UPLC-Q-TOF-MS/MS法快速鑒定加味八珍益母膏化學(xué)成分

王英力，楊欣欣，2，3，李天嬌，2，3，王帥，2，3*，包永睿，2，3*，孟憲生，2，3（.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 6600；2.遼寧省中藥多維分析專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，遼寧 大連 6600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 6600）

加味八珍益母膏來自滿藥“加味八珍益母湯”，由滿族的益母草膏和清宮秘方八珍湯再結(jié)合桃仁、丹參、紅花等幾味活血藥組成[1]。具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、祛瘀調(diào)經(jīng)的功效，能夠較好地改善患者盆腔循環(huán)功能，調(diào)節(jié)卵巢功能，增加子宮內(nèi)膜厚度，且無肝腎毒性[2-3]，臨床上常被用于治療宮寒、痛經(jīng)等疾病[4]。目前關(guān)于加味八珍益母研究的相關(guān)文獻(xiàn)多為臨床治療、癥候分型等方面，關(guān)于化學(xué)成分分析及質(zhì)量控制的文獻(xiàn)較少，且《中國藥典》中相關(guān)質(zhì)量控制為采用高效液相色譜法測定其中1個(gè)成分。加味八珍益母膏由15味藥材加工而成，僅對(duì)其中的1～2個(gè)成分進(jìn)行含量測定的質(zhì)量控制具有一定片面性，所以本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)加味八珍益母膏的化學(xué)成分進(jìn)行快速識(shí)別，擬結(jié)合后續(xù)藥效實(shí)驗(yàn)及質(zhì)量控制方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，確定加味八珍益母膏潛在的質(zhì)量標(biāo)志物，以期為加味八珍益母膏更加全面的質(zhì)量控制研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1290 UPLC-6500 Q-TOF 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配置 MassHunter 質(zhì)譜工作站和 Mass analysis質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）；T-124/85S型電子天平（美國康州HZ電子科技有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸益母草堿（批號(hào)：111823-201202）、鹽酸水蘇堿（批號(hào)：110754-201111）、人參皂苷Re（批號(hào)：110754-200320）、人參皂苷Rg1（批號(hào)：110703-201530）、金絲桃苷（批號(hào)：111521-201507）、阿魏酸（批號(hào)：1107773-201915）（中國食品藥品檢定研究院）；異甘草苷（批號(hào)：wkq21021906）、芹菜素（批號(hào)：wkq18010301）、洋川芎內(nèi)酯H（批號(hào)：wkq21012907）、咖啡酸（批號(hào)：WP22101809）、肉豆蔻酸（批號(hào)：wkq19040812）、L-苯丙氨酸（批號(hào)：wkq18070501）、丹參素（批號(hào)：WP22120203）、毛蕊花糖苷（批號(hào)：WP22101809）、美迪紫檀素（批號(hào)：wkq20070203）、綠原酸（批號(hào)：wkq23022707）（成都維克奇生物科技有限公司）；芍藥苷（批號(hào)：151120，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）。所有對(duì)照品純度均＞98%。

加味八珍益母膏（批號(hào)：20220904，丹東藥業(yè)集團(tuán)有限公司，規(guī)格：150 mL/瓶）；LC-MS級(jí)甲醇、LC-MS級(jí)乙腈（德國Darmstadt公司）；LC-MS級(jí)甲酸（美國Fisher公司）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 方法

2.1 色譜條件

Agilent Poroshell SB-C18（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）色譜柱，正離子模式：流動(dòng)相0.2%甲酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～30 min，5%～100%B；30～35 min，100%B），流速0.4 mL·min－1，柱溫30℃，進(jìn)樣量0.5 μL。負(fù)離子模式下流動(dòng)相為純水（A）-甲醇（B），其他條件同正離子模式。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離離子源，干燥氣體溫度：250℃，干燥氣體流速：11 mL·min－1，霧化器：45 psi，鞘氣溫度：350℃，鞘氣流量：11 mL·min－1，碎裂電壓：125 V，正、負(fù)離子模式下的毛細(xì)管電壓分別為4000 V、3500 V，噴嘴電壓：500 V，質(zhì)量范圍50～1200m/z，采樣頻率為1 spentra/s。二級(jí)質(zhì)譜碰撞電壓為20 eV和40 eV。

