蒙藥三子散多指標(biāo)成分的含量測(cè)定

許佳綺，劉妍妍，白云霞，劉宏，夏慧敏，張慧文*，王煥蕓*（.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 000；.濮陽(yáng)市安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院藥學(xué)部，河南 安陽(yáng) 455000；.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 0400）

中蒙藥復(fù)方制劑的成分復(fù)雜，且發(fā)揮作用的并非單一的化學(xué)成分，而是多種成分相互作用的結(jié)果。近年來(lái)，中蒙藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)已經(jīng)從單一指標(biāo)的檢測(cè)發(fā)展到基于多指標(biāo)成分的綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)，伴隨著數(shù)據(jù)量的增加，需要借助更科學(xué)的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行分析?；疑P(guān)聯(lián)度分析（grey relational analysis，GRA）是一種多因素統(tǒng)計(jì)分析的方法，此方法對(duì)數(shù)據(jù)要求較低，且計(jì)算量小，常用于中藥質(zhì)量控制、譜效分析中。逼近理想解排序法（technique for order preference by similarity to ideal solution，TOPSIS）是一種綜合評(píng)價(jià)方法，通過(guò)將多個(gè)指標(biāo)計(jì)算整合為一個(gè)綜合指標(biāo)，把多維問(wèn)題轉(zhuǎn)化為一維問(wèn)題，降低了分析過(guò)程中不同類型指標(biāo)對(duì)決策的干擾及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中人為因素產(chǎn)生的干擾，從而提高多目標(biāo)決策分析的科學(xué)性和準(zhǔn)確性[1]。TOPSIS方法與中藥指紋圖譜技術(shù)和多維分析技術(shù)的合理整合是一種綜合鑒別、客觀量化和精準(zhǔn)評(píng)價(jià)中蒙藥質(zhì)量[2-3]、藥效[4]、臨床應(yīng)用[5]的有效方法，更能清晰、準(zhǔn)確地揭示中蒙藥復(fù)雜系統(tǒng)的真實(shí)本原。

三子散現(xiàn)收載于2020年版《中國(guó)藥典》一部，為蒙古族傳統(tǒng)方劑之一，由訶子、梔子、川楝子三味藥材等量配比混合而成[6]。現(xiàn)行的三子散含量測(cè)定僅以單指標(biāo)測(cè)定有效成分沒(méi)食子酸[7]、川楝素[8]、還原糖[9]的含量為主，本課題組前期對(duì)三子散進(jìn)行研究[10-12]，發(fā)現(xiàn)其入血成分為酚酸類、鞣質(zhì)類、環(huán)烯醚萜類等化學(xué)成分?；诖?，為了更系統(tǒng)地評(píng)價(jià)三子散質(zhì)量，本試驗(yàn)在前期HPLC指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上，納入了更多能反映蒙藥三子散整體質(zhì)量屬性、與藥效關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的化合物作為復(fù)方含量測(cè)定指標(biāo)，即酚酸類（沒(méi)食子酸、咖啡酸）、環(huán)烯醚萜類（京尼平苷）、鞣質(zhì)類（訶子次酸、石榴皮鞣素、安石榴苷、柯里拉京、訶子鞣酸、1，2，3，4，6-O-沒(méi)食子酰葡萄糖、訶子林鞣酸、鞣花酸）、單萜苷類（jasminoside B）。采用HPLC技術(shù)建立上述12種成分的含量測(cè)定方法，結(jié)合GRA-TOPSIS法建立15批三子散的質(zhì)量評(píng)價(jià)模型，以期為不同批次、不同產(chǎn)地中蒙藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供更加全面、科學(xué)的參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2030C 3D型高效液相色譜儀（日本株式會(huì)社島津制作所），PX225DZH型十萬(wàn)分之一天平（奧豪斯儀器有限公司），JJ224BC型萬(wàn)分之一電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠），WK-1000A型小型高速粉碎機(jī)（濰坊市北方制藥設(shè)備制造有限公司），PF3XXXXM1型一體化超純水系統(tǒng)（英國(guó)ELGA公司）等。

