將GO和 聚（3-羥基丁酸-co-4-羥基丁酸酯）（Poly（3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate），P34HB）通過靜電紡絲技術(shù)制備了P34HB/GO納米纖維支架，并采用復(fù)合支架修復(fù)大鼠顱骨骨缺損模型，觀察發(fā)現(xiàn)骨缺損處有較多膠原基質(zhì)的沉積，表明P34HB/GO支架在體內(nèi)快速骨再生方面的潛力，揭示了石墨烯納米纖維支架有望用于骨缺損再生修復(fù)[44]。此外，DANESHMAND等人[45]還利用3D打印技術(shù)制備了磷酸鈣石墨烯支架作為可吸收的骨誘導(dǎo)基質(zhì)。體外結(jié)果表明它們具有細(xì)胞相容性，可誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，并且成骨基因堿性磷酸酶（ALP）和Ⅰ型膠原骨橋基因（COL1A1）的表達(dá)水平升高。該研究是通過建立小鼠非愈合顱骨缺損模型來驗(yàn)證支架材料的誘骨效應(yīng)，組織學(xué)顯示支架周圍有抗酒石酸酸性磷酸酶 （TRAP）染色表明可能存在破骨細(xì)胞，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述支架可作為骨誘導(dǎo)基質(zhì)支持體內(nèi)骨形成。SU，YAN等人[46-47]將石墨烯和聚醚醚酮（PEEK）通過熔融共混法分別制備了石墨烯/PEEK和碳纖維增強(qiáng)聚醚醚酮（CFR-PEEK）復(fù)合材料，體外實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)石墨烯修飾的PEEK顯著改善了細(xì)胞的粘附性和增殖性，具有良好的生物相容性；將該復(fù)合材料植入到兔關(guān)節(jié)外移植骨受損部位，術(shù)后4周和12周進(jìn)行CT分析和組織學(xué)評(píng)估，結(jié)果表明，經(jīng)石墨烯改性的植入物的微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)明顯優(yōu)于對(duì)照組，平均礦物附著率更高，植入物周圍形成了更多的新骨。上述動(dòng)物模型中獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步說明GDs在骨組織工程領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用前景。

4 石墨烯及其衍生物誘導(dǎo)成骨的信號(hào)通路總結(jié)

在骨組織工程中，成骨分化相關(guān)的信號(hào)通路具有較復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，而且彼此相互聯(lián)系，相互影響，從而組成了一個(gè)更復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同參與干細(xì)胞分化及骨形成的調(diào)節(jié)[48]。下面將詳細(xì)介紹石墨烯及其衍生物（含復(fù)合材料）促進(jìn)成骨分化相關(guān)的三類信號(hào)通路，即Wnt/β-catenin信號(hào)通路，MAPK信號(hào)通路以及BMP信號(hào)通路如圖1。

圖1 成骨分化信號(hào)通路示意圖

4.1 Wnt/β-catenin信號(hào)通路

經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路主要參與調(diào)控多種生物學(xué)過程并調(diào)節(jié)骨發(fā)育和骨重塑的過程。Wnt/β-catenin信號(hào)通路主要通過抑制復(fù)合體（包括Axin，APC，GSK3β等蛋白）并穩(wěn)定β-catenin蛋白使其進(jìn)入細(xì)胞核并調(diào)控成骨相關(guān)基因如ALP、COL1A1、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）和骨鈣素（Osteocalcin，OCN）的表達(dá)，從而參與間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的過程[49-52]。

YANG，XU等人[53-54]分別評(píng)估了低濃度的氧化石墨烯量子點(diǎn)（graphene oxide quantum dots，GOQDs）對(duì)骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stromal cells ，BMSCs）和人類脫落乳牙牙髓干細(xì)胞（stem cells from human exfoliated decid-uous teeth，SHED）的增殖和分化的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度GOQDs可誘導(dǎo)鈣結(jié)節(jié)形成、ALP活性增加以及 OCN、Runx2、COL1A1和β-catenin 的基因和蛋白水平上調(diào)，表明低濃度的GOQDs通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路顯著促進(jìn)了BMSCs和SHEDs的增殖和分化。此外，研究者們還合成了其他類型的石墨烯衍生物如香草酸甲酯（MV）/rGO復(fù)合物、原始氧化石墨烯納米片和磁性氧化石墨烯（MGO）等，并通過堿性磷酸酶測(cè)定（ALP）、茜素紅S染色（ARS）、免疫熒光染色和相關(guān)成骨標(biāo)志物的基因表達(dá)證明上述石墨烯衍生物或者復(fù)合材料也通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化[55-57]。

