AB血漿倍比稀釋在高效價(jià)自身抗體患者抗體篩查中的應(yīng)用研究

任麗 李曉莉 肖松 李小飛 劉志忠

1首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京 100069；2北京豐臺(tái)右安門醫(yī)院輸血科，北京 100071；3首都醫(yī)科大學(xué)附屬友誼醫(yī)院輸血科，北京 100032

日常血庫工作者在選擇供受者相合紅細(xì)胞成分血液時(shí)，輸血前相容性檢測試驗(yàn)會(huì)遇到抗體篩查三系細(xì)胞均陽性，自身對照及直接抗人球試驗(yàn)也陽性；再用16系譜細(xì)胞抗體鑒定時(shí)全部陽性，且反應(yīng)強(qiáng)度無差別[1]。此時(shí)患者如有嚴(yán)重貧血，需要輸注紅細(xì)胞成分時(shí)，我們要解決是否有同種抗體被自身抗體掩蓋的問題。目前，比較常用的方法是用自身紅細(xì)胞的吸收與放散試驗(yàn)反復(fù)操作，將受血者血漿中自身抗體吸收，直到直接抗人球試驗(yàn)陰性后，才可進(jìn)行血漿的同種抗體篩查。但對于高效價(jià)的自身抗體，吸收放散試驗(yàn)結(jié)果不理想，難以達(dá)到消除自身抗體的目標(biāo)[2]。一些實(shí)驗(yàn)室常采用鹽水稀釋抗體，但是鹽水法常難消除高效價(jià)自身抗體的干擾。我們選取鹽水效價(jià)高的6例自身抗體患者標(biāo)本，改用AB血漿作為倍比稀釋液測定效價(jià)，先驗(yàn)證能否改變自身抗體標(biāo)本的反應(yīng)體系，在多少倍稀釋可消除自身抗體的影響；再確認(rèn)與常規(guī)鹽水法對比檢測同種抗體效價(jià)是否相符；觀察將選擇自身抗體患者標(biāo)本與含有已知同種抗體標(biāo)本進(jìn)行人為混合，再進(jìn)行同種抗體效價(jià)的測定，是否與之前效價(jià)比對，以期評價(jià)是否達(dá)到模擬真實(shí)世界的標(biāo)本的目標(biāo)。最后用此方法檢測4例真實(shí)世界標(biāo)本，即含有已知同種抗體的自身抗體標(biāo)本。報(bào)告如下。

材料與方法

1 標(biāo)本來源

2020年1月1日—2023年10月10日我院住院患者外送檢測的抗體篩查陽性標(biāo)本，25例，其中鹽水稀釋效果差的6例自身抗體標(biāo)本（反應(yīng)強(qiáng)度≥3+）和4例含自身抗體且分別存在抗-C、抗-E、抗-Jka、抗-cE抗體的受血者標(biāo)本，見表1。16例同種抗體的標(biāo)本見表2。以上抗體種類均經(jīng)本市血液中心參比實(shí)驗(yàn)室確定。

表1 標(biāo)本來源組成

表2 16例同種抗體鹽水稀釋和AB漿倍比稀釋測效價(jià)結(jié)果

1.1 O型健康獻(xiàn)血者3名，自制1%試劑紅細(xì)胞。AB血漿為3例以上正常獻(xiàn)血者血漿混合，不規(guī)則抗體篩查均為陰性。用于鹽水法和AB血漿法自身抗體效價(jià)測定。

1.2 另選取10名O型健康獻(xiàn)血者，對應(yīng)上述16例標(biāo)本含有同種抗體相應(yīng)純合子抗原，配制抗體效價(jià)檢測1%試劑紅細(xì)胞。用于同種抗體效價(jià)測定。

1.3 人為混合的16例血漿標(biāo)本，前4例自身抗體標(biāo)本，每1個(gè)分別對應(yīng)每3個(gè)同種抗體血漿，后2例自身抗體每1個(gè)分別對應(yīng)每2個(gè)同種抗體血漿，按1∶1混合。不限ABO血型，共16管人為混合標(biāo)本，參照1.2選取O型健康獻(xiàn)血者紅細(xì)胞作試劑紅細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1號(hào)自身抗體加1、2、3號(hào)同種抗體，