1.2 試藥

對(duì)照品沒(méi)食子酸（批號(hào)：D2016091，純度：99%）、京尼平苷（批號(hào)：J2027132，純度≥98%）、咖啡酸（批號(hào)：I2002097，純度：98%）、鞣花酸（批號(hào)：K1813148，純度：96%）（阿拉丁試劑有限公司）；石榴皮鞣素（批號(hào)：M23J11S119104，純度≥98%）、訶子次酸（批號(hào)：M30GB150105，純度≥95%）、柯里拉京（批號(hào)：P25A11S122217，純度≥98%）、安石榴苷（批號(hào)：Y11S11Y124050，純度≥98%）、訶子鞣酸（批號(hào)：M29GB143373，純度≥98%）、1，2，3，4，6-O-沒(méi)食子酰葡萄糖（批號(hào)：P16M11F113433，純度≥99%）、訶子林鞣酸（批號(hào)：P24J9F53640，純度≥98%）（上海源葉生物科技有限公司）；jasminoside B（批號(hào)：P16A9F58571，純度≥98%，北京譜析科技有限公司）。甲醇、乙腈為色譜純，甲酸、磷酸為分析純，水為超純水。

訶子、梔子、川楝子單味藥飲片各15批，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)生藥教研室張慧文博士鑒定，訶子為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz.的干燥成熟果實(shí)，梔子為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果實(shí)，川楝子為楝科植物川楝MeliatoosendanSieb.et Zucc.的干燥成熟果實(shí)，均符合2020年版《中國(guó)藥典》一部標(biāo)準(zhǔn)。將各批次訶子、梔子、川楝子單味藥飲片使用粉碎機(jī)粉碎成粗粉，過(guò)40目篩，取三味藥材等比等量混勻，隨機(jī)取樣組合，即得15批三子散樣品（編號(hào)S1～S15），各單味藥飲片來(lái)源信息詳見(jiàn)表1。

表1 15批三子散中各單味藥飲片來(lái)源Tab 1 Source of each single medicine piece in 15 batches of Sanzi powder

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Ultimate LP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～5 min，1%→5%B；5～10 min，5%→13%B；10～24 min，13%→23%B；24～56 min，23%→35%B；56～78 min，35%→47%B；78～90 min，47%→85%B；90～100 min，85%→90%B；100～105 min，90%→100%B）；柱溫為30℃；流速為1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密稱取對(duì)照品訶子次酸、沒(méi)食子酸、石榴皮鞣素、安石榴苷、jasminoside B、咖啡酸、柯里拉京、京尼平苷、訶子鞣酸、1，2，3，4，6-O-沒(méi)食子酰葡萄糖、訶子林鞣酸、鞣花酸適量，置于同一量瓶中，加甲醇溶解并定容，混勻，制備成質(zhì)量濃度分別為470、250、94、1030、1320、154、540、1800、2870、450、2610、550 μg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取三子散樣品1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，搖勻，稱量，超聲提取30 min，放至室溫后再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，4℃條件避光保存，0.45 μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 缺味陰性樣品溶液 以1.2 g為處方總量，分別配制不含訶子或梔子或川楝子的缺味陰性樣品處方，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，即得各缺味陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品、供試品、缺味陰性樣品、空白溶液適量，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。供試品溶液中12種成分的色譜峰分離度良好，理論板數(shù)較高；供試品溶液與對(duì)照品溶液在相同保留時(shí)間處有對(duì)應(yīng)色譜峰，供試品溶液及各缺味陰性樣品溶液中其他成分色譜峰對(duì)12種成分測(cè)定均無(wú)干擾，空白溶液于相同保留時(shí)間處無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 三子散HPLC圖Fig 1 HPLC of Sanzi powder

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置于不同量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得一系列濃度對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄各色譜峰峰面積值（其中，安石榴苷峰面積為安石榴苷A與安石榴苷B峰面積之和）。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（μg·mL－1）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表2，12種成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表2 12種成分的回歸方程及線性范圍Tab 2 Linear regression equation and linear range of 12 components

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”混合對(duì)照品溶液適量，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，結(jié)果12種成分峰面積的RSD均在0.11%～0.46%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取三子散樣品（S14），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算12種待測(cè)成分的含量，結(jié)果12種成分含量的RSD在0.80%～2.8%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份三子散樣品（S14），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、24、48 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到12種成分峰面積的RSD在1.2%～2.8%（n＝7），表明供試品溶液于室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取各成分已知含量的三子散樣品約0.50 g，平行稱定9份，分別精密加入相當(dāng)于該樣品中各待測(cè)成分含量0.8、1.0、1.2倍量的單一成分對(duì)照品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度平行操作3份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算12種成分的平均加樣回收率及RSD。結(jié)果顯示12種成分的平均回收率為96.72%～104.07%，RSD為1.4%～2.6%（n＝3），表明本方法的準(zhǔn)確度良好。

