硅芯片納米微流體技術(shù)與磁激活細(xì)胞分選法對胎兒有核紅細(xì)胞富集效果的比較

楊曉樨 趙營營 馬吉芳 于政

1遼陽市中心醫(yī)院檢驗科，遼寧遼陽 111000；2陸軍第79集團(tuán)軍醫(yī)院檢驗科，遼寧盤錦 111000

近年來，隨著“三孩”政策的實(shí)施，高齡孕婦數(shù)量不斷增加，加上環(huán)境污染、飲食、生活習(xí)慣等因素的影響，新生兒出生缺陷的種類逐漸增多，且發(fā)生率不斷上升，給家庭及社會帶來了巨大的負(fù)擔(dān)[1-2]。因此，對具有高危因素的胎兒進(jìn)行產(chǎn)前篩查，及時發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重致殘、致死性疾病，適時終止妊娠對確保孕婦及胎兒安全，降低新生兒出生缺陷發(fā)生風(fēng)險，減輕家庭及社會負(fù)擔(dān)具有重要意義。傳統(tǒng)有創(chuàng)產(chǎn)前診斷可通過羊水、臍帶血穿刺、絨毛活檢等侵入性方法獲取胎兒遺傳物質(zhì)進(jìn)行遺傳分析，雖有較高的準(zhǔn)確度，但這些手段均會對孕婦與胎兒產(chǎn)生一定損傷，增加感染、胎兒流產(chǎn)、早產(chǎn)等不良事件發(fā)生風(fēng)險[3-5]。在此背景下，無創(chuàng)產(chǎn)前診斷逐漸成為國內(nèi)外各研究團(tuán)隊的研究熱點(diǎn)。胎兒有核紅細(xì)胞（fetal nucleated red blood cells，F(xiàn)NRBC）被認(rèn)為是用于無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的最佳胎源性細(xì)胞，含有胎兒全部的基因組，可自孕婦孕早期至分娩前持續(xù)穩(wěn)定地存在于母體外周血中，且生命周期較短，不易受既往妊娠的影響，能較好地診斷出胎兒患病及缺陷情況，且不會對母體及胎兒產(chǎn)生創(chuàng)傷，具有較高安全性[6-7]。另外，與目前廣泛應(yīng)用的胎兒游離DNA檢測相比，F(xiàn)NRBC適用于所有循環(huán)DNA可診斷的疾病、基因組序列突變導(dǎo)致的遺傳疾病及線粒體相關(guān)的遺傳性疾病，且不易受母體遺傳背景的干擾及限制性胎盤嵌合體的影響，可診斷的疾病范圍更廣，且可提高產(chǎn)前診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性，具有廣闊的應(yīng)用前景。但母體外周血中的FNRBC數(shù)量極少，必須對其進(jìn)行良好的分離富集，獲得足夠數(shù)量的FNRBC才能用于無創(chuàng)產(chǎn)前診斷[8]。目前，F(xiàn)NRBC富集方法較多，包括硅芯片納米微流體技術(shù)、磁激活細(xì)胞分選法等，但臨床對于FNRBC的最佳富集手段尚無確切定論。因此，本研究分析硅芯片納米微流體技術(shù)與磁激活細(xì)胞分選法對FNRBC的富集效果，為臨床優(yōu)化FNRBC富集方案提供參考。

材料與方法

1 研究對象

選取2020年1月—2022年12月擬于醫(yī)院進(jìn)行產(chǎn)前篩查的112例孕婦為研究對象，年齡20～45歲，平均（35.29±4.12）歲；孕周12～22周，平均（16.52±2.29）周；孕次1～6次，平均（3.13±1.48）次；產(chǎn)次0～2次，平均（1.19±0.73）次。納入標(biāo)準(zhǔn)：①單胎妊娠，均于本院建檔；②具有高齡或超聲軟指標(biāo)2個及以上異常、既往存在不良孕產(chǎn)史等胎兒染色體異常危險因素或妊娠期高血壓、胎兒宮內(nèi)生長受限等可能引起胎盤源性疾病危險因素；③孕周＜23周，且胎母輸血量＜0.5 mL；④孕婦及家屬均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有惡性腫瘤；②近3個月內(nèi)存在輸血史或免疫治療史；③入組前已進(jìn)行過無創(chuàng)產(chǎn)前檢查或羊水穿刺；④伴有白血病、嚴(yán)重缺鐵性貧血等血液系統(tǒng)疾病。本研究符合《赫爾辛基醫(yī)學(xué)研究宣言》中相關(guān)內(nèi)容，并通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)（倫審批號：2019041）。

