青蒿素類化合物抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展

盛思晗，沈征武1，*（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 0005；.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 0103）

青蒿素（artemisinin，見(jiàn)圖1）是20世紀(jì)70年代從傳統(tǒng)中藥菊科植物黃花蒿中分離提取的一種含有過(guò)氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯化合物，具有強(qiáng)大的抗瘧活性[1]。近年來(lái)，有大量研究報(bào)道了青蒿素及其衍生物在抗腫瘤方面的作用[2-4]。青蒿素類衍生物包括雙氫青蒿素、蒿甲醚及青蒿琥酯（見(jiàn)圖1）。目前臨床上主要使用的是蒿甲醚和青蒿琥酯。一項(xiàng)英國(guó)的隨機(jī)雙盲臨床試驗(yàn)顯示，口服青蒿琥酯片可降低結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)率，并且具有良好的耐受性[5]。對(duì)于垂體腺瘤患者，口服蒿甲醚12個(gè)月后，CT掃描顯示其腫瘤密度降低，相關(guān)癥狀和體征明顯緩解[6]。研究表明青蒿素及其衍生物具有開(kāi)發(fā)為新型抗腫瘤藥物的潛力。

圖1 青蒿素及其常見(jiàn)衍生物的結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structure of artemisinin and its common derivatives

然而，青蒿素及其衍生物的抗腫瘤機(jī)制尚未完全闡明，許多關(guān)鍵問(wèn)題仍然存在爭(zhēng)議。首先，青蒿素對(duì)腫瘤細(xì)胞特有的細(xì)胞毒性尚未被完全了解，這種特異性可能源于腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞有更高的血紅素合成能力[7]。其次，青蒿素類衍生物作用的靶標(biāo)和具體作用機(jī)制尚不明確，青蒿素可以作用于多種關(guān)鍵的生物途徑，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，其中較為關(guān)鍵的信號(hào)通路包括P38-MAPK信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路和Wnt/β-catenin信號(hào)通路[8-9]。鑒于青蒿素類衍生物的多重靶向性，可以通過(guò)高通量的研究方法對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)性探索。

1 青蒿素及其衍生物的抗腫瘤作用機(jī)制

1.1 青蒿素及其衍生物的激活

青蒿素過(guò)氧橋被激活后斷裂，產(chǎn)生大量的自由基，參與蛋白質(zhì)的烷基化[10]。過(guò)氧橋結(jié)構(gòu)對(duì)抗瘧和抗腫瘤作用至關(guān)重要。然而，激活過(guò)氧橋的確切機(jī)制仍存在爭(zhēng)議，游離亞鐵與血紅素都被認(rèn)為是過(guò)氧橋的激活劑。腫瘤細(xì)胞表達(dá)高濃度的細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，通過(guò)內(nèi)吞作用促進(jìn)血漿鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的攝取。青蒿素可通過(guò)與轉(zhuǎn)鐵蛋白共價(jià)標(biāo)記被腫瘤細(xì)胞選擇性地富集[11]。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞具有更高的細(xì)胞鐵含量，這為青蒿素的抗腫瘤特異性提供了一個(gè)合理的解釋，即腫瘤細(xì)胞的富鐵環(huán)境導(dǎo)致青蒿素的活化增強(qiáng)[2]。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)添加亞鐵血紅素的合成前體可以增加青蒿素對(duì)細(xì)胞的毒性，加入亞鐵血紅素合成抑制劑（SA）則抑制青蒿素的細(xì)胞毒性。熒光探針檢測(cè)結(jié)果顯示，青蒿素治療后的活性氧生成與血紅素合成和細(xì)胞毒性成正相關(guān)。Stockwin等[13]發(fā)現(xiàn)添加血紅素加氧酶可以抑制青蒿素二聚體的抗腫瘤活性。

蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，能快速準(zhǔn)確地解釋藥物分子作用機(jī)制。Wang等[14]利用炔烴官能化的青蒿素探針AP1（見(jiàn)圖2）與熒光染料偶聯(lián)，監(jiān)測(cè)其與瘧原蟲(chóng)蛋白的結(jié)合。只有在添加血紅素后，AP1探針才能與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合，在血紅素還原劑的存在下這種結(jié)合能力會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)。Wang等[15]在腫瘤細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)類似的激活機(jī)制，青蒿琥酯對(duì)結(jié)直腸癌（CRC）細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性是由于腫瘤細(xì)胞中血紅素合成能力的提高。添加血紅素合成前體ALA（α-氨基乙酰丙酸）可以顯著增加AP1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的毒性以及與癌蛋白的結(jié)合，進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)。Zhou等[16]使用青蒿素探針ART-yne（見(jiàn)圖2）對(duì)HeLa細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行了研究，在氯化血紅素的存在下，青蒿素探針通過(guò)共價(jià)修飾多種蛋白質(zhì)，約80種蛋白質(zhì)被富集并鑒定為青蒿素烷基化靶標(biāo)。Zhang等[17]通過(guò)化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究了青蒿素在腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制，基于游離血紅素是青蒿素類化合物的激活劑，他們?cè)O(shè)計(jì)并合成了青蒿素衍生物ART-TPP（見(jiàn)圖2），以點(diǎn)擊化學(xué)發(fā)光法證明炔基化的青蒿素探針ART-TPP-AlK（見(jiàn)圖2）中的TPP基團(tuán)可以有效地將青蒿素導(dǎo)入線粒體。與青蒿素相比，ART-TPP對(duì)腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的抑制作用。以上結(jié)果表明，血紅素在青蒿素活化中起主要作用，而不是游離亞鐵離子。這可能是青蒿素類衍生物抗腫瘤作用的分子機(jī)制之一。