2號(hào)自身抗體加4、5、6號(hào)同種抗體，

3號(hào)自身抗體加7、8、9號(hào)同種抗體，

4號(hào)自身抗體加10、11、12號(hào)同種抗體，

5號(hào)自身抗體加13、14號(hào)同種抗體，

6號(hào)自身抗體加15、16號(hào)同種抗體。形成16個(gè)混合標(biāo)本。

1.4 4例含自身抗體且分別存在抗-C、抗-E、抗-Jka、抗-cE抗體的受血者標(biāo)本，用于AB血漿稀釋法進(jìn)行抗人球蛋白試驗(yàn)（微柱法）的不規(guī)則抗體篩查。

2 試劑與儀器

單克隆抗-A、抗-B（上海血液生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20220203）；抗-C、抗-c、抗-D、抗-E，抗-e、抗-M、抗-lea、抗-Jka（上海血液生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20210401、20221103）；A型、B型試劑紅細(xì)胞 （Diana，批號(hào)3061138）；抗體篩查三系細(xì)胞（Diana，批號(hào)：23035、23037、23041），均在有效期之內(nèi)使用。WADIANA/8XT（Diana）、血型卡孵育器及離心機(jī)（Diana） 、血清學(xué)離心機(jī)（BASO2020-2）。

3 方法

所有試驗(yàn)均在抗人球蛋白試驗(yàn)（微柱法）體系下進(jìn)行。

3.1 鹽水稀釋法

將自身抗體患者的血漿進(jìn)行鹽水倍比稀釋，稀釋2，4，8，16，64，128，256，512，1 024倍，1%預(yù)制的三人份O型紅細(xì)胞反應(yīng)于抗人球蛋白試驗(yàn)（微柱法）中，至自身抗體消失，以1+為最終結(jié)果，記錄效價(jià)。從10名O型健康獻(xiàn)血者找出相應(yīng)抗原獻(xiàn)血者進(jìn)行16個(gè)已知同種抗體進(jìn)行正常效價(jià)測定。

3.2 AB血漿稀釋法

將自身抗體患者的血漿進(jìn)行預(yù)制AB血漿倍比稀釋，稀釋2，4，8，16，32，64，128倍，1%預(yù)制的三人份O型紅細(xì)胞反應(yīng)于抗人球蛋白試驗(yàn)（微柱法）中，至自身抗體消失，以1+為最終結(jié)果，記錄效價(jià)。同3.1，再按此倍比稀釋的血漿與有相應(yīng)抗原紅細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)[3]，對16個(gè)已知同種抗體AB血漿倍比稀釋進(jìn)行效價(jià)測定。

3.3 16例同種抗體血漿與自身抗體血漿混合標(biāo)本測定各自效價(jià)

第一管等體積混合（效價(jià)記為2），第二管開始分別以鹽水、AB血漿倍比稀釋，稀釋4、8、16、32、64、128倍，觀察在模擬自身抗體存在的情況下同種抗體效價(jià)檢測結(jié)果的變化。

3.4 AB血漿做為稀釋液進(jìn)行抗體篩查試驗(yàn)

用AB血漿倍比稀釋自身抗體合并同種抗體的4例患者標(biāo)本進(jìn)行抗體篩查、抗體鑒定。

結(jié) 果

1 兩種方法測定6例自身抗體效價(jià)

1.1 用鹽水倍比稀釋法測6例自身抗體效價(jià)，記錄如下：

用鹽水法檢測6例自身抗體效價(jià)，效價(jià)均大于1∶512，見圖1。

圖1 6例自身抗體鹽水倍比稀釋法測效價(jià)

1.2 用AB血漿倍比稀釋測6例自身抗體效價(jià)，效價(jià)均為1∶4，見圖2。

圖2 6例自身抗體AB血漿倍比稀釋法測效價(jià)

