基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討柴胡-黃芩藥對治療病毒性肺炎的作用機制

蔣總 唐芳 馬武開 姚血明 劉正奇 蘭維婭 周靜

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,貴州 貴陽 550002)

病毒性肺炎是一種可由多種病毒侵襲導(dǎo)致肺實質(zhì)炎癥的呼吸系統(tǒng)疾患[1]。因此,臨床缺乏治療病毒性肺炎安全有效藥物。中醫(yī)藥作為我國傳統(tǒng)文化的瑰寶,傳承千年而不衰,在防治疾病中起著舉足輕重的地位。著名醫(yī)家錢乙所創(chuàng)六味地黃丸、《傷寒論》所著小柴胡湯因其療效顯著,目前臨床應(yīng)用廣泛。柴胡-黃芩來源于小柴胡湯,研究[2-3]表明,小柴胡湯可降低大鼠炎癥因子表達,還可下調(diào)病毒性肺炎患者體溫,在呼吸系統(tǒng)疾病中有良好治療作用。柴胡-黃芩是小柴胡湯主要君藥,早有研究報道柴胡-黃芩配伍有較好清熱與抗病毒之功效[4],但是其作用機制仍不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過構(gòu)建“藥物成分-靶點與疾病靶點”相互作用關(guān)系,本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法探討柴胡-黃芩藥治療病毒性肺炎潛在的作用機制,為臨床應(yīng)用中醫(yī)藥治療病毒性肺炎提供依據(jù)。

1 資料與方法

(1)數(shù)據(jù)準(zhǔn)備:從TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)查找柴胡-黃芩的主要化學(xué)成分,查詢條件設(shè)置OB≥30%且DL≥0.18進行篩選,獲得有效成分和靶點蛋白。(2)藥物靶點轉(zhuǎn)換和疾病靶點的篩選:通過UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將所得藥物靶點進行標(biāo)準(zhǔn)化注釋。以“viral pneumonia”作為關(guān)鍵詞,在GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://www.omim.org/)、Pharm Gkb(https://www.pharmgkb.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)收集病毒性肺炎相關(guān)基因。將柴胡-黃芩藥對靶點基因與病毒性肺炎靶點基因互相映射篩選出共同靶點,獲得柴胡-黃芩治療病毒性肺炎的作用靶點。(3)活性成分-癌癥靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建:將柴胡-黃芩藥對學(xué)成分與病毒性肺炎靶點通過Cytoscape3.8.0建立藥物主要成分成分靶點-疾病靶點群網(wǎng)絡(luò),化合物節(jié)點度(Degree)表示藥對對應(yīng)的治療病毒性肺炎靶點個數(shù),并對Degree較大值進行分析。(4)靶蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建:將藥對-疾病相關(guān)靶點基因上傳至在線String10.0軟件(https://string-db.org/),通過設(shè)置分值高于0.9置信度進行分析數(shù)據(jù),生成靶點PPI網(wǎng)絡(luò),并且利用RStudio Version 1.2.1335對PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白繪制條形圖,進一步說明靶蛋白的核心作用。(5)GO功能富集與KEGG通路富集分析:為了說明柴胡-黃芩藥對病毒性肺炎靶點蛋白在基因功能和信號通路中的作用,本研究通過RStudio Version 1.2.1335軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)靶點蛋白進行GO、KEGG通路富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 活性化合物的篩選通過TCMSP數(shù)據(jù)庫根據(jù)篩選條件共篩選出53個活性化合物。見表1。

2.2 疾病基因篩選通過GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank數(shù)據(jù)庫搜索病毒性肺炎相關(guān)的疾病基因,最后得出GeneCards數(shù)據(jù)庫4212個基因,OMIM數(shù)據(jù)庫共91個基因,PharmGkb數(shù)據(jù)庫共6個基因,DrugBank、TTD沒有病毒性肺炎相關(guān)基因,去除重復(fù)基因后共篩選出4238個基因。見圖1。

2.3 柴胡-黃芩藥對靶點與病毒性肺炎靶點相互作用韋恩圖依據(jù)GeneCards數(shù)據(jù)庫按Relevance score≥1.0標(biāo)準(zhǔn)篩選目標(biāo)靶蛋白,通過UniProt數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換為基因名稱,把GeneCards、OMIM、PharmGkb數(shù)據(jù)庫將疾病靶基因整合,最后將柴胡-黃芩藥對與疾病靶點相關(guān)基因映射,共發(fā)現(xiàn)143個共同基因,確定為柴胡-黃芩藥對治療病毒性肺炎的靶基因。見圖2。

2.4 柴胡-黃芩藥對靶點病毒性肺炎相互作用網(wǎng)絡(luò)將藥物主要化學(xué)成分與病毒性肺炎靶點通過Cytoscape3.8.0建立藥物成分靶點-疾病靶點群網(wǎng)絡(luò),其中紅色表示柴胡,紫色表示黃芩,淺藍(lán)色表示病毒性肺炎靶點,每條邊則表示藥物活性成分與疾病靶點之間的相互作用關(guān)系(圖3)。在藥物靶點-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)中充分體現(xiàn)了其多成分、多靶點的作用特點。

圖3 柴胡-黃芩活性成分-病毒性肺炎靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 靶點PPI網(wǎng)絡(luò)、關(guān)鍵基因分析隱藏游離點后PPI網(wǎng)絡(luò)包含115個靶蛋白節(jié)點,各靶點蛋白具體連線見圖4,其中連線越多代表靶點關(guān)聯(lián)越大,再利用RStudio Version 1.2.1335根據(jù)所有所得基因進行過濾篩選得到核心基因(過濾條件基因degree≥中位值),再通過Cytoscape3.8.0進行核心基因作圖分析,重復(fù)兩次,最終得到核心基因JUN(degree=20),MAPK14(degree=16),FOS、TP53、FOS、TNF、RELA(degree=14),AKT1、MYC(degree=12),CCND1(degree=9),IL6(degree=8)。見圖5。

