改良56℃熱放散法與冷凍復(fù)融放散法對ABO型新生兒溶血病的臨床應(yīng)用價(jià)值比較*

尹明秀 歐國進(jìn) 陳劍 鳳婧 趙虹

1四川大學(xué)華西第二醫(yī)院檢驗(yàn)科；2四川大學(xué)華西第二醫(yī)院出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 6100412

胎兒新生兒溶血病（hemolytic disease of the fetus and newborn，HDFN）是指因母嬰血型不合，母體針對與其不同的胎兒紅細(xì)胞血型抗原所產(chǎn)生的相應(yīng)抗體經(jīng)胎盤進(jìn)入胎兒血液循環(huán)，導(dǎo)致胎兒或新生兒同種免疫性溶血引起的一系列臨床癥狀[1]。HDFN常導(dǎo)致早期流產(chǎn)，輕者出現(xiàn)胎兒或新生兒貧血、水腫、肝脾腫大，重者如果未經(jīng)處理，可能導(dǎo)致胎兒重度貧血、嚴(yán)重的新生兒高膽紅素血癥與核黃疸甚至死亡[2-3]。ABO型新生兒溶血?。ˋBO-HDFN）是新生兒期最常見的疾病之一，是母體血液中產(chǎn)生的針對胎兒紅細(xì)胞的IgG免疫抗體通過胎盤進(jìn)入胎兒血液循環(huán)發(fā)生同種免疫而引起的溶血。臨床上偶爾有IgG高效價(jià)抗-A（B）抗體引起嚴(yán)重的ABO-HDFN案例報(bào)道[4]，且有研究指出，O型孕婦IgG抗A（B）抗體效價(jià)與ABO-HDFN和高膽紅素血癥發(fā)生具有相關(guān)性[5]，隨著抗體效價(jià)的增高，ABO新生兒溶血病患病率增加[6]。

提高新生兒/臍帶血標(biāo)本中紅細(xì)胞抗體陽性檢出率能更好地為臨床提供診斷依據(jù)，便于ABO-HDFN早期診斷與治療，降低其傷害。ABO-HDFN診斷依據(jù)主要為3項(xiàng)血清學(xué)試驗(yàn)：直接抗人球蛋白試驗(yàn)（DAT）、游離抗體試驗(yàn)和紅細(xì)胞釋放試驗(yàn)（即放散試驗(yàn)）。DAT陽性不能完全診斷HDFN，放散試驗(yàn)對新生兒ABO-HDFN的敏感度最高[7]，即放散試驗(yàn)檢出抗體特異性是HDFN診斷的重要依據(jù)[8]。紅細(xì)胞釋放試驗(yàn)方法種類多，常用方法包括物理放散法（如冷凍復(fù)融放散、45℃熱放散、56℃熱放散等）和化學(xué)放散法（如甘氨酸放散、氯喹放散等）。我室一直采用冷凍復(fù)融放散法作為常規(guī)紅細(xì)胞釋放試驗(yàn)，其結(jié)果與臨床吻合度較高；但此方法因絕大多數(shù)紅細(xì)胞已被破壞，獲得的放散液顏色很深，后續(xù)只能進(jìn)行試管法抗人球蛋白試驗(yàn)來進(jìn)行抗體檢測，該法需要多次洗滌細(xì)胞，操作步驟較多，結(jié)果判讀也易受檢測人員能力水平影響。傳統(tǒng)56℃熱放散法需要在孵育期間多次人工混勻，根據(jù)操作手法不同也會導(dǎo)致不同比例的紅細(xì)胞破壞，獲得的放散液也因顏色較深，后續(xù)抗體檢測用微柱凝膠卡法不便于觀察，最好進(jìn)行試管法的抗人球蛋白試驗(yàn)。而改良56℃熱放散法為上海市血液中心參比實(shí)驗(yàn)室采用的試驗(yàn)方法，此方法獲得的放散液僅輕微溶血，后續(xù)可采用微柱凝膠卡法，更好進(jìn)行操作標(biāo)準(zhǔn)化。本文主要探究改良56℃熱放散和冷凍復(fù)融放散法對診斷ABO-HDFN是否存在差異，多方面探討其是否可作為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測方法。