圖2 青蒿素探針Fig 2 Artemisinin probes

青蒿素被激活后產(chǎn)生活性氧自由基（ROS），其包括羥基、超氧物和過(guò)氧化氫[18]，ROS可以誘導(dǎo)細(xì)胞膜、DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的損傷，在細(xì)胞自噬、凋亡和周期阻滯中起重要作用[19-20]。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞抗氧化酶的表達(dá)水平比正常細(xì)胞低，因此對(duì)ROS損傷更為敏感。由此推測(cè)青蒿素的抗腫瘤作用可能依賴于ROS的產(chǎn)生[21]。Mercer等[22]發(fā)現(xiàn)，用青蒿琥酯處理HeLa細(xì)胞16 h后，細(xì)胞中ROS水平增加，48 h后細(xì)胞毒性作用才出現(xiàn)，該實(shí)驗(yàn)表明ROS損傷是青蒿琥酯對(duì)抗腫瘤作用的起點(diǎn)。Greenshields等[23]發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯處理的卵巢癌細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的ROS誘導(dǎo)和細(xì)胞增殖周期阻滯。其中ROS依賴性細(xì)胞增殖周期阻滯于G2/M期，而非ROS依賴性細(xì)胞周期阻滯于G1期。不同的細(xì)胞周期阻滯取決于卵巢癌細(xì)胞暴露的青蒿琥酯濃度。Wang等[24]發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素可以通過(guò)誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，使K562細(xì)胞內(nèi)線粒體功能紊亂并引發(fā)細(xì)胞自噬。然而Lu 等[25]的研究表明雙氫青蒿素誘導(dǎo) HL-60 細(xì)胞線粒體損傷和細(xì)胞凋亡是通過(guò)激活p38 MAPK信號(hào)通路，而與 ROS 無(wú)關(guān)，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi) ROS 的含量沒(méi)有變化，并且雙氫青蒿素在不同細(xì)胞內(nèi)不一定都能產(chǎn)生 ROS，可能與細(xì)胞的不同生物學(xué)背景有關(guān)，青蒿素及其衍生物的活性氧機(jī)制仍在研究中。

1.2 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯

細(xì)胞周期紊亂和失控性生長(zhǎng)幾乎是所有腫瘤的共同特征[26]。青蒿素及其衍生物能夠調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。Mondal等[27]研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生G0/G1期細(xì)胞周期阻滯，并推測(cè)這可能是通過(guò)下調(diào)G0/G1期細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1和CDK4的表達(dá)，上調(diào)周期蛋白p21Waf1/Cip1的表達(dá)，從而影響細(xì)胞有絲分裂，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。雙氫青蒿素在體內(nèi)外顯著抑制HCT116、DLD1和RKO細(xì)胞的增殖，全基因組RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞周期途徑中，包括CDK1、CCNB1和PLK1。分子對(duì)接結(jié)果表明雙氫青蒿素與CDK1/CCNB1復(fù)合物之間存在較強(qiáng)的結(jié)合[28]。青蒿琥酯可以通過(guò)下調(diào)CDK2、CDK4、Cyclin D1、Cyclin B1的表達(dá)，將膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系A(chǔ)172、U87、U251的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期[29]。青蒿琥酯劑量依賴性地抑制BRL-3A和AML12小鼠肝細(xì)胞的增殖，使得其細(xì)胞增殖周期阻滯于G0/G1期。Western blot結(jié)果顯示青蒿琥酯可誘導(dǎo)CDK2、CDK4、Cyclin D1和Cyclin E1顯著下調(diào)[30]。上述研究顯示，青蒿素類衍生物在不同的腫瘤細(xì)胞系中可以導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯發(fā)生在G0/G1或G2/M期，具體取決于細(xì)胞系的差異。