2.4 樣品含量測(cè)定

取15批三子散樣品（S1～S15），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算12種待測(cè)成分的含量，每份樣品平行操作3次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表3。15批三子散樣品中訶子次酸、沒(méi)食子酸、石榴皮鞣素、安石榴苷、jasminoside B、咖啡酸、柯里拉京、京尼平苷、訶子鞣酸、1，2，3，4，6-O-沒(méi)食子酰葡萄糖、訶子林鞣酸、鞣花酸的平均含量分別為2.977～7.763、0.8465～2.487、0.2872～1.208、3.897～11.68、2.356～16.46、0.7995～1.444、2.492～4.870、13.28～21.39、14.50～26.46、1.766～4.165、3.406～27.50、3.064～7.078 mg·g－1。

表3 12種成分的含量測(cè)定結(jié)果(mg·g－1，n＝6)Tab 3 Content of 12 components (mg·g－1，n＝6)

2.5 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.5.1 TOPSIS分析[13-14]設(shè)有m個(gè)評(píng)價(jià)對(duì)象，n個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)（m＝1，2，……i；n＝1，2，……j），本試驗(yàn)中m＝15，n＝12，將其檢測(cè)數(shù)據(jù)構(gòu)成矩陣V，由于樣品中各測(cè)量成分含量不一，需要按照公式（1）將矩陣V進(jìn)行歸一化處理，得到矩陣Z。

注：zij表示第i個(gè)評(píng)價(jià)對(duì)象在第j個(gè)指標(biāo)上的取值。

根據(jù)歸一化矩陣結(jié)構(gòu)選出最優(yōu)方案和最劣方案，最優(yōu)方案Z＋為n個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)應(yīng)樣品的最大值最優(yōu)方案；Z－為n個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)應(yīng)樣品的最小值，具體見(jiàn)公式（2）、（3）。

按照公式（4）、（5）計(jì)算各評(píng)價(jià)對(duì)象與最優(yōu)方案和最劣方案之間的距離。

按照公式（6）計(jì)算各評(píng)價(jià)對(duì)象與最優(yōu)方案的相對(duì)接近程度（Ci），0＜Ci＜1

按照大小將各評(píng)價(jià)對(duì)象排序，Ci值越大，說(shuō)明評(píng)價(jià)對(duì)象綜合質(zhì)量越好，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 15批次三子散GRA與TOPSIS分析結(jié)果Tab 4 GRA and TOPSIS analysis of 15 batches of Sanzi powder

2.5.2 GRA[15]基于15批次三子散12種成分的含量，建立灰色模式識(shí)別數(shù)據(jù)集，由于其量綱不統(tǒng)一，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行規(guī)格化處理。設(shè)有m個(gè)樣品，每個(gè)樣本有n項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，組成評(píng)價(jià)單元序列{Xik}（i＝1，2…，m；k＝1，2，…，n），本試驗(yàn)按照公式（7）對(duì)不同批次三子散數(shù)據(jù)進(jìn)行規(guī)格化處理。

其中，Yik為規(guī)格化處理后的數(shù)據(jù)，Xik為原始數(shù)據(jù)，Xk為m個(gè)樣品第k個(gè)指標(biāo)的均值。

采用GRA進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，需要考慮最優(yōu)參考序列和最差參考序列。最優(yōu)參考序列為{Xsk}（k＝1，2，…，n）是m個(gè)樣品對(duì)應(yīng)指標(biāo)的最大值；最差參考序列為{Xtk}（k＝1，2，…，n），是m個(gè)樣品對(duì)應(yīng)指標(biāo)的最小值。

最優(yōu)參考序列關(guān)聯(lián)系數(shù)見(jiàn)公式（8）：

式中，Δmin＝min|Yik－Ysk|，Δmax＝max|Yik－Ysk|，Yik為各個(gè)成分對(duì)應(yīng)的Yik的最大值，ρ為分辨系數(shù)，通常取值0.5。