資料與方法

1 一般資料

選擇2023年3月1日—2023年3月31日來我院就診疑似ABO-HDFN 的新生兒患者。其中絕大部分患兒母親血型為O型且父親血型為非O型，以及少部分在外院生產(chǎn)而因高膽紅素血癥轉(zhuǎn)入我院的新生兒，其父母ABO血型不一致的患兒。我院出生的新生兒采集EDTA抗凝臍帶血4mL進(jìn)行檢測，若無臍帶血則采集患兒靜脈血3～4 mL進(jìn)行EDTA抗凝。試驗(yàn)期間共收集445例標(biāo)本，其中非O型新生兒263例，排除4例存在ABO外抗體，2例標(biāo)本量少不能完成試驗(yàn)，1例血型抗原減弱，共有256例標(biāo)本納入試驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析。

2 試劑與儀器

單克隆抗-A、抗-B-（江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司），反定A1細(xì)胞、B細(xì)胞、抗體篩查細(xì)胞（西班牙Diagnostic Grifols 公司），ABO-Rh血型檢測卡、coombs卡（西班牙Diagnostic Grifols 公司），抗人球蛋白試劑（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）和低離子液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司），所有試劑均在有效期內(nèi)。采用西班牙Grifols Erytra 全自動配血及血型分析儀、西班牙Grifols專用孵育器、西班牙Grifols專用離心機(jī)、日本久保田血清學(xué)離心機(jī)、安徽中佳低速離心機(jī)。

3 試驗(yàn)方法

將血標(biāo)本1 000×g離心5 min，參照臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程鑒定標(biāo)本ABO及RhD血型?；颊哐獫{標(biāo)本進(jìn)行游離抗體試驗(yàn)。取壓積紅細(xì)胞 2mL于潔凈玻璃試管，加入3～5 mL生理鹽水洗滌4～6次。將末次洗滌的生理鹽水棄盡得到洗滌紅細(xì)胞。用洗滌后的紅細(xì)胞進(jìn)行DAT試驗(yàn)和放散試驗(yàn)，放散試驗(yàn)同時(shí)采用冷凍復(fù)融法和改良56℃熱放散法。

3.1 游離抗體試驗(yàn)

取Grifols Coombs卡標(biāo)記1～3孔分別加入0.8%～1.0%標(biāo)準(zhǔn)A1細(xì)胞、B細(xì)胞和抗篩細(xì)胞50 μL，再加入患兒血漿25 μL于各孔，在Grifols專用孵育器孵育15 min后，于Grifols專用離心機(jī)離心9 min，觀察和判讀微柱凝膠卡結(jié)果。

3.2 直接抗人球蛋白試驗(yàn)（DAT）

取上述洗滌紅細(xì)胞用生理鹽水配制0.8%～1.0%紅細(xì)胞懸液，加入50 μL于Grifols Coombs卡中，用Grifols專用離心機(jī)離心9 min后，觀察和判讀微柱凝膠卡結(jié)果。

3.3 冷凍復(fù)融放散試驗(yàn)

取0.5 mL上述洗滌紅細(xì)胞與等量生理鹽水在試管中混勻，蓋上試管并旋轉(zhuǎn)試管將細(xì)胞涂覆試管壁上，將試管水平置于-80℃冰箱冰凍10 min后取出，在37℃水浴箱的融化5 min。1 000×g離心3 min得上清液即放散液，將放散液轉(zhuǎn)移到干凈試管中，并與紅細(xì)胞末次洗液做平行對照。隨后進(jìn)行試管法抗人球蛋白試驗(yàn)，即取2滴放散液、1滴3%～5%標(biāo)準(zhǔn)ABO細(xì)胞懸液、2滴低離子液，混勻，于37℃水浴15 min后，生理鹽水洗滌4～6次，末次去盡上清后于試管內(nèi)加入單克隆抗IgG抗體1滴，1 000×g 離心 15 秒后，人工判讀試管法結(jié)果。

3.4 改良56℃熱放散試驗(yàn)

取0.5 mL上述洗滌紅細(xì)胞加入等量生理鹽水制成50%紅細(xì)胞懸液，于56℃恒溫水浴箱中輕微震蕩1 min后，再孵育9 min（注：標(biāo)準(zhǔn)熱放散試驗(yàn)為將試管置于56℃孵育10 min，期間定期攪拌試管）。取出后1 000×g離心3 min得上清液即放散液，將放散液轉(zhuǎn)移到干凈試管中，并于紅細(xì)胞末次洗滌的上清液做平行對照試驗(yàn)。隨后進(jìn)行微柱凝膠卡法抗人球蛋白試驗(yàn)法，即取Grifols Coombs卡加入50 μL 0.8%～1.0%標(biāo)準(zhǔn)A1細(xì)胞/B細(xì)胞，再加入放散液50 μL。于Grifols專用孵育器孵育15min后，再用Grifols專用離心機(jī)離心9min，觀察微柱凝膠卡法結(jié)果。