圖4 柴胡-黃芩治療病毒性肺炎靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

圖5 柴胡-黃芩治療病毒性肺炎關(guān)鍵基因

圖6 柴胡-黃芩GO生物過程富集柱狀圖

2.6 GO生物過程分析通過RStudio Version 1.2.1335把藥對與疾病共同靶基因symbol轉(zhuǎn)換基因ID得到136個靶基因,通過在DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO生物過程富集,根據(jù)錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05篩選出2481個GO生物過程。其中response to oxidative stress、reactive oxygen species metabolic process、response to toxic substance、response to reactive oxygen species、response to metal ion、response to molecule of bacterial origin、response to lipopolysaccharide等位于GO生物過程富集的前面。具體見6及圖7?？梢?病毒性肺炎的發(fā)生發(fā)展涉及對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、活性氧代謝過程、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、對活性氧的反應(yīng)、對金屬離子的反應(yīng)、對細(xì)菌來源的分子的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)等生物過程,而柴胡-黃芩藥對可通過調(diào)節(jié)以上生物過程來治療病毒性肺炎。

圖7 柴胡-黃芩GO生物過程富集氣泡圖

2.7 KEGG信號通路分析通過DAVID數(shù)據(jù)庫將柴胡-黃芩的136個靶基因在KEGG信號通路中富集,根據(jù)FDR<0.05篩選出與病毒性肺炎密切相關(guān)的信號通路。結(jié)果共有123個靶點基因參與KEGG富集通路,包括AGE-RAGE、IL-17、TNF signaling pathway、Human cytomegalovirus infection、C-type lectin receptor signaling pathway等信號通路,主要與氧化應(yīng)激、炎癥、病毒感染等158條信號通路相關(guān),其中每一條通路都有相對應(yīng)的通路圖,部分通路見圖8。

圖8 柴胡-黃芩藥對KEGG信號通路圖

3 討 論

病毒感染性肺炎一直是肺部感染高發(fā)病率和高死亡率的主要原因,通常在幾十年內(nèi)呈季節(jié)性變化[5-6]。在近二十年內(nèi),全世界范圍內(nèi)前后總共經(jīng)歷了6次重大病毒性感染,其中呼吸道病毒感染有4次,最近一次是自2019年至今的新型冠狀病毒肺炎,具有發(fā)病率更高、傳染性更強、受累人群更多、經(jīng)濟損失最大、侵犯地域更廣的特點,嚴(yán)重危害人類身心健康[7]。然而,病毒性肺炎的發(fā)病機制尚不清楚,導(dǎo)致臨床治療的盲目性,目前對病毒性肺炎的治療主要是對癥支持治療,由于呼吸道病毒的高度變異性、耐藥菌株的出現(xiàn)、抗病毒藥物的不良反應(yīng)導(dǎo)致許多抗病毒藥物的療效顯著降低甚至無效,給治療病毒性肺炎帶來巨大的難題。

中醫(yī)藥具有多環(huán)節(jié)、多靶點、副作用小的特點治療呼吸道疾病已有數(shù)千年,具有有獨特的優(yōu)勢。柴胡-黃芩經(jīng)典配伍見于小柴胡湯,除此之外,尚有許多柴胡黃芩配伍,如清熱解毒的普濟消毒飲,辛涼解表、解肌清熱的柴葛解肌湯等。早有研究表明[8],柴胡與黃芩配伍不僅能抑制抑制雞胚內(nèi)流感病毒,還可降低小鼠病毒性肺炎肺指數(shù)和死亡率,具有較好的抗病毒作用。此外,黃錦標(biāo)[9]在一臨床觀察中發(fā)現(xiàn),在病毒唑進行抗病毒的基礎(chǔ)上聯(lián)用柴胡和黃芩可有效增強抗病毒的效果。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得出柴胡-黃芩藥對可多靶點治療病毒性肺炎的機制研究。柴胡-黃芩藥對治療主要有53種活性成分、143個靶點和158條生物學(xué)信號通路。通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析得出藥物靶點與疾病靶點的核心基因包括JUN、MAPK14、FOS、TP53、FOS、TNF、RELA、AKT1、MYC、以及IL-6等關(guān)鍵靶點,柴胡-黃芩通過這些關(guān)鍵靶基因抑制細(xì)胞增殖、應(yīng)激、炎癥、功能同步化、凋亡等途徑從而發(fā)揮病毒性肺炎的作用。通過對GO的分析發(fā)現(xiàn)柴胡-黃芩藥對主要通過參與病毒性肺炎的氧化應(yīng)激的反應(yīng)、活性氧代謝過程、金屬離子的反應(yīng)等治療病毒性肺炎的分子機制。最后通過KEGG富集分析得出,柴胡-黃芩藥對可通過調(diào)控AGE-RAGE、IL-17、TNF signaling pathway、Human cytomegalovirus infection、C-type lectin receptor signaling pathway等信號通路介導(dǎo)的氧化應(yīng)激、炎癥、病毒感染等機制治療病毒性肺炎。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步揭示柴胡-黃芩治療病毒性肺炎的主要作用靶點以及生物學(xué)效應(yīng),但由于病毒性肺炎的發(fā)病機制尚未明確,柴胡-黃芩藥對配伍治療病毒性肺炎的用藥劑量、生物學(xué)效應(yīng)未明確,本研究僅作為理論的探討性,還需進一步的實驗進行驗證。

利益沖突說明/Conflict of Intetests

所有作者聲明不存在利益沖突。

倫理批準(zhǔn)及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本文不涉及倫理批準(zhǔn)及均知情同意。