不同核黃素濃度與可見光光照強(qiáng)度對血漿中大腸桿菌的影響*

劉鴻 莫琴 馬榮鈉 賈堯 伍曉菲 王迅

上海市血液中心，上海 200051

血液和血液成分的輸血傳播細(xì)菌感染（transfusion-transmitted bacterial infection，TTBI）和膿毒性輸血反應(yīng)（septic transfusion reactions，STRs）是感染性輸血疾病的主要原因[1]。雖然血漿由于其凍存的環(huán)境并不利于細(xì)菌生長，因此被認(rèn)為存在細(xì)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)較小，然而血漿在制備和處理的過程中仍可能被細(xì)菌污染，如有研究發(fā)現(xiàn)在水浴箱中凍融后的血漿被檢出受到銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）的污染[2-3]，此外，F(xiàn)DA也曾在2016年報(bào)告過一起治療性血漿置換（單采血漿）被凝固酶陰性葡萄球菌（coagulase-negative staphylococci）污染導(dǎo)致受血者死亡的案例，因此受細(xì)菌污染的血漿仍可能成為受血者感染的載體[4]。

目前應(yīng)對血液和血液成分細(xì)菌污染風(fēng)險(xiǎn)的措施包括但不限于手臂消毒、初血分離、細(xì)菌培養(yǎng)、快速檢測、病原體滅活技術(shù)的應(yīng)用等[1]。其中，病原體滅活技術(shù)（pathogen reduction technology，PRT）如核黃素光化學(xué)病原體滅活系統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)證可滅活包括血漿和血小板中的多種輸血傳播病毒、致病菌和寄生蟲[5，6]；采用病原體滅活技術(shù)不僅可以彌補(bǔ)血站現(xiàn)有檢測方法的缺陷，如潛在假陰性，檢測靈敏度低等問題，其也為應(yīng)對一系列已知和未知的新發(fā)病原體提供了一種積極主動的預(yù)防策略[7]，這對提高血液安全和維持安全可靠的血液供應(yīng)都有著重要的意義。然而，我國目前尚無自主知識產(chǎn)權(quán)的針對血液成分細(xì)菌污染的病原體滅活技術(shù)，而國外商品化的病原體滅活系統(tǒng)成本高昂。因此，開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的血液成分病原體滅活系統(tǒng)就顯得尤為重要。而本研究嘗試以420 nm可見光為光源，以血液中常見的污染細(xì)菌大腸桿菌作為指示菌，血漿作為介質(zhì)載體，對不同核黃素濃度與可見光光照強(qiáng)度對血漿中大腸桿菌的影響進(jìn)行探討，以明確兩者與處理效果間存在的量效關(guān)系，從而為未來建立更完善的實(shí)驗(yàn)條件和有效性的評估提供更多數(shù)據(jù)支撐。

材料與方法

1 標(biāo)本來源

隨機(jī)抽取分裝的谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）檢測不合格的新鮮冰凍血漿作為實(shí)驗(yàn)樣本，本研究涉及的所有樣本均來自本血站的無償獻(xiàn)血者。本研究獲本中心倫理審批（編號：SBC-IRB-2022-24）。

2 試劑與儀器

核黃素（美國Sigma-Aldrich公司，批號：60K0021）；大腸桿菌（ATCC 25922）（Culti-Loops，美國Thermo Scientific公司，批號：348289，美國KwikStik公司，批號：335-557-21）；LB肉湯培養(yǎng)基（上海生工生物公司，批號：I113KA3288）；瓊脂粉（上海生工生物公司，批號：I701BA0001）； 一次性大腸桿菌培養(yǎng)皿（上海生工生物公司，批號：I505LA2421）；Costar 12孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Corning公司，批號：26421043）；一次性PVC血袋（上海輸血技術(shù)公司，批號：181229）；塑料透光擴(kuò)散板（京棣工品公司）；0.22 μm無菌濾器（冰島Millipore公司，批號：R0NB16650）；15 mL無菌離心管（美國Corning公司，批號：26421043）；10 mL無菌注射器（上海康德萊公司，批號：K20210103）；一次性涂布棒（美國Biologix公司，批號：MO002890B1203）；420 nm病原體滅活箱改裝自上海輸血技術(shù)公司，含商業(yè)性420 nm LED燈珠）；紫外輻照儀計(jì)（北京師范大學(xué)光電儀器廠）；孵育箱（日本松下公司）；生物安全柜（蘇州賽默飛世爾公司）；離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