2 實(shí)驗材料及儀器

納米硅芯片（蘇州汶顥微流控技術(shù)股份有限公司）、一次性采血針（山東朱氏藥業(yè)集團(tuán)有限公司）、抗凝管（烏魯木齊福新醫(yī)療器械有限公司）、恒溫箱（山東博科科學(xué)儀器有限公司）、培養(yǎng)基（杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司）、離心機(jī)（西安銘朗醫(yī)療設(shè)備有限公司）、磁激活細(xì)胞分選器（德國美天旎生物技術(shù)有限公司）、CD71陽性免疫磁珠（德國美天旎生物技術(shù)有限公司）。

3 樣本采集

所有孕婦采血前脈搏、體溫等均在正常范圍內(nèi)。孕婦取坐位，選擇上肢合適靜脈位置作為穿刺點(diǎn)，對穿刺點(diǎn)進(jìn)行常規(guī)皮膚消毒后，通過一次性采血針進(jìn)行穿刺，分別采集外周肘靜脈血10 mL于抗凝管中；采血完畢后輕輕上下顛倒采血管5～10次，確保血液與抗凝劑充分混勻后置于4 ℃冰箱保存，并在4 h內(nèi)送至實(shí)驗室，分別通過硅芯片納米微流體技術(shù)與磁激活細(xì)胞分選法對FNRBC進(jìn)行富集。采血過程中相關(guān)人員均全程進(jìn)行無菌操作。

4 FNRBC富集

4.1 硅芯片納米微流體技術(shù)

取備用抗凝血3 mL放置于離心管中，將與CD71抗體偶聯(lián)的多功能磁性上轉(zhuǎn)換納米材料懸浮液（200 μg/mL）置于其中，放置于37℃的恒溫箱中進(jìn)行血液中FNRBC的第一階段的捕獲，捕獲時間1 h，此時納米材料會捕獲到FNRBC及殘存的非FNRBC，離心（離心時間5 min，離心速率800 r/min）去除未結(jié)合的納米復(fù)合材料，并將所得細(xì)胞沉淀重新分散于2 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）中，將此細(xì)胞懸液裝載于注射泵中，以恒定流速（1 mL/h）通過納米硅芯片，并同時在芯片底部加上恒定磁場（3 800高斯），使FNRBC被牢牢捕獲于腔室底部。再將捕獲到的FNRBC通過洗脫的方法自納米硅芯片上脫離下來，置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，而后將培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）細(xì)胞懸液移入FNRBC培養(yǎng)皿中，并將培養(yǎng)皿放置于含有5%二氧化碳的37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行免疫黏附2 h，取出培養(yǎng)皿上下緩慢搖勻，室溫下進(jìn)行離心（離心時間5 min，離心速率800 r/min），去除上清液后收集細(xì)胞沉淀，并加入1 mL的DMEM細(xì)胞液重新懸浮細(xì)胞沉淀，輕輕吹打混勻后備用。