4 結(jié)果判定

按照產(chǎn)品說明書，根據(jù)紅細(xì)胞聚集在凝膠卡凝膠帶上的位置判定陰陽性（陽性強(qiáng)度為±～4+，全部沉淀在凝膠卡底部為陰性）。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用比例（%）表示，組間比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，等級資料比較進(jìn)行非參數(shù)U檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 平行對照結(jié)果

冷凍復(fù)融放散法和改良56℃熱放散法均留取了末次洗滌的上清液作為平行對照，所有納入試驗(yàn)的標(biāo)本平行對照試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。

2 改良56℃放散法和56℃放散法結(jié)果比較

因冷凍復(fù)融放散試驗(yàn)放散液為細(xì)胞破碎后所得，顏色為深紅色，加入微柱凝膠卡后，無法判讀結(jié)果，因此只能進(jìn)行試管法抗人球蛋白試驗(yàn)。而改良56℃熱放散試驗(yàn)大部分細(xì)胞沒有破碎，所得上清液為淺紅色，可以直接加入微柱凝膠卡，進(jìn)行卡法抗人球蛋白試驗(yàn)。改良56℃熱放散試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 原56℃熱放散與改良56℃熱放散微柱凝膠卡法結(jié)果比較

同時(shí)對隨機(jī)4個樣本同時(shí)進(jìn)行56℃放散法和改良56℃放散法，結(jié)果見圖1。由圖可以看出，末次洗滌上清液結(jié)果均為陰性，說明試驗(yàn)結(jié)果可靠，原56℃放散液顏色很深（因?yàn)榧t細(xì)胞已被破壞），而改良56℃放散液顏色更淺，更利于微柱凝膠卡判讀結(jié)果，且相同試驗(yàn)條件下，改良56℃放散比原56℃放散法獲得的結(jié)果陽性程度更高。

3 改良56℃熱放散法微柱凝膠卡法結(jié)果圖示

冷凍復(fù)融放散試驗(yàn)放散液為細(xì)胞破碎后所得，顏色為深紅色，加入微柱凝膠卡后，無法判讀結(jié)果，因此只能進(jìn)行試管法抗人球蛋白試驗(yàn)，不便于結(jié)果拍照保存。原56℃放散法有部分紅細(xì)胞破壞所得放散液顏色較深，微柱凝膠卡法抗人球蛋白試驗(yàn)結(jié)果不便于觀察，一般也選擇試管抗人球蛋白試驗(yàn)進(jìn)行后續(xù)操作。而改良56℃放散法大部分微柱凝膠卡法細(xì)胞沒有破碎，得上清液為淺紅色，可以用微柱凝膠卡進(jìn)行抗人球蛋白檢測。試驗(yàn)結(jié)果對比如圖1所示，對于游離試驗(yàn)強(qiáng)度為1+的2號標(biāo)本，改良56℃放散法結(jié)果（凝集強(qiáng)度3+）比原56℃放散法結(jié)果（凝集強(qiáng)度1+）的放散效果更好。

4 兩種放散方法陽性檢出率比較

本試驗(yàn)中，256例樣本中冷凍復(fù)融放散法的陽性率為64.45%，陰性率為45.55%。改良56℃放散法的陽性率為69.92%，陰性率為30.08%。兩種方法比較P值為0.188，大于0.05，說明兩種放散方法的陽性檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。具體結(jié)果如表1所示。

表1 兩種放散方法結(jié)果比較

5 兩種放散方法不同凝集強(qiáng)度結(jié)果比較

比較兩種方法檢出陽性標(biāo)本的凝集強(qiáng)度±～4+，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法得出P值為0.058，大于0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具體結(jié)果如表2所示。

表2 兩種放散方法不同凝集強(qiáng)度結(jié)果比較

6 不同血型兩種放散方法結(jié)果比較

納入試驗(yàn)的256例標(biāo)本中，A型145例，B型109例，AB型2例，其中AB型的2例標(biāo)本兩種方法檢測均為陰性。A型冷凍復(fù)融放散法和改良56℃放散法的陽性率分別為77.24%和80.69%，P值為0.471；B型冷凍復(fù)融放散法和改良56℃放散法的陽性率分別為51.38%和56.88%；P值為0.35。不同血型兩種方法的陽性率比較P值均大于0.05，兩種放散方法的陽性檢體結(jié)果如表3所示。