4.2 MAPK信號(hào)通路

MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）信號(hào)通路是一系列功能性的蛋白酶，這其中包括ERK1/2（外源性絲裂原活化蛋白激酶）、JNK（c-Jun N-端激酶）以及p38 MAPK。ERK1/2作為MAPK家族的先驅(qū)成員，主要參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化過程。相較之下，JNKs和p38 MAPK則更多地參與細(xì)胞應(yīng)激、炎癥以及程序性細(xì)胞死亡的響應(yīng)。在成骨分化的過程中，MAPK信號(hào)通路發(fā)揮著核心的調(diào)控功能[58]。

研究指出，石墨烯納米片（GNS）與碳納米管（CNTs）能夠激活ERK/MAPK通路，從而增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的礦化，提高ALP的表達(dá)，并加強(qiáng)成骨基因Runx2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[59-60]。另外，光交聯(lián)的絲膠甲基丙烯酰（SerMA）與GO構(gòu)成的水凝膠（SMH/GO）同樣可以通過激活ERK/MAPK信號(hào)通路以及與之相關(guān)的趨化因子信號(hào)傳導(dǎo)來調(diào)控大鼠骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移和成骨分化，從而實(shí)現(xiàn)骨組織再生[61]。

石墨烯納米材料還可能通過激活JNKs信號(hào)通路誘導(dǎo)成骨。具體來講， Forkhead boxO1 （FoxO1）一種轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)成骨分化和骨形成中起著至關(guān)重要的作用，F(xiàn)oxO1可以直接與JNK相互作用，通過控制FoxO1的核定位來誘導(dǎo)成骨。據(jù)研究報(bào)導(dǎo)，低劑量的GO納米片對(duì)FoxO1的活化是通過對(duì)FoxO1去磷酸化和核易位的方式來實(shí)現(xiàn)的，而FoxO1的激活過程依賴于JNK的活性。這證實(shí)了低劑量的氧化石墨烯納米片在促進(jìn)成骨分化的過程是通過JNK及其下游的FoxO1信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的，如圖2所示[62]。

圖2 成骨分化信號(hào)通路示意圖

石墨烯衍生物對(duì)p38 MAPK信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)Runx2的磷酸化進(jìn)而提高成骨相關(guān)基因的表達(dá)。通過對(duì)石墨烯與單壁碳納米管（G/SWCNT）復(fù)合材料與大鼠來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（rMSCs）的相互作用進(jìn)行研究，YAN等人[63]觀察到， G/SWCNT處理后的rMSCs顯示出更強(qiáng)的細(xì)胞活力，成骨相關(guān)基因Runx2和ALP的表達(dá)也相應(yīng)上調(diào)。作者們進(jìn)一步證實(shí)，G/SWCNT能夠通過激活p38 MAPK信號(hào)通路來調(diào)控rMSCs的成骨分化。另外，將鍶（Sr）-GO納米復(fù)合材料摻入到生物相容性良好的膠原蛋白（COLI）支架形成Sr-GO-COLI增強(qiáng)型骨工程支架，結(jié)果表示，該支架能夠同時(shí)激活MAPK/ERK和MAPK/p38信號(hào)通路并促進(jìn)下游轉(zhuǎn)錄因子Runx2的磷酸化從而誘導(dǎo)人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（hADSCs）成骨分化，表明GO復(fù)合材料有望成為增強(qiáng)骨工程支架組分的首要選擇[64]。

4.3 BMP信號(hào)通路

BMP（骨形態(tài)發(fā)生蛋白）信號(hào)通路在成骨分化中同樣發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。BMPs作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β） 超家族的一員存在于細(xì)胞外，屬于分泌型蛋白，可以在血清中檢測(cè)到。細(xì)胞外的BMPs與細(xì)胞膜上的BMP受體（BMPR-I和BMPR-II）結(jié)合后導(dǎo)致受體激酶的激活，活化的受體會(huì)磷酸化細(xì)胞內(nèi)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad1/5/8，其與Smad4形成復(fù)合物后進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合到DNA序列上，從而調(diào)節(jié)BMP靶基因的轉(zhuǎn)錄[65]。