1.3 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡過(guò)程，旨在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。青蒿素類衍生物主要通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其敏感性與腫瘤細(xì)胞中抗凋亡基因和促凋亡基因的表達(dá)水平相關(guān)。大量研究已經(jīng)報(bào)道，青蒿素類衍生物在多種腫瘤細(xì)胞中具有顯著的凋亡誘導(dǎo)作用。Jamalzadeh等[31]發(fā)現(xiàn)經(jīng)青蒿琥酯處理的乳腺癌細(xì)胞中，caspase-8、caspase-9、caspase-3的水平顯著升高，表明青蒿琥酯通過(guò)內(nèi)源性和外源性半胱氨酸蛋白酶依賴途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)。另外，Xiao等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，在A-253細(xì)胞中，青蒿素上調(diào)了Bax、Bim、Bad、Bak蛋白的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL的表達(dá)，并釋放了細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。此外，青蒿素還可以增加ROS的生成，進(jìn)一步激活促凋亡蛋白PARP1和caspase-3，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。雙氫青蒿素對(duì)Jurkat淋巴瘤細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，細(xì)胞凋亡率與藥物濃度成正相關(guān)。Western blot分析結(jié)果顯示，凋亡相關(guān)基因p53、c-caspase3、Bax和cPARP的蛋白表達(dá)顯著增加，Bcl-2蛋白表達(dá)則降低[33]。青蒿素衍生物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡可能是其有效的作用機(jī)制之一。

1.4 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬

自噬是細(xì)胞為清除功能失調(diào)的細(xì)胞器或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)而進(jìn)行的進(jìn)化保守過(guò)程[34]。自噬通過(guò)清除受損細(xì)胞和細(xì)胞器，發(fā)揮機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，從而限制細(xì)胞增殖。在惡性腫瘤發(fā)生的早期階段，自噬發(fā)揮抑制腫瘤的作用。Li等[35]的研究發(fā)現(xiàn)，在上皮性卵巢癌中，青蒿素可通過(guò)誘導(dǎo)自噬來(lái)干預(yù)細(xì)胞周期相關(guān)的NF-κB信號(hào)通路，使腫瘤細(xì)胞周期停滯于G2/M期，從而抑制其生長(zhǎng)。雙氫青蒿素可促進(jìn)人舌鱗腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，經(jīng)雙氫青蒿素處理后的腫瘤細(xì)胞中，自噬體形成標(biāo)志蛋白（LC3-Ⅲ）和自噬起始因子（Beclin-1）的表達(dá)明顯增加[36]。經(jīng)青蒿琥酯處理的惡性淋巴瘤細(xì)胞中，可以觀察到自噬小體出現(xiàn)，并且自噬相關(guān)蛋白Beclin-1及LC3-Ⅰ/Ⅱ的表達(dá)也增加[37]。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是自噬的經(jīng)典負(fù)調(diào)控途徑，雙氫青蒿素通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，來(lái)促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞自噬，并抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖[38]。青蒿素類衍生物能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡，如腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞等[39-40]。

1.5 抑制腫瘤血管生成

血管生成在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起重要作用。青蒿素類衍生物能夠通過(guò)調(diào)節(jié)不同癌細(xì)胞株的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）來(lái)抑制血管生成。在血管生成調(diào)節(jié)因子中，VEGF及其受體（VEGFR2和VEGFR1）都是生理和病理?xiàng)l件下最有效的血管生成刺激因子。Verma等[41]通過(guò)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)證明，青蒿琥酯能下調(diào)β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)傳導(dǎo)，降低VEGF及基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）等血管生成標(biāo)志物的水平，抑制血管生成，發(fā)揮抗腫瘤作用。雙氫青蒿素通過(guò)上調(diào)ETS-1轉(zhuǎn)錄因子抑制VEGFR1介導(dǎo)的促血管生成反應(yīng)，誘導(dǎo)VEGFR1的表達(dá)[42]。因此，青蒿素類衍生物通過(guò)抑制血管生成相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的促血管生成作用。因此，青蒿素類衍生物通過(guò)抑制血管生成相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的促血管生成作用。