4.2 磁激活細(xì)胞分選法

①密度梯度離心：取孕婦備用抗凝血3 mL，用1×PBS進(jìn)行1∶1稀釋，輕輕吹打混勻后待用；準(zhǔn)備1個新的15 mL離心管，取密度梯度離心液，用巴氏滴管在新的離心管中加入3 mL密度梯度離心液，將稀釋后的6 mL血液標(biāo)本緩慢置于密度梯度離心液上方（注意操作過程中血液標(biāo)本與離心液應(yīng)有明顯界限，盡可能避免血液標(biāo)本與密度梯度離心液混勻重疊），將離心管置于離心機(jī)內(nèi)，于22℃溫度下進(jìn)行離心（離心時間30 min，離心速率1 500 r/min）操作。離心結(jié)束后，離心液與血液自上而下分別為紅細(xì)胞與粒細(xì)胞混合層，密度梯度離心液、單個核細(xì)胞層及血漿層等，用巴氏滴管小心吸出單個核細(xì)胞層及其上下各約10 mm高度離心液置于新的15 mL離心管中；于離心管中加入PBS/0.1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液至離心管口，旋緊離心管蓋，輕輕顛倒混勻后進(jìn)行2次洗滌離心（離心時間5 min，離心速率1 500 r/min），收集離心后的細(xì)胞沉淀置于新的離心管中；于細(xì)胞沉淀中加入PBS/0.1% BSA溶液共5 mL重新懸浮細(xì)胞，輕輕吹打混勻備用。②磁激活細(xì)胞分選：于備用的懸浮細(xì)胞中加入40 μL CD71陽性免疫磁珠，混勻后于4 ℃溫度下避光孵育15～30 min。組裝mini-磁激活細(xì)胞分選系統(tǒng)，以500 μL的PBS/0.1% BSA溶液潤洗磁激活細(xì)胞分選系統(tǒng)篩選柱，待留空后，將篩選的細(xì)胞上柱，并在篩選柱中加入1 μL的PBS/0.1% BSA溶液，拿離磁場，沖洗入試管內(nèi)，標(biāo)記為陽性細(xì)胞。PBS/0.1% BSA溶液對細(xì)胞沉淀洗滌離心（離心時間5 min，離心速率1 500 r/min）2次后收集細(xì)胞沉淀（即為富集的FNRBC），并加入1 mL PBS/0.1% BSA溶液重新懸浮細(xì)胞沉淀，輕輕吹打混勻備用。

5 質(zhì)量控制

所有研究人員均經(jīng)過專業(yè)化培訓(xùn)，熟練掌握硅芯片納米微流體技術(shù)、磁激活細(xì)胞分選法的原理、具體操作方法等內(nèi)容，并在考核合格后參與到研究工作中。且FNRBC的分離與富集均符合《全血與成分血質(zhì)量要求》[9]的要求，制備過程均在實(shí)驗室無菌操作間實(shí)施，并嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作規(guī)范（如操作人員進(jìn)入實(shí)驗室應(yīng)穿戴無菌服、鞋套、帽子、口罩、手套，并進(jìn)行全身消毒，不隨意進(jìn)出實(shí)驗室、避免操作臺上放置與試驗無關(guān)的物品、FNRBC富集操作開始前使用紫外線燈照射無菌操作臺30～60 min滅菌等）。以上處理的血樣均2 000 r/min離心20 min，分別小心吸取白膜狀的單個核細(xì)胞層以及下層，共16個樣本，收集入不同離心管內(nèi)，分別加入氯化銨溶血溶液至10 mL，與細(xì)胞懸液混合，使紅細(xì)胞溶解，用吸管將混合細(xì)胞溶液吹打2 min，然后靜置10 min，1 000 r/min離心l0 min。傾去上清液，用PBS液重復(fù)洗滌1次，800 r/min離心8 min。溶紅細(xì)胞后的細(xì)胞沉淀均用l mL PBS液混懸，移入離心管中，計數(shù)收集細(xì)胞量(流式分析需106個細(xì)胞)后800 r/min離心5 min，獲得所需的細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀用200 mL PBS液混懸，加入FITC標(biāo)記的抗CD7l抗體3 mL和用PE標(biāo)記的抗GPA抗體3 mL，避光37℃孵育30 min，1 mL PBS液洗滌細(xì)胞兩次。采用FAc.Sort型流式細(xì)胞儀(BD公司)檢測，每份標(biāo)本分析檢測5 000～l0 000個細(xì)胞。先以未加抗體的裸細(xì)胞調(diào)零，設(shè)定電壓，再行待測標(biāo)本測試。