2 分別用鹽水和AB血漿稀釋16例同種抗體測效價(jià)。見表2。

除13號(hào)效價(jià)為2的抗-M，血漿反應(yīng)相略高于鹽水相外，AB漿倍比稀釋法與常規(guī)鹽水法16例同種抗體效價(jià)測定一致。

3 自身抗體和同種抗體同比例混合測效價(jià)，第一管為兩標(biāo)本混合，第二管開始分別用鹽水、AB漿倍比稀釋。結(jié)果見表3。

表3 人為配比自身+同種抗體的16例混合標(biāo)本鹽水和AB漿倍比稀釋測效價(jià)結(jié)果

混合后鹽水效價(jià)測定，效價(jià)≥16時(shí)，同種抗體效價(jià)與原效價(jià)相符，效價(jià)＜16時(shí)，鹽水倍比稀釋后效價(jià)均為1∶16；而AB血漿稀釋法同種抗體≥1∶8時(shí)，可檢出與原同種抗體效價(jià)全相符。小于1∶4無法分辨同種抗體和自身抗體。

4 自身抗體存在抗-C、抗-E、抗-Jka、抗-cE的四個(gè)受血者標(biāo)本用AB血漿稀釋，抗體篩查結(jié)果，見表4、表5、表6、表7。

表4 受血者1含抗-C抗體篩查反應(yīng)格局表（I號(hào)細(xì)胞有C抗原、II、III號(hào)無）

表5 受血者2標(biāo)本含抗-E抗體篩查反應(yīng)格局表（Ⅱ號(hào)細(xì)胞有E抗原、Ⅰ、Ⅲ號(hào)無）

表6 受血者3標(biāo)本含抗-Jka抗體篩查反應(yīng)格局表（Ⅰ、Ⅲ號(hào)細(xì)胞有抗原、II號(hào)無）

表7 受血者4含抗-cE標(biāo)本抗體篩查反應(yīng)格局表（Ⅱ、Ⅲ號(hào)細(xì)胞有抗原、其他無）

討 論

自身抗體產(chǎn)生原因較多，目前認(rèn)為多為自身免疫性疾病或藥物所致，但發(fā)生機(jī)制尚未明了。其中自身免疫性溶血性貧血是常見的最棘手的輸血相容性檢測難題。自身免疫性溶血性貧血（自免溶貧，autoimmune hemolytic anemia，AIHA）由于免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，產(chǎn)生了針對自身紅細(xì)胞抗原的抗體和（或）補(bǔ)體，從而引起紅細(xì)胞加速破壞（即溶血）[4]。常見的是溫抗體型自身免疫性疾病，血清中的自身抗體是IgG型的，與所有的紅細(xì)胞在間接抗人球蛋白試驗(yàn)（IAT）中都呈陽性反應(yīng)[5]。此類患者需要經(jīng)常輸血治療，會(huì)增加了同種抗體的產(chǎn)生頻率[6]導(dǎo)致配血風(fēng)險(xiǎn)加大。當(dāng)自身抗體和同種抗體同時(shí)存在時(shí)，由于高效價(jià)自身抗體導(dǎo)致無差別凝集度，抗體鑒定及交叉配血十分困難。較重貧血的患者標(biāo)本中紅細(xì)胞數(shù)量偏少，在高效價(jià)自身抗體存在的情況下，難以將自身抗體吸收完全，不僅耗時(shí)過長，而且反復(fù)洗滌易造成紅細(xì)胞破碎溶血，影響試驗(yàn)結(jié)果判讀。放散后的紅細(xì)胞存在于鹽水溶液中，重復(fù)加入患者自身血漿，可能會(huì)因稀釋漏檢同種抗體。由于耗時(shí)過長，也不適用于急危重患者[7]。輸血行業(yè)大多認(rèn)同主側(cè)交叉配血試驗(yàn)反應(yīng)強(qiáng)度低于自身對照反應(yīng)強(qiáng)度的方法選擇供血者。同種抗體和自身抗體反應(yīng)強(qiáng)度一致并不代表造成輸入的供者紅細(xì)胞溶血風(fēng)險(xiǎn)程度相同。鑒定同種抗體是否被強(qiáng)自身抗體掩蓋無疑是非常需要的。