1.6 降低腫瘤細(xì)胞耐藥性

腫瘤化療受到藥物毒性和腫瘤耐藥性的限制，其中多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）最為常見(jiàn)。MDR表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)游離的細(xì)胞毒性藥物濃度較低，這通常與蛋白膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)，如P-糖蛋白（ABCB1/MDR1/P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRPs）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP/ABCG2）和肺耐藥蛋白等，它們通過(guò)三磷酸腺苷（ATP）將藥物排出細(xì)胞外，從而降低藥物功效[43]。青蒿素與傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物作用機(jī)制不同，不會(huì)出現(xiàn)交叉耐藥，并且可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多重耐藥。Zhang等[44]研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素可以抑制腫瘤細(xì)胞中P-糖蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。青蒿素類衍生物還可以增加多藥耐藥的腫瘤細(xì)胞中吡柔比星和阿霉素的細(xì)胞毒性[45]。食管癌組織中ABCG2的異常高表達(dá)與食管癌的多藥耐藥有關(guān)。研究顯示青蒿琥酯可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中ABCG2的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)食管癌的耐藥性[46]。青蒿素衍生物還可抑制轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，當(dāng)與其他化療藥物聯(lián)合使用時(shí)，可增加細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度，從而在一定程度上緩解腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。青蒿素類衍生物顯示出降低腫瘤細(xì)胞耐藥性的潛力，可通過(guò)抑制耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)化療藥物的療效，有可能為腫瘤治療提供新的策略和途徑。

1.7 免疫調(diào)節(jié)作用

腫瘤免疫治療旨在激發(fā)或調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的活性，以控制和殺傷腫瘤細(xì)胞。然而，近年來(lái)部分腫瘤免疫治療的效果并不理想，其中一部分原因是機(jī)體未能產(chǎn)生免疫應(yīng)答或免疫抑制[47]。有研究表明，青蒿素在不同的疾病模型可能具有雙向調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用[48]。青蒿素通過(guò)促進(jìn)T細(xì)胞活化和抑制腫瘤中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）及髓系抑制細(xì)胞（MDSCs）的免疫抑制來(lái)抑制4T1腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)[49]。適當(dāng)濃度的雙氫青蒿素有助于T細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)胰腺癌細(xì)胞的殺傷活性，其機(jī)制可能是通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)穿孔素、顆粒酶B和IFN-γ的分泌來(lái)提高T細(xì)胞的抗腫瘤活性[50]。雙氫青蒿素-熊去氧膽酸偶聯(lián)物可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，并且在裸鼠的A549異種移植瘤和小鼠的Lewis肺癌模型中也顯示出體內(nèi)抗腫瘤活性[51]。進(jìn)一步的研究表明該化合物可以抑制PI3K/Akt、NF-κB和MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而抑制T細(xì)胞的增殖與激活，抑制IFN-γ的產(chǎn)生，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的免疫抑制活性，因而具有治療自身免疫性疾病的潛力[52]。由于PI3K/Akt、NF-κB和MAPK信號(hào)通路不僅與細(xì)胞免疫相關(guān)，也與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。因此，青蒿素類化合物有可能是與上述信號(hào)通路共同的調(diào)節(jié)因子結(jié)合，而表現(xiàn)出腫瘤抑制和免疫抑制的雙重活性。同樣，青蒿琥酯可抑制NF-κB、PI3K/Akt、JAK/STAT和MAPK通路，具有治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和潰瘍性結(jié)腸炎等自身免疫性疾病的潛力[53]。雙氫青蒿素對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠的Treg/Th17具有免疫調(diào)節(jié)作用，通過(guò)恢復(fù)Treg/Th17平衡來(lái)減輕系統(tǒng)性紅斑狼瘡癥狀[54]。因此，通過(guò)對(duì)青蒿素作用機(jī)制的深入研究，有可能開(kāi)發(fā)出治療腫瘤及自身免疫性疾病的新型青蒿素類藥物[55]。

2 總結(jié)

青蒿素類化合物在體內(nèi)外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中，展現(xiàn)出高效和廣譜的抗腫瘤效果。然而，關(guān)于青蒿素類化合物的抗腫瘤作用機(jī)制存在眾多且復(fù)雜的觀點(diǎn)，有些觀點(diǎn)甚至相互矛盾。綜合文獻(xiàn)報(bào)道，青蒿素類化合物主要的抗腫瘤作用機(jī)制包括產(chǎn)生ROS損傷、阻滯腫瘤細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞血管生成，從而減少腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。至于青蒿素類化合物究竟是以某種特定作用機(jī)制為主，還是通過(guò)多種作用機(jī)制共同發(fā)揮抗腫瘤作用，仍需進(jìn)一步研究。與傳統(tǒng)化療藥物相比，青蒿素類化合物具有降低腫瘤耐藥性和調(diào)節(jié)腫瘤免疫的潛力，這可能成為未來(lái)研究的重點(diǎn)。然而，在臨床實(shí)踐中，青蒿素類化合物作為抗腫瘤藥物的使用案例相對(duì)較少。此外，青蒿素類化合物產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)的靶蛋白尚未明確，通過(guò)結(jié)合化學(xué)生物學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，可以更好地了解青蒿素類化合物的細(xì)胞和分子機(jī)制，有可能發(fā)現(xiàn)青蒿素類化合物治療腫瘤的真正作用靶點(diǎn)，這對(duì)于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)青蒿素類抗腫瘤藥物具有重要意義。