2.3 供試品溶液的制備

量取加味八珍益母膏10 mL，置100 mL具塞錐形瓶中，加入40 mL 50%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲30 min（功率200 W，頻率40 kHz），放冷后稱重，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，混勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液于進(jìn)樣瓶中。分別稱取益母草、甘草、茯苓、人參、澤蘭、桃仁（制）、紅花、當(dāng)歸、熟地黃、川芎、赤芍、丹參、香附（制）、（炒）白術(shù)、炮姜粉末約2 g，置50 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL 50%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲30 min（功率200 W，頻率40 kHz），放冷后稱重，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，混勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.4 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取鹽酸益母草堿3.23 mg、鹽酸水蘇堿2.12 mg、金絲桃苷2.56 mg、阿魏酸2.44 mg、異甘草苷2.06 mg、人參皂苷Re 2.36 mg、人參皂苷Rg12.08 mg、芹菜素3.34 mg、洋川芎內(nèi)酯H 2.64 mg、芍藥苷2.64 mg、咖啡酸3.36 mg、肉豆蔻酸2.62 mg、L-苯丙氨酸2.58 mg、丹參素2.68 mg、毛蕊花糖苷2.88 mg、美迪紫檀素2.52 mg、綠原酸2.32 mg，分別置于10 mL量瓶中，甲醇定容。分別吸取各對(duì)照品溶液500 μL于10 mL量瓶中，甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度分別為16.15、10.60、12.80、12.20、10.30、11.80、10.40、16.70、13.20、13.20、16.80、13.10、12.90、13.40、14.40、12.60、11.60 μg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.5 數(shù)據(jù)處理

通過TCMSP、PubChem等數(shù)據(jù)庫以及文獻(xiàn)查找的方式收集已知的加味八珍益母膏中15味藥材的化學(xué)成分信息，以化合物名稱、化學(xué)式以及化合物相對(duì)分子質(zhì)量為基本信息通過PCDL建立加味八珍益母膏化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜信息中的保留時(shí)間，采用Target模式對(duì)加味八珍益母膏提取液成分信息進(jìn)行掃描。使用MassHunter和PCDL進(jìn)行了質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理，包括提取離子色譜圖和計(jì)算元素組成，質(zhì)量誤差在10 ppm以內(nèi)，根據(jù)質(zhì)譜信息、保留時(shí)間結(jié)合對(duì)照品與相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)加味八珍益母膏中的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定。

3 結(jié)果

3.1 加味八珍益母膏中化學(xué)成分的鑒定

將加味八珍益母膏供試品溶液進(jìn)行UPLC-QTOF-MS/MS分析，得到正、負(fù)離子模式下的總離子流圖見圖1。混合對(duì)照品正、負(fù)離子模式下的總離子流圖見圖2、3。通過MassHunter 質(zhì)譜工作站和Mass analysis質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析各化合物可能產(chǎn)生的碎片信息，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)分析從而對(duì)化合物進(jìn)行鑒定；同法對(duì)15味藥材的供試品溶液進(jìn)行分析，根據(jù)各成分的來源進(jìn)行藥材歸屬。結(jié)果共鑒定和推測出140個(gè)化學(xué)成分，正離子模式下鑒定出65個(gè)化學(xué)成分，其中益母草11個(gè)，白術(shù)（炒）2個(gè)，赤芍3個(gè)，川芎11個(gè)，丹參5個(gè)，當(dāng)歸7個(gè)，甘草7個(gè)，紅花4個(gè)，炮姜8個(gè)，人參3個(gè)，熟地黃9個(gè)，澤蘭2個(gè)，見表1[5-24]。負(fù)離子模式下鑒定出83個(gè)化學(xué)成分，其中益母草16個(gè)，白術(shù)（炒）4個(gè)，赤芍10個(gè)，川芎10個(gè)，丹參9個(gè)，當(dāng)歸7個(gè)，茯苓2個(gè)，甘草4個(gè)，紅花14個(gè)，炮姜3個(gè)，人參5個(gè)，熟地黃14個(gè)，桃仁（制）3個(gè)，香附（制）3個(gè)，澤蘭9個(gè)，見表2[5-8，10-20，24-32]。其中正、負(fù)離子模式下鑒定出的共有化學(xué)成分有8個(gè)，分別為3，4，5-三甲氧基苯甲酰胺、焦谷氨酸、梓醇、鳥苷、馬錢素、煙花苷、芹菜素、脫咖啡?；锘ㄌ擒?，且一些成分同時(shí)存在于不同藥材中。