首先，石墨烯及其衍生物由于其表面的特殊性質(zhì)可以為BMPs的粘附提供平臺(tái)，具體來說，其富集效應(yīng)使細(xì)胞周圍形成一個(gè)富含BMPs的微環(huán)境，增強(qiáng)了BMPs與其細(xì)胞表面受體的相互作用，從而激活BMP信號(hào)通路[66]。其次，這種粘附作用不僅促進(jìn)了BMP與受體的結(jié)合，還有助于Smad1/5/8蛋白的活化?；罨笤摰鞍讜?huì)與Smad4結(jié)合形成復(fù)合體，進(jìn)而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控與成骨分化相關(guān)的基因表達(dá)。例如，LI等[67]制備了基于GO的納米片用于增強(qiáng)hMSC的成骨能力，通過觀察，使用BMP信號(hào)通路抑制劑LDN-193189后會(huì)抑制納米片的骨誘導(dǎo)作用，表明GO功能化納米復(fù)合材料是通過增強(qiáng)BMP-Smad1/5/信號(hào)通路促進(jìn)hMSC成骨。此外，GDs還能夠激發(fā)細(xì)胞自身更多地產(chǎn)生和釋放BMPs，從而進(jìn)一步強(qiáng)化BMP信號(hào)通路。例如，GO-羧甲基殼聚糖（CMC）水凝膠-BMP-2[68]、GO/SF/BMP-2電紡支架[69]以及三維石墨烯泡沫（GF）/BMP-2（GF/BMP-2）[70]等復(fù)合支架不僅證實(shí)可以極大提升BMP-2的釋放量，還能促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖，為優(yōu)化骨工程支架提供了可行策略。

實(shí)際上，在骨組織的形成與再生過程中，三大信號(hào)通路起到了關(guān)鍵作用：BMP、Wnt/β-catenin和MAPK。這些通路之間不僅各自獨(dú)立發(fā)揮作用，還相互交織與協(xié)作。例如作者制備了聚多巴胺（PDA）/GO復(fù)合材料用來評(píng)估多能干細(xì)胞的成骨性能。與對(duì)照組相比，在PDA/GO底物上培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞（ESCs）表達(dá)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體I型和II型明顯更高。而且觀察到（ERK）1/2、p38和JNK的MAPKs的磷酸化[71]。此外，與對(duì)照組相比，PDA/GO上的細(xì)胞通過SMAD1/5/8磷酸化進(jìn)行的BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有所增加。細(xì)胞中SMAD1/5/8的核轉(zhuǎn)位也隨PDA/GO基質(zhì)的變化而變化。阻斷MAPK或SMAD信號(hào)通路的激活可抑制PDA/GO誘導(dǎo)的成骨分化。這些結(jié)果表明，PDA/GO復(fù)合物可通過MAPK和BMP/Smad信號(hào)通路刺激ESCs的成骨分化[71]。為了更直觀地展示GDs如何通過上述信號(hào)促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨，將它們的主要特點(diǎn)和功能總結(jié)在表1中。

表1 石墨烯及其衍生物介導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化相關(guān)的信號(hào)通路

5 總結(jié)與展望

本文綜述了近年來GDs在骨再生和修復(fù)方面的進(jìn)展，包括它作為新型復(fù)合骨工程支架的增強(qiáng)組分和藥物載體的應(yīng)用、基于不同動(dòng)物模型的應(yīng)用研究以及成骨分化相關(guān)信號(hào)通路等。具體來講，GDs具有良好的機(jī)械性能和導(dǎo)電性能，可通過功能化修飾制備出新型復(fù)合支架，這為骨修復(fù)領(lǐng)域發(fā)展新型材料提供了新的方向。

然而，GDs新材料在應(yīng)用于臨床之前，仍存在一些挑戰(zhàn)，包括以下幾個(gè)方面。首先，雖然研究者篩選了不同層數(shù)（單層/多層）、劑量和不同功能化改性的GDs對(duì)誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨效應(yīng)的優(yōu)劣，但考慮到骨工程支架材料的多孔結(jié)構(gòu)會(huì)影響間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附生長(zhǎng)情況，因此筆者認(rèn)為也需要關(guān)注比表面積，孔隙率等其他性能參數(shù)。而且，因該類材料在誘導(dǎo)成骨分化的同時(shí)還可能對(duì)生物體兼具一定的免疫調(diào)節(jié)功能，因此其片徑大小，微觀形貌等理化性質(zhì)對(duì)于骨工程支架的篩選應(yīng)用考量也十分必要。其次，GDs的導(dǎo)電性質(zhì)對(duì)于誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化也相當(dāng)重要，一類是利用GDs本身優(yōu)異的導(dǎo)電性摻雜到基質(zhì)中并在外部電極刺激下促進(jìn)骨組織再生，其中它也可被用作電極。另一類是將GDs與其他材料復(fù)合制備出導(dǎo)電性質(zhì)優(yōu)良的新2D/3D復(fù)合材料來促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化。在未來的研究中，開發(fā)更多基于GDs的功能復(fù)合材料，將磁刺激、光刺激等各種外部刺激轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨效應(yīng)可能是重要的發(fā)展方向。

綜上所述，GDs具有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的特性，但要廣泛應(yīng)用于骨組織工程，仍需要大量的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以確保安全性和有效性。期待在不久的將來，以GDs為代表的新型二維納米材料可以在骨骼疾病的治療中大放異彩。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突