3 方法

3.1 透光率測量

使用420 nm輻照儀檢測病原體滅活箱中LED燈珠的輻照強(qiáng)度，隨后將測試材料置于LED燈珠中央，使用420 nm 輻照儀貼于測試材料正對LED燈珠的位置檢測透光后的輻照強(qiáng)度，每個(gè)材料檢測各3次，通過計(jì)算材料透光后的平均輻照強(qiáng)度與LED燈珠自身的平均輻照強(qiáng)度百分比比值得出透光率。

3.2 核黃素儲存液制備

精確稱量9.41 mg核黃素溶于25 mL0.9%生理鹽水中，并用無菌濾器過濾，配制成1M的核黃素儲存液，儲存瓶使用錫箔紙包裹，置于4℃冰箱保存。

3.3 大腸桿菌培養(yǎng)

將大腸桿菌（ATCC 25922）原菌接種于LB固體培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)后挑取完整的單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中37℃振蕩過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后離心菌液并用生理鹽水重懸，取少量菌懸液培養(yǎng)以確定原始菌液濃度不低于107CFU/mL。

3.4 實(shí)驗(yàn)分組與光照處理

按照處理方式將實(shí)驗(yàn)分為三大類：第一類為只添加菌液但不做任何處理的對照組，第二類為只添加菌液并接受光照處理的光照組，第三類為添加菌液與核黃素并接受光照處理的實(shí)驗(yàn)組。其中實(shí)驗(yàn)組根據(jù)核黃素濃度又可細(xì)分為4個(gè)小組，即50、100、150和300 μM的核黃素濃度組，加上對照組和光照組共6組，每組樣本數(shù)為1人份。光照處理前，從光照組和各核黃素濃度組的血漿混懸液中取1 mL樣本加入12孔板并置于病原體滅活箱中分別接受420 nm可見光的光照處理，每輪光照的光照強(qiáng)度分別為50 mW/cm2、75 mW/cm2和100 mW/cm2，光照時(shí)間為55分鐘（分別在25、35、45和55分鐘取樣檢測）。

3.5 處理后大腸桿菌的檢測

從各組樣品中取0.1 mL加入0.9%生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，稀釋至10-6，每個(gè)梯度取100 μL稀釋菌液涂布在LB平板上，并置于37℃孵育箱培養(yǎng)過夜后菌落計(jì)數(shù)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5次（n=6）。

3.6 評估光照強(qiáng)度對大腸桿菌處理效果的影響

根據(jù)在各核黃素濃度下，不同光照強(qiáng)度對大腸桿菌在各時(shí)間段中的下降情況建立時(shí)間-效果曲線，評估光照強(qiáng)度與大腸桿菌處理效果的相關(guān)性。

3.7 評估核黃素濃度對大腸桿菌處理效果的影響

根據(jù)在各光照強(qiáng)度下，不同核黃素濃度對大腸桿菌各時(shí)間段中的下降情況建立時(shí)間-效果曲線，評估核黃素濃度與大腸桿菌處理效果的相關(guān)性。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7軟件統(tǒng)計(jì)結(jié)果，數(shù)據(jù)以菌落數(shù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)組與光照組中各核黃素濃度與光照強(qiáng)度對細(xì)菌處理效果是否存在顯著差異采用單因素方差分析，各因素與處理效果間的關(guān)系用Pearsons相關(guān)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 420 nm可見光的基本參數(shù)和對不同材料的透光情況

病原體滅活設(shè)備的光源經(jīng)過專業(yè)設(shè)計(jì)和光譜檢測，經(jīng)驗(yàn)證，該光源在420 nm處有一個(gè)明顯的吸收峰，因此符合實(shí)驗(yàn)的要求[8]。實(shí)驗(yàn)前對420 nm可見光對不同材料的透光情況進(jìn)行評估后發(fā)現(xiàn)（表1），培養(yǎng)皿和12孔板對420 nm可見光的透過率超過95%，因此以12孔板作為血漿光照處理的儲存容器，血漿在12孔板中的液層厚度保持在約5 mm，照射期間勻速振蕩，確保獲得均勻光照。

表1 420 nm可見光透光率情況

2 不同光照強(qiáng)度下各核黃素濃度對血漿中大腸桿菌的處理效果

血漿中的大腸桿菌在接受不同強(qiáng)度光照處理55 min后，各核黃素濃度下血漿中的大腸桿菌濃度均出現(xiàn)了不同程度的下降，下降梯度分別為1.7～3.5 log（50 mW/cm2），2.8～≥4.4 log（75 mW/cm2），4.0～≥4.7 log（100 mW/cm2），其中300 μM的核黃素濃度在各光照強(qiáng)度下都顯示出至少＞3 log的處理效果（圖1）?？傮w來看，不同光照強(qiáng)度之間對大腸桿菌的處理效果存在顯著性差異（F=16.39，P＜0.000 1），其中在50，100和150 μM核黃素濃度下，高強(qiáng)度的光照（100 mW/cm2）對大腸桿菌的處理效果要顯著高于低強(qiáng)度的光照（50 mW/cm2）（P＜0.05）。而不同的核黃素濃度組之間對大腸桿菌處理效果也存在顯著性差異（F=4.06，P=0.004 9），其中，在低強(qiáng)度光照下（50 mW/cm2），300 μM核黃素濃度對大腸桿菌的處理效果要顯著高于50 μM核黃素濃度（P＜0.05）（圖1）。