6 評價指標(biāo)

6.1 形態(tài)學(xué)觀察

觀察兩種方法所獲得的富集FNRBC染色情況。分別將富集前的備用血液樣本及兩種方法富集所獲得的細(xì)胞懸液各100 μL滴于載玻片上，自然干燥1 h后用80%乙醇固定、水洗、室溫晾干，然后放置于37℃的酸性緩沖液中保溫10 min，再次水洗、室溫晾干；使用蘇木素染液中染白細(xì)胞，45 s后用流水沖洗2 min，再用伊紅染液中染1 min，流水沖洗3 min，晾干后置于顯微鏡下觀察富集前及不同方法富集后FNRBC形態(tài)。

6.2 細(xì)胞計數(shù)

比較兩種FNRBC富集方法所獲得的總細(xì)胞量、FNRBC量及FNRBC比例。具體操作方法為：將兩種方法富集所獲得的晾干后的細(xì)胞懸液載玻片放置于顯微鏡下觀察，計數(shù)總細(xì)胞量及FNRBC量。FNRBC比例為染色后計數(shù)2 000個總的細(xì)胞中所含的陽性FNRBC細(xì)胞數(shù)。

6.3 FNRBC富集時間

記錄兩組FNRBC富集所需時間。

6.4 無菌試驗結(jié)果

取兩種方法所獲得的細(xì)胞懸液各10 μL，采用全自動細(xì)菌培養(yǎng)儀進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，記錄兩組細(xì)菌培養(yǎng)陽性發(fā)生情況。

7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS25.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料均經(jīng)Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布以表示，組間比較用配對樣本t檢驗；計數(shù)資料用n和%表示，采用χ2檢驗，若期望值＜5，行Fisher確切概率法檢驗；雙側(cè)檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

1 形態(tài)學(xué)

富集前，顯微鏡下可見FNRBC呈圓形或橢圓形，核圓形深染，胞質(zhì)紅色深染，并可見大量散在的混雜細(xì)胞；磁激活細(xì)胞分選法富集后可見混雜細(xì)胞有所減少，但仍有一定混雜細(xì)胞總量，F(xiàn)NRBC散在其中；硅芯片納米微流體技術(shù)富集后可見視野中未見明顯的混雜細(xì)胞殘留，能明顯見到FNRBC，且FNRBC比例有所上升。見圖1。

圖1 外周血FNRBC富集前、后蘇木素-伊紅染色結(jié)果（×400）

2 細(xì)胞計數(shù)

硅芯片納米微流體技術(shù)進(jìn)行FNRBC富集時所得的總細(xì)胞量較磁激活細(xì)胞分選法少，F(xiàn)NRBC量較磁激活細(xì)胞分選法多，F(xiàn)NRBC比例較磁激活細(xì)胞分選法高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩種方案的細(xì)胞計數(shù)結(jié)果對比（）

表1 兩種方案的細(xì)胞計數(shù)結(jié)果對比（）

方案例數(shù)總細(xì)胞量（×107個/mL）FNRBC量（個/mL）FNRBC比例(×10-4)硅芯片納米微流體技術(shù)1120.99±0.2937.52±4.040.20±0.05磁激活細(xì)胞分選法1121.99±0.2118.23±2.180.10±0.05 t 29.92845.65013.565 P＜0.001＜0.001＜0.001

3 FNRBC富集時間及無菌試驗結(jié)果

硅芯片納米微流體技術(shù)對FNRBC的富集時間長于磁激活細(xì)胞分選法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩種方案的無菌試驗陽性發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩種方案FNRBC富集時間及無菌試驗結(jié)果對比