圖1 加味八珍益母膏正離子（A）及負(fù)離子（B）模式下的總離子流圖Fig 1 Total ion flow diagram of Jiawei Bazhen Yimu ointment in positive ion（A）and negative ion（B）mode

圖2 混合對(duì)照品正離子模式下的總離子流圖Fig 2 Total ion flow diagram of mixed reference in positive ion mode

圖3 混合對(duì)照品負(fù)離子模式下的總離子流圖Fig 3 Total ion flow diagram of mixed reference in negative ion mode

表1 正離子模式下加味八珍益母膏的化學(xué)成分解析Tab 1 Chemical components of Jiawei Bazhen Yimu ointment in the positive ion mode

續(xù)表1

表2 負(fù)離子模式下加味八珍益母膏的化學(xué)成分解析Tab 2 Chemical components of Jiawei Bazhen Yimu ointment in negative ion mode

續(xù)表2

3.2 化合物的裂解規(guī)律分析

3.2.1 有機(jī)酸及其衍生物類 有機(jī)酸類是一類具有酸性的有機(jī)化合物，在MS裂解過程中主要產(chǎn)生H2O、CO2、CO等碎片離子[32]，如沒食子酸、苯甲酸、香莢蘭酸、阿魏酸、油酸、L-苯丙氨酸、丹參素、6-姜二酮。以沒食子酸為例，準(zhǔn)分子離子峰為m/z169.0141 [M-H]－，其脫羧基后生成二級(jí)碎片離子m/z125.0214 [M-H-CO2]－。結(jié)合文獻(xiàn)[8]報(bào)道，該碎片與沒食子酸的理論裂解碎片相似度較高，推測該化合物可能為沒食子酸，其可能的裂解途徑見圖4。

圖4 沒食子酸可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig 4 Possible mass spectrometry fragmentation pathway of gallic acid

3.2.2 黃酮類 黃酮類化合物本身具有2-苯基色原酮母核結(jié)構(gòu)，在MS裂解過程中主要丟失中性的CO和H2O，或是發(fā)生RDA裂解，其中黃酮苷類化合物則更多脫掉糖基，如果化合物中存在甲氧基，則首先發(fā)生甲基丟失，然后可能會(huì)發(fā)生碳環(huán)丟失CO碎片等[33]。如7-羥基香豆素、10-姜酚、芒柄花苷、芹菜素、羥基紅花黃色素A、甘草苷、山柰酚-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷、金絲桃苷、異槲皮苷、山柰酚-3-O-槐糖苷、木犀草苷，以甘草苷為例，準(zhǔn)分子離子峰為m/z417.1186[M-H]－，其產(chǎn)生的特征二級(jí)離子碎片m/z255.0666，135.0079分別為m/z417.1186脫掉一分子Glu后繼續(xù)脫掉一分子C7H6O2產(chǎn)生的，即m/z255.0666[M-H-Glu]－，和m/z135.0079[M-H-Glu-C7H6O2]－，結(jié)合文獻(xiàn)[5]報(bào)道，該碎片與甘草苷理論裂解碎片相似度較高，推測該化合物為甘草苷，其可能的裂解途徑見圖5。

圖5 甘草苷可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig 5 Possible mass spectrometry fragmentation pathway of liquiritin

3.2.3 生物堿類 生物堿類化合物是一種含氮有機(jī)物，生理活性較強(qiáng)，主要由芳香體系組成，具有較多環(huán)系，分子結(jié)構(gòu)緊密，不易裂解，在MS裂解過程一般發(fā)生在側(cè)鏈或者取代基上[34]。如鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿、葫蘆巴堿，以鹽酸水蘇堿為例，準(zhǔn)分子離子峰為m/z144.1027[M＋H]＋，其失去一分子C3H10N后生成二級(jí)碎片離子m/z84.9597[M＋H-C3H10N]＋。結(jié)合文獻(xiàn)[6]報(bào)道及對(duì)照品比對(duì)，該碎片與鹽酸水蘇堿對(duì)照品的裂解規(guī)律一致，推測該化合物為鹽酸水蘇堿，其可能的裂解途徑見圖6。