表3 不同血型兩種放散方法結(jié)果比較

7 不同直抗結(jié)果兩種放散方法結(jié)果的比較

本試驗(yàn)中，直抗陰性一共197例。冷凍復(fù)融放散法和改良56℃放散法的陽性率分別為54.31%和60.91%，P值為0.185；直抗陽性一共59例，冷凍復(fù)融放散法和改良56℃放散法的陽性率分別為98.31%和100.00%，P值為0.315。不同直抗結(jié)果的P均大于0.05，故不同直抗結(jié)果兩種放散方法結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。具體結(jié)果見表4。

表4 不同直抗結(jié)果兩種放散方法結(jié)果的比較

8 不同游離抗體結(jié)果兩種放散方法結(jié)果比較

納入試驗(yàn)的256例標(biāo)本中，游離抗體陰性共88例，冷凍復(fù)融放散法和改良56℃放散法的陽性率分別為11.36%和17.05%，P值為0.280；游離抗體陰性共168例，冷凍復(fù)融放散法和改良56℃放散法的陽性率分別為92.26%和97.62%，P值為0.025，小于0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即當(dāng)游離抗體陽性時(shí)，改良56℃放散法的陽性率高于冷凍復(fù)融放散法。具體結(jié)果見表5。

表5 不同游離抗體結(jié)果兩種放散方法結(jié)果的比較

討 論

母嬰血型不合是引起新生兒病理性黃疸的主要原因。有研究表明，母嬰ABO和Rh血型不合引起的HDFN中，ABO血型不相容占85.3%[9]，遠(yuǎn)高于Rh血型系統(tǒng)，臨床上需要盡早診斷并開展治療，使疾病預(yù)后得到改善[10]，從而改善患兒的生存質(zhì)量。紅細(xì)胞抗體釋放試驗(yàn)是診斷ABO-HDFN最有力的證據(jù)，陽性結(jié)果表明患兒紅細(xì)胞被母體IgG抗A（B）抗體致敏。但放散試驗(yàn)比一般輸血前檢查更加精密，更容易受到檢驗(yàn)溫度、環(huán)境、操作規(guī)范等因素的影響[11]。

本試驗(yàn)在相同環(huán)境下進(jìn)行，且操作人員相同，兩種放散方法的陽性檢出率約65%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明兩種放散方法均適合用于檢測ABO-HDFN。兩種放散方法在不同凝集強(qiáng)度之間也不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但存在細(xì)微差別。冷凍復(fù)融放散的凝集強(qiáng)度主要為±～2+，其中2+占比為41.2%，3+占比為10.3%；改良熱放散的凝集強(qiáng)度主要為1+～3+，2+陽性率為45.3%，3+陽性率為13.4%，說明改良熱放散法檢測效果更好更利于結(jié)果判讀。對于檢測不同血型樣本，A型、B型兩種方法的陽性率比較P值均＞0.05，說明兩種放散方法的陽性檢出率在不同血型上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但對不同血型陽性率進(jìn)行分析我們可以看出，冷凍復(fù)融法A型和B型的陽性檢出率分別為77.2%和48.6%，改良熱放散法A型和B型的陽性檢出率分別為80.7%和56.9%，兩種放散方法A型的陽性率均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于B型，可能與紅細(xì)胞上A位點(diǎn)的抗原決定簇略多于B有關(guān)，同時(shí)A抗原免疫原性強(qiáng)于B抗原，更容易誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，這與MATTEOCCI[12]、朱潔好[13]等研究結(jié)果一致。該試驗(yàn)中，不同直抗結(jié)果之間比較P值均＞0.05，得出不同直抗結(jié)果兩種放散方法結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但我們可以看出，直抗陽性標(biāo)本放散實(shí)驗(yàn)檢出特異性抗體均＞98%，故直抗陽性不能直接確診發(fā)生了新生兒溶血??；直抗陰性標(biāo)本中放散實(shí)驗(yàn)檢出特異性抗體均＞54%，故直抗陰性不能直接排除未發(fā)生新生兒溶血病。兩種放散方法的比較結(jié)果均顯示改良熱放散陽性率稍高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示加大檢測標(biāo)本量可能比較出兩種方法的差異性。對游離抗體陰性和陽性時(shí)兩種方法陽性率進(jìn)行比較分析可知，游離抗體陰性時(shí)冷凍復(fù)融放散法和改良56℃放散法的陽性率分別為11.36%和17.05%，驗(yàn)證了游離陰性不能完全排除不存在ABO-HDFN；游離抗體陽性的標(biāo)本檢測中，冷凍復(fù)融放散法和改良56℃放散法均有較高陽性率，分別為92.26%和97.62%，且二者存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明此狀態(tài)下改良56℃放散法的陽性檢出率更高，漏檢率更低，具有更好的臨床診斷能力。比較原56℃放散法和改良56℃放散法可知，改良56℃放散法紅細(xì)胞被破壞較少，更適合用于微柱凝膠卡檢測，而原56℃放散法細(xì)胞破壞嚴(yán)重，放散液嚴(yán)重溶血，后續(xù)一般進(jìn)行試管法的抗人球蛋白試驗(yàn)來進(jìn)行抗體檢測。