討 論

近年來，伴隨著人口結(jié)構(gòu)及疾病模式的轉(zhuǎn)變，新生兒出生缺陷問題日益突出，已成為中國新生兒病死、兒童與成人殘疾的主要原因之一[9-10]。產(chǎn)前診斷能夠在孕婦妊娠期間對胚胎或胎兒先天畸形或遺傳病等出生缺陷情況做出準(zhǔn)確診斷，以便臨床制定針對性預(yù)防措施，是降低新生兒出生缺陷的重要手段，也是優(yōu)生優(yōu)育的重要保障，其中無創(chuàng)產(chǎn)前診斷因其操作簡單、安全可靠、篩查時間更早等優(yōu)勢應(yīng)用較多[11-13]。目前，較多臨床研究已經(jīng)證實(shí)FNRBC不易受母體遺傳背景的干擾及限制性胎盤嵌合體的影響，能準(zhǔn)確反映胎兒各類遺傳性疾病及生長缺陷情況，是用于無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的最理想的靶細(xì)胞[14-16]。但有研究指出，通過FNRBC進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前診斷時確保診斷結(jié)果準(zhǔn)確的重要前提條件是足夠數(shù)量的FNRBC[17]。因此，對孕婦外周血中FNRBC進(jìn)行有效的分離、富集與純化顯得尤為必要。

硅芯片納米微流體技術(shù)是在納米電子微流硅芯片及微流體的作用下，將細(xì)胞依次濾過微通道，根據(jù)不同分選原理選擇性捕獲目標(biāo)細(xì)胞的手段[18]。磁激活細(xì)胞分選法是將磁珠與單克隆抗體相結(jié)合后對細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的相對特異性抗原進(jìn)行識別，并在外界磁場作用下將血液中帶磁與不帶磁的細(xì)胞分開，從而捕獲目標(biāo)細(xì)胞的手段[19]。上述兩種方法在血液細(xì)胞捕獲中均有較多應(yīng)用，且具有較好的捕獲效果。但目前較少有關(guān)于二者對孕婦外周血中FNRBC富集效果比較的相關(guān)研究報道。

本研究將硅芯片納米微流體技術(shù)與磁激活細(xì)胞分選法分別用于FNRBC的富集中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與磁激活細(xì)胞分選法相比，硅芯片納米微流體技術(shù)去除混雜細(xì)胞的能力更強(qiáng)，且獲得的FNRBC數(shù)量更多，對FNRBC的富集效果更好。分析原因在于，磁激活細(xì)胞分選法中首先通過密度梯度離心法對血液樣本中的各成分細(xì)胞進(jìn)行初步分離，通過分層液將FNRBC分開并收集，然后使用結(jié)合磁性顆粒的單克隆抗體CD71標(biāo)記細(xì)胞，在外加磁場作用下將FNRBC進(jìn)一步分離純化，從而對FNRBC進(jìn)行富集[20]。但文獻(xiàn)報道，磁珠的大小對FNRBC的富集會產(chǎn)生一定影響。常規(guī)情況下所使用的磁珠粒徑較大，比表面積較小，偶聯(lián)容量較低，在富集FNRBC時對其的吸附能力較差，且多次離心操作存在引起細(xì)胞丟失或被破壞的風(fēng)險，因此對FNRBC的富集數(shù)量較少[21]。且CHEN Y等[22]報道，磁激活細(xì)胞分選法難以徹底分離混雜細(xì)胞，所獲得的總細(xì)胞量較多，但獲得的FNRBC數(shù)量及純度與其他方法相比均較低，本研究結(jié)果也與之相似。而硅芯片納米微流體技術(shù)使用納米硅芯片對FNRBC進(jìn)行富集，結(jié)合特異性抗體修飾的納米芯片直徑較小，比表面積較大，對FNRBC的吸附能力與捕獲效率相對較高，因此得到的FNRBC數(shù)量較多，對FNRBC的富集效果較好[23]。其次，納米硅芯片上微流體通道的幾何形狀與目標(biāo)FNRBC的大小與形狀高度匹配，能夠精準(zhǔn)控制細(xì)胞流體，去除其他混雜細(xì)胞，減少捕獲的總細(xì)胞量，提高獲得的FNRBC比例[24]。周俊等[25]研究也指出，硅芯片納米微流體技術(shù)兩次捕獲的FNRBC數(shù)量分別為（20.6±6.1）、（20.4±5.8）個/mL，明顯高于既往其他方法所捕獲的FNRBC數(shù)量，且相較于其他方法，硅芯片納米微流體技術(shù)對FNRBC的富集效果更好，本研究結(jié)果也與上述研究結(jié)果相似。另外，謝建生等[26]發(fā)現(xiàn)，只要能夠富集20個/mL及以上的FNRBC，通過巢式變異的聚合酶鏈反應(yīng)基本能夠得到擴(kuò)增產(chǎn)物，滿足后續(xù)產(chǎn)前診斷要求。而本研究中硅芯片納米微流體技術(shù)兩次捕獲的FNRBC總量（37.52±4.04）個/mL雖略低于周俊等研究中兩次捕獲的FNRBC總量，但與HUANG等[27]研究中37.7個/mL的FNRBC數(shù)量相似，滿足產(chǎn)前診斷所需FNRBC數(shù)量，而磁激活細(xì)胞分選法所富集的FNRBC總量（18.23±2.18）個/mL略低于20個/mL，可能會影響產(chǎn)前診斷準(zhǔn)確性。由此可以看出，本研究中采用的硅芯片納米微流體技術(shù)所富集的FNRBC數(shù)量對臨床準(zhǔn)確進(jìn)行產(chǎn)前診斷更有價值。