圖6 鹽酸水蘇堿可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig 6 Possible mass spectrometry fragmentation pathway of stachydrine hydrochloride

3.2.4 糖及糖苷類 糖及糖苷類化合物通常為羰基糖的衍生物通過糖的半縮醛（酮）羥基脫水縮合與另一種非糖物質(zhì)結(jié)合的產(chǎn)物。C-糖苷類化合物在MS裂解過程中首先在糖元內(nèi)部進(jìn)行裂解，O-糖苷類化合物則通常在糖苷鍵位置發(fā)生裂解。如毛蕊花糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹糖甘草苷、6-羥基山柰酚-3-O-β-蕓香糖-6-Oβ-D-葡萄糖苷，以毛蕊花糖苷為例，準(zhǔn)分子離子峰為m/z623.1978[M-H]－，其產(chǎn)生m/z461.1397、315.1088、179.0325、161.0239的二級(jí)碎片離子，m/z461.1397為m/z623.1978[M-H]－失去一分子咖啡酰生成的，即m/z461.1397[M-H-C9H6O3]－，m/z315.1088為m/z461.1397脫掉一分子鼠李糖生成的，即m/z315.1088[M-H-C9H6O3-Rha]－，m/z179.0325為產(chǎn)生的咖啡酸碎片離子，m/z161.0239為咖啡酸脫一分子水生成的。結(jié)合文獻(xiàn)[7]報(bào)道及對(duì)照品比對(duì)，該碎片與毛蕊花糖苷對(duì)照品的裂解規(guī)律一致，推測該化合物為毛蕊花糖苷，其可能的裂解途徑見圖7。

圖7 毛蕊花糖苷可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig 7 Possible mass spectrometry fragmentation pathway of acteoside

3.2.5 萜類 萜類化合物由甲戊二羥酸衍生而來，其基本結(jié)構(gòu)單元為異戊二烯[35]。在MS裂解過程中主要表現(xiàn)為脫掉取代基、糖苷鍵斷裂、羥基脫落等。如梓醇、芍藥內(nèi)酯苷、馬錢素、地黃苷、丹參新酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、隱丹參酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ。以白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ為例，準(zhǔn)分子離子峰為m/z247.1339 [MH]－，脫掉一分子H2O后繼續(xù)脫掉一分子C4H8生成二級(jí)碎片離子分別為m/z229.0993 [M-H-H2O]－與m/z173.0233[M-H-H2O-C4H8]－，結(jié)合文獻(xiàn)[23]報(bào)道及對(duì)照品比對(duì)，該碎片與白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品的裂解規(guī)律一致，推測該化合物可能為白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，其可能的裂解途徑見圖8。

圖8 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig 8 Possible mass spectrometry fragmentation pathway of atractylolactone Ⅲ

3.2.6 其他類 加味八珍益母膏中還含有苯乙醇（苷）類、酰胺類、苯和取代衍生物等其他類化合物。以洋川芎內(nèi)酯H為例，準(zhǔn)分子離子峰為m/z247.0938[M＋Na]＋，其產(chǎn)生的二級(jí)碎片離子m/z201.9285為m/z247.0938[M＋Na]＋脫掉一分子H2O和一分子CO生成的，即m/z201.9285 [M＋Na-H2O-CO]＋，二級(jí)碎片離子m/z141.9709為m/z201.9285 [M＋Na-H2O-CO]＋脫掉一分子H2O和一分子C3H6生成的，即m/z141.9709[M＋Na-H2OCO-H2O-C3H6]＋，結(jié)合文獻(xiàn)[7]報(bào)道及對(duì)照品比對(duì)，該碎片與洋川芎內(nèi)酯H對(duì)照品的裂解規(guī)律一致，推測該化合物可能為洋川芎內(nèi)酯H，其可能的裂解途徑見圖9。

圖9 洋川芎內(nèi)酯H可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig 9 Possible mass spectrometry fragmentation pathway of senkyunolide H