圖1 血漿中各核黃素濃度的大腸桿菌在接受不同光照強(qiáng)度光照處理55 min后的下降情況比較（n=6）

3 不同光照強(qiáng)度隨時(shí)間變化對大腸桿菌的影響

通過對上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，各組中接受光照處理的大腸桿菌下降梯度都隨著光照時(shí)間的增加而升高，而在各核黃素濃度處理下，不同的光照強(qiáng)度對大腸桿菌的影響也各不相同。高強(qiáng)度的光照（100 mW/cm2）與低強(qiáng)度光照（50 mW/cm2）相比，大腸桿菌的梯度下降更快，兩者在150 μM核黃素濃度處理光照35 min時(shí)對大腸桿菌的處理效果最大差異可達(dá)2.72 log（圖2）。

圖2 各核黃素濃度下不同光照強(qiáng)度在各時(shí)間段對大腸桿菌的影響

相關(guān)性分析顯示在各核黃素濃度下，光照強(qiáng)度與血漿中的大腸桿菌處理效果間呈較強(qiáng)的正相關(guān)（r2=0.45～1.00）（P=0.003 1～0.53）（圖3）。

圖3 各核黃素濃度下不同光照強(qiáng)度與大腸桿菌處理效果間的關(guān)系

4 不同核黃素濃度隨時(shí)間變化對大腸桿菌的影響

在特定光照強(qiáng)度下，不同核黃素濃度對大腸桿菌的處理效果也隨著光照時(shí)間的增加而增加，其中高濃度核黃素（300 μM）較低濃度核黃素（50 μM）對大腸桿菌有更好的處理效果，其在75 mW/cm2光照45分鐘時(shí)兩者對大腸桿菌處理效果上的差異可達(dá)2.22 log（圖4）。

圖4 各光照強(qiáng)度下不同核黃素濃度在各時(shí)間段對大腸桿菌的影響

相關(guān)性分析顯示在50 mW/cm2和75 mW/cm2的光照強(qiáng)度下，核黃素濃度與血漿中的大腸桿菌處理效果間呈正相關(guān)（r2=0.84和0.66，P=0.084和0.19），而在100 mW/cm2高光照強(qiáng)度下，兩者則無明顯相關(guān)性（r2=0.01，P=0.87）（圖5）。

圖5 不同光照強(qiáng)度下核黃素濃度與大腸桿菌處理效果間的關(guān)系

討 論

核黃素是一種多環(huán)平面結(jié)構(gòu)的芳香族化合物，其有四個(gè)吸收峰，其中三個(gè)在紫外光波段，1個(gè)在可見光波段。當(dāng)核黃素在符合其吸收峰的范圍內(nèi)受到光照能最大程度上激發(fā)其光化學(xué)反應(yīng)，并通過反應(yīng)中所產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移和氧化作用對病原體的核酸造成不可逆的損傷，從而阻止其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，達(dá)到滅活病原體的目的[10-11]。而紫外光因其良好的病原體滅活特性和熟知度而被廣泛應(yīng)用，如國外已投入應(yīng)用的Mirasol病原體滅活系統(tǒng)主要依賴核黃素結(jié)合廣譜紫外光（265～370 nm）對病原體進(jìn)行滅活。然而由于紫外光攜帶更高的光子能量，其在對病原體產(chǎn)生更強(qiáng)殺傷的同時(shí)也會對血液成分的功能和質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響[12-13]。此外，紫外光對塑料制品和碳?xì)浠衔镅b置的破壞也是不可忽略的問題之一[14-15]。因此，考慮使用可見光作為另一種替代光源或許可以在一定程度上彌補(bǔ)紫外光在這些方面所存在的短板。以420 nm可見光為例，其同樣處在核黃素的吸收峰之中，在被光照激活后有著和紫外光相似的光化學(xué)反應(yīng)和光照產(chǎn)物[16]；其在病原體滅活方面也有著不俗的表現(xiàn)，已有研究證實(shí)可見光可有效滅活鼠白血病病毒（MLV），HBV，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌等病原體[17-20]；另外可見光本身發(fā)射的能量較小，有助于減小對血液成分的影響[21]。因此，這些優(yōu)勢和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)為本研究的開展提供了理論支持。