本研究還發(fā)現(xiàn)，硅芯片納米微流體技術(shù)對FNRBC的富集時間長于磁激活細(xì)胞分選法，兩種方案的無菌試驗陽性發(fā)生率無明顯差異，提示兩種方法富集FNRBC時均有較高的安全性，但與磁激活細(xì)胞分選法相比，硅芯片納米微流體技術(shù)富集FNRBC的耗時較長。分析原因可能為，兩種方法均全程在無菌環(huán)境中進(jìn)行操作，且對操作人員的要求較高，因此獲得的FNRBC受污染的風(fēng)險較小。在FNRBC富集過程中，硅芯片納米微流體技術(shù)需對FNRBC進(jìn)行兩次捕獲，且捕獲后的FNRBC還需在培養(yǎng)基中通過免疫黏附法進(jìn)行進(jìn)一步純化，因此耗時較長。而磁激活細(xì)胞分選法對血液樣本的離心時間及使用免疫磁珠吸附的時間均較短，收集的FNRBC沉淀僅需再次短時間離心進(jìn)行純化，因此總體耗時相對較短。

磁激活細(xì)胞分選法、硅芯片納米微流體技術(shù)均是目前主要研究的FNRBC富集技術(shù)，前者在分選過程中存在的非特異性吸附會直接導(dǎo)致FNRBC的損失，且難以同時分選多個抗原標(biāo)記的多種細(xì)胞群，應(yīng)用相對局限。本研究結(jié)果證實(shí)，相較于磁激活細(xì)胞分選法，硅芯片納米微流體技術(shù)或許更具研究價值，但值得注意的是，硅芯片納米微流體技術(shù)儀器設(shè)備昂貴、技術(shù)復(fù)雜，對技術(shù)人員操作的要求較高，且檢查費(fèi)用較高，應(yīng)用也有局限。但對于胎母輸血量較小的孕婦來說，常規(guī)分離與富集技術(shù)無法富集足量FNRBC，而硅芯片納米微流體技術(shù)可富集更多的FNRBC以滿足后續(xù)產(chǎn)前診斷要求，增加產(chǎn)前診斷準(zhǔn)確性。

綜上所述，硅芯片納米微流體技術(shù)與磁激活細(xì)胞分選法進(jìn)行FNRBC富集所得樣本受污染風(fēng)險均較低，與磁激活細(xì)胞分選法相比，硅芯片納米微流體技術(shù)去除混雜細(xì)胞的能力較強(qiáng)，且獲得的FNRBC數(shù)量較多，對FNRBC的富集效果較好，但所需時間較長。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突