存在自身抗體的患者，多數(shù)免疫球蛋白水平增高，或者循環(huán)復(fù)合物增多，C3補(bǔ)體也會(huì)下降[8]，從而造成一定程度的溶血，往往CRP升高，血沉加快。酸中毒導(dǎo)致的血漿pH值、陰陽離子等位點(diǎn)變化，導(dǎo)致患者血漿組成成分的變化會(huì)引起體外配血反應(yīng)體系改變。我們通過檢測上述6例自身抗體及4例自身和同種抗體同時(shí)存在的患者血漿，發(fā)現(xiàn)白球比均異常，甚至白球比倒置。在血漿置換后的患者實(shí)驗(yàn)室檢查中發(fā)現(xiàn)，免疫球蛋白降低，直接或間接抗人球蛋白試驗(yàn)會(huì)明顯減弱，這也是一個(gè)很好的證明[9-10]。因此我們聯(lián)想到能否利用健康者血漿ABO同型血漿或AB血漿進(jìn)行稀釋，隨著正常血漿比例的增高，改善白球比例，消除自身抗體的抗人球蛋白試驗(yàn)的反應(yīng)性。6名自身抗體患者和4名受血者1-4，用鹽水稀釋再配血的效果差。但是在人為添加的16例標(biāo)本效價(jià)中≥16的標(biāo)本，鹽水效價(jià)測定，同種抗體效價(jià)與原效價(jià)相符，可能是由于同種抗體的添加也相當(dāng)于健康血漿加入，在一定程度上改善了白球比，改變了血漿的反應(yīng)體系。

圖2顯示AB型血漿稀釋效價(jià)在1∶4。說明AB漿能很好地改變自身抗體患者血漿反應(yīng)體系，消除自身抗體的影響。表2中16例同種抗體在鹽水和AB血漿稀釋時(shí)，僅在一例抗-M效價(jià)1∶2時(shí)，兩者有區(qū)別，且血漿相略高，為1∶4。說明血漿相與鹽水相在同種抗體檢出時(shí)無差別，用AB漿測定效價(jià)不會(huì)影響效價(jià)測定。表3說明了人為添加組合成含同種抗體的自身抗體標(biāo)本除了1∶4以下的同種抗體測定受自身抗體的影響，只要超過1∶8效價(jià)，與原效價(jià)完全一致，由于都是選擇O型紅細(xì)胞為指示細(xì)胞，兩個(gè)非同型患者血漿混合不影響反應(yīng)體系，可行模擬自身抗體+同種抗體的真實(shí)世界標(biāo)本。表4、5、6、7是真實(shí)世界的標(biāo)本，同時(shí)含有同種抗體和自身抗體，并已在本市血液中心確定抗體性質(zhì)。在用AB血漿不同倍數(shù)稀釋中，可通過與抗體篩查三系細(xì)胞，根據(jù)強(qiáng)弱變化檢出同種抗體。只要同種抗體效價(jià)大于1∶4均可檢出。一些研究表明效價(jià)低于1∶2時(shí)對患者輸血安全無影響[11-12]。鑒于抗體篩查試驗(yàn)的半定量檢測方法，患者體內(nèi)產(chǎn)生的大多數(shù)同種抗體效價(jià)在1∶4以上時(shí)，溶血的風(fēng)險(xiǎn)才較大。自身抗體低效價(jià)時(shí)，親和力不強(qiáng)，部分可用鹽水稀釋可解決自身抗體干擾同種抗體檢出。一旦自身抗體效價(jià)過高，鹽水稀釋法就難以檢出是否同時(shí)存在同種抗體。此時(shí)我們建議可用AB血漿作為稀釋液。由于難以獲取高效價(jià)自身抗體且有同種抗體的標(biāo)本，本試驗(yàn)的真實(shí)世界樣本只有4例。當(dāng)同種抗體效價(jià)較低時(shí)，自身抗體的干擾難以消除，臨床上仍有一定溶血的風(fēng)險(xiǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突