本研究在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)細(xì)節(jié)有不足之處，凍融復(fù)融放散法中紅細(xì)胞完全溶解，由于壓積紅細(xì)胞和鹽水等量，壓積紅細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)完全釋放后，相當(dāng)于放散液被稀釋了1倍。因此比較合理的比對是1份熱放散液和2份凍融放散液的比對。此外，后續(xù)放散液的檢測，改良56℃熱放散液用微柱凝膠卡法、冷凍復(fù)融用試管抗人球蛋白法，兩種方法的靈敏度不同，使用的抗人球試劑有較大差異，可能影響兩種方法結(jié)果的比較。

兩種放散試驗(yàn)對工作人員經(jīng)驗(yàn)有不同的要求，且試驗(yàn)時(shí)間上存在差異。改良56℃熱放散試驗(yàn)使用微柱凝膠卡法進(jìn)行抗人球蛋白試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果的判讀可以根據(jù)說明書準(zhǔn)確判斷，不存在人為差異；而冷凍復(fù)融放散試驗(yàn)中只能進(jìn)行試管法抗人球蛋白試驗(yàn)，有研究指出，微柱凝膠卡法抗人球蛋白試驗(yàn)的靈敏度要高于試管法，這種偏差可能是由于試管法測定血清抗體效價(jià)時(shí)需要反復(fù)清洗紅細(xì)胞，操作輔助，易受人為因素影響[14]?；仡櫿麄€放散試驗(yàn)的過程，改良56℃熱放散試驗(yàn)涉及幾個流程，總耗時(shí)長約35 min，標(biāo)本量對整體工作時(shí)間影響不大。冷凍復(fù)融放散試驗(yàn)涉及另外的固定流程，總耗時(shí)長大于40 min，因涉及樣本洗滌，所以標(biāo)本量越大所需時(shí)間越長。兩種方法相比，冷凍復(fù)融放散法操作更為繁瑣和耗時(shí)，對工作人員能力要求更高，而且需要-80℃超低溫冰箱（注：根據(jù)本實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，-20℃冰箱冷凍時(shí)間達(dá)1 h才能達(dá)到-80℃冰箱冷凍10 min的相同效果）。和冷凍復(fù)融放散試驗(yàn)相比，改良56℃熱放散試驗(yàn)操作更簡便，人為因素影響較小，但需要配套的微凝膠Coombs卡、孵育器和離心機(jī)。大多數(shù)情況下，兩種方法的放散結(jié)果一致，不同實(shí)驗(yàn)室可結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室情況綜合考慮和選擇。

早診早治HDN患兒可有效地控制病情進(jìn)展并改善預(yù)后，縮短病程是最為重要的[15]。有研究表示新生兒溶血病檢出率在出生后3 d內(nèi)最高，隨著日齡的增長，3項(xiàng)試驗(yàn)陽性率會逐漸降低[16-17]，因此需要盡早送檢，做到早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防、早診斷、早治療，降低ABO-HDFN對新生兒的危害。

本研究通過多方面比較改良56℃熱放散法與冷凍復(fù)融放散法對于ABO-HDFN的診斷價(jià)值。各實(shí)驗(yàn)室可結(jié)合臨床患者的緊急程度以及本實(shí)驗(yàn)室的儀器設(shè)備、耗材配置、工作人員經(jīng)驗(yàn)和時(shí)間成本等綜合考慮，選擇適合本實(shí)驗(yàn)室的方法，以助力臨床患者的診療，保障患兒生活質(zhì)量安全。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突