根據(jù)核黃素結(jié)合紫外光實(shí)驗(yàn)方法建立的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，可能影響血液成分病原體處理效果的因素有包括光照強(qiáng)度、光照時(shí)間、核黃素濃度、細(xì)菌種類和濃度等[22-24]，這為本研究的設(shè)計(jì)提供了方法指引。為了更好地了解不同條件對核黃素可見光處理效果的影響，本研究主要對光照強(qiáng)度、光照時(shí)間、核黃素濃度進(jìn)行重點(diǎn)研究，結(jié)果證實(shí)核黃素結(jié)合420 nm可見光對血漿中的大腸桿菌有一定的處理效果，綜合來看，高強(qiáng)度的光照（100 mW/cm2）協(xié)同高濃度的核黃素（150 μM和300 μM）能夠有效降低血漿中大腸桿菌的濃度達(dá)到4 log以上。根據(jù)時(shí)間效果曲線的分析，光照強(qiáng)度對大腸桿菌的處理效果有著重要影響，在同一核黃素濃度處理組中，接受高強(qiáng)度的光照處理在各時(shí)間點(diǎn)相較于低強(qiáng)度光照大腸桿菌梯度下降速度更快，濃度差異更大，而在較高的核黃素處理組中，這種差異更為顯著，最大差異可達(dá)到2 log以上。相關(guān)性分析也證實(shí)光照強(qiáng)度與大腸桿菌的處理效果間存在明顯的正相關(guān)，即大腸桿菌的處理效果伴隨著光照強(qiáng)度的增加而增強(qiáng)。另一方面，核黃素濃度對大腸桿菌的處理效果也有一定的影響，不過這種影響范圍較窄，主要體現(xiàn)在高濃度的核黃素處理組（150和300 μM）中，在部分時(shí)間段高濃度與低濃度核黃素對大腸桿菌處理效果上的差異也可達(dá)到2 log以上。進(jìn)一步分析證實(shí)核黃素濃度與大腸桿菌的處理效果也存在一定相關(guān)性，雖然100 mW/cm2的高光照強(qiáng)度中并未體現(xiàn)出這一相關(guān)性，其原因可能是除了核黃素以外，其他物理因素如光照產(chǎn)生的熱量也對大腸桿菌產(chǎn)生了影響。值得注意的是，在一些紫外光協(xié)同核黃素的相關(guān)研究中，50μM以上濃度的核黃素對VSV的影響很小，這與本研究中可見光協(xié)同核黃素的結(jié)果存在矛盾，推測這可能是因?yàn)樽贤夤獾拇┩噶^差，而過量核黃素會阻止紫外線穿透至液體溶液的深層[25]，而可見光相較于紫外光有著更強(qiáng)的穿透力，因此能使更高濃度的核黃素發(fā)揮其病原體滅活的作用。

因此，根據(jù)目前的實(shí)驗(yàn)條件和數(shù)據(jù)，高強(qiáng)度光照協(xié)同高濃度核黃素在420 nm可見光的光照處理后可有效降低血漿中的大腸桿菌達(dá)4 log以上，這為今后進(jìn)一步評估和完善病原體滅活方法的有效性，以及開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的核黃素光化學(xué)病原體滅活技術(shù)提供了一定的理論依據(jù)。該研究也存在一些局限性，首先研究中僅使用大腸桿菌作為實(shí)驗(yàn)菌，尚未評估該方法對多種細(xì)菌的處理效果；其次，目前尚未對血液成分的功能影響進(jìn)行深入研究，根據(jù)周子瑜等人[20]的研究發(fā)現(xiàn)，在使用400～500 nm可見光對添加了1 500μM核黃素的含有HBV病毒的紅細(xì)胞進(jìn)行光照處理后能夠顯著降低病毒DNA拷貝數(shù)。同時(shí)，也未發(fā)現(xiàn)其對紅細(xì)胞的功能產(chǎn)生顯著影響，而其他相關(guān)研究也顯示，接受405 nm可見光光照（無核黃素）5 h后的血小板雖然出現(xiàn)代謝變化（葡萄糖降低，乳酸增加）和線粒體呼吸功能的降低（基礎(chǔ)呼吸，ATP產(chǎn)量，最大呼吸），不過都處在可接受范圍，且可通過添加抗氧化劑改善血小板的線粒體狀態(tài)[26]，這些積極的結(jié)果為后期的功能研究提供了良好的實(shí)踐基礎(chǔ)。最后，其他可能影響大腸桿菌處理效果的因素如細(xì)菌濃度、細(xì)菌種類、液面厚度、光照距離等并未納入本次研究的考量范圍，有必要進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突