最差參考序列關(guān)聯(lián)系數(shù)見(jiàn)公式（9）：

式中，Δmin＝min|Yik－Ysk|，Δmax＝max|Yik－Ysk|，Ytk為各個(gè)成分對(duì)應(yīng)的Yik的最小值，ρ為分辨系數(shù)，通常取值0.5。

最優(yōu)參考序列關(guān)聯(lián)度見(jiàn)公式（10）：

最差參考序列關(guān)聯(lián)度見(jiàn)公式（11）：

相關(guān)關(guān)聯(lián)度見(jiàn)公式（12）：

計(jì)算各樣品的相對(duì)關(guān)聯(lián)度，并且按ri大小排序，排序結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4所示，GRA和TOPSIS分析結(jié)果基本一致，根據(jù)TOPSIS分析所得Ci值以及排序可知，排在前8位的是S12、S15、S3、S6、S1、S4、S14、S10，GRA分析所得ri值以及排序可知，排在前8位的是S15、S6、S3、S10、S14、S12、S1、S4。兩種分析結(jié)果均表明，Ci值及ri值排名均靠后的樣品是S13、S11、S7，表明這3批樣品的綜合質(zhì)量相對(duì)較差。

3 討論

3.1 含量測(cè)定指標(biāo)的選擇

蒙藥三子散由訶子、梔子、川楝子三味藥材等量配比混合而成。研究表明酚酸類沒(méi)食子酸、莽草酸，鞣質(zhì)類訶子酸、鞣花酸、黃酮類、三萜類等是訶子的主要活性成分[16]。梔子的化學(xué)成分包括環(huán)烯醚萜類京尼平苷、梔子苷，單萜苷類jasminoside B，有機(jī)酸類咖啡酸等多種化合物，其中環(huán)烯醚萜是梔子主要的生物活性成分[17]。川楝子中含有多種類型的化合物，包括三萜、木脂素、黃酮及其他類成分[18]，三萜類化合物是其發(fā)揮藥效主要的活性成分，但三萜類化學(xué)成分紫外吸收較弱或存在末端吸收，因此在本試驗(yàn)條件下訶子和梔子中的化學(xué)成分對(duì)其干擾大，難以對(duì)其準(zhǔn)確定量，同時(shí)，考慮到方中三味藥材均含有黃酮類成分，成分專屬性不強(qiáng)。在課題組前期三子散HPLC 指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別分析結(jié)果[12]，選定訶子中沒(méi)食子酸、訶子次酸、石榴皮鞣素、安石榴苷、柯里拉京、訶子鞣酸、1，2，3，4，6-O-沒(méi)食子酰葡萄糖、訶子林鞣酸、鞣花酸，梔子中京尼平苷、jasminoside B、咖啡酸這12 種含量較高的成分作為三子散含量測(cè)定的指標(biāo)成分。

3.2 結(jié)果評(píng)價(jià)

從15批三子散樣品中12種待測(cè)成分的含量測(cè)定結(jié)果來(lái)看，各成分含量均存在一定的批間差異，分析其原因可能是中蒙藥含量易受藥材產(chǎn)地、生長(zhǎng)環(huán)境、采收期等影響，導(dǎo)致其內(nèi)在質(zhì)量產(chǎn)生了很大差異。15批三子散中訶子鞣酸、京尼平苷含量較高，jasminoside B、訶子林鞣酸含量差距較大，GRA和TOPSIS分析結(jié)果基本一致，根據(jù)TOPSIS分析所得Ci值和GRA分析所得ri值可知，樣品編號(hào)為S1、S3、S4、S6、S10、S12、S14、S15在所有樣品中排名前8，這為區(qū)分不同批號(hào)的產(chǎn)品提供了一種有效的方法。

綜上所述，本研究采用HPLC法同時(shí)測(cè)定三子散中12種活性成分的含量，并嘗試將GRA分析法與 TOPSIS 數(shù)學(xué)模型結(jié)合對(duì)不同批次三子散含量檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，具有多重質(zhì)量控制效果，可以為三子散在生產(chǎn)、儲(chǔ)存及檢驗(yàn)等過(guò)程中的質(zhì)量控制提供方法和依據(jù)，為進(jìn)一步完善三子散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。