4 討論

本試驗(yàn)通過UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，建立加味八珍益母膏正、負(fù)離子模式下的化學(xué)輪廓譜，對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分析，共鑒定出140個(gè)化學(xué)成分，其中鹽酸益母草堿、鹽酸水蘇堿、金絲桃苷、阿魏酸、異甘草苷、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、芹菜素、洋川芎內(nèi)酯H、芍藥苷、咖啡酸、肉豆蔻酸、L-苯丙氨酸、丹參素、毛蕊花糖苷、美迪紫檀素、綠原酸17種化學(xué)成分經(jīng)過對(duì)照品比對(duì)，其他成分為結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)分析得到。140個(gè)成分包括有機(jī)酸及其衍生物類成分48個(gè)，黃酮類成分32個(gè)，生物堿類成分4個(gè)，糖及糖苷類成分10個(gè)，萜類成分19個(gè)，其他類成分27個(gè)。有機(jī)酸及其衍生物類成分在MS裂解過程中主要脫掉H2O、CO2、CO等碎片離子。黃酮類成分在MS裂解過程中主要丟失中性的CO和H2O，其中黃酮苷類化合物則更多的是脫掉糖基。生物堿類成分分子結(jié)構(gòu)緊密，不易裂解，在MS裂解過程一般發(fā)生在側(cè)鏈或者取代基上。糖及糖苷類成分在MS裂解過程中首先在糖元內(nèi)部進(jìn)行裂解，O-糖苷類化合物則通常在糖苷鍵位置發(fā)生裂解。萜類成分在MS裂解過程中主要表現(xiàn)為脫掉取代基、糖苷鍵斷裂、羥基脫落。

加味八珍益母膏的主要功效為補(bǔ)氣養(yǎng)血、祛瘀調(diào)經(jīng)，臨床上常用于治療女性經(jīng)期前后及經(jīng)期疾病，如氣血不足或氣滯血瘀引起的經(jīng)期后移、痛經(jīng)、頭痛等疾病[3]。加味八珍益母膏中阿魏酸、丹參素、山柰酚-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷、異甘草素、毛蕊花糖苷、苦杏仁苷、蒼術(shù)酮可以調(diào)節(jié)體內(nèi)環(huán)氧化酶（COX-2）、一氧化氮合成酶、白細(xì)胞介素（IL）-12、IL-6等蛋白與炎癥因子的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛的作用[36-46]；阿魏酸能夠調(diào)節(jié)子宮催產(chǎn)素水平[36]，鹽酸益母草堿、鹽酸水蘇堿具有抗炎的功效，能夠調(diào)節(jié)子宮收縮的頻率和張力，調(diào)節(jié)子宮雌二醇水平[47-48]；芍藥苷對(duì)急性盆腔炎大鼠有明顯抗炎作用，可減輕其子宮組織病變[45]；蒼術(shù)酮能夠降低醋酸致小鼠扭體反應(yīng)[46]，從而發(fā)揮治療痛經(jīng)的功效；丹參素、毛蕊花糖苷、梓醇、洋川芎內(nèi)酯H具有抗凝、抗血小板聚集的作用[37-38，49-50]，從而發(fā)揮活血補(bǔ)血的作用；丹參素、甘草苷、鹽酸益母草堿、鹽酸水蘇堿、異甘草苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯H、毛蕊花糖苷、蒼術(shù)酮、梓醇具有抗炎鎮(zhèn)痛、活血補(bǔ)血等功效。以上成分與加味八珍益母膏補(bǔ)氣養(yǎng)血、祛瘀調(diào)經(jīng)、治療痛經(jīng)的作用關(guān)系緊密，可作為其潛在的質(zhì)量標(biāo)志物。

本次研究對(duì)加味八珍益母膏的化學(xué)成分進(jìn)行解析，共鑒定出140個(gè)化合物，其中益母草27個(gè)，白術(shù)（炒）6個(gè)，赤芍13個(gè)，川芎21個(gè)，丹參14個(gè)，當(dāng)歸14個(gè)，茯苓2個(gè)，甘草11個(gè)，紅花18個(gè)，炮姜11個(gè)，人參8個(gè)，熟地黃23個(gè)，桃仁（制）3個(gè)，香附（制）3個(gè)。鑒定出與補(bǔ)氣養(yǎng)血、祛瘀調(diào)經(jīng)、治療痛經(jīng)功效相關(guān)性較大的成分，可能是加味八珍益母膏質(zhì)量控制的潛在質(zhì)量標(biāo)志物，可為后續(xù)加味八珍益母膏的質(zhì)量控制研究奠定基礎(chǔ)。