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    在體單向腸灌流模型測定甘草素的藥物滲透性及生物藥劑學(xué)分類預(yù)測

    2024-03-14 03:48:22汪凱康賈文丁文華劉群山徐維平安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院合肥300安徽省老年醫(yī)學(xué)研究所中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科安徽省立醫(yī)院合肥3000中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科安徽省立醫(yī)院合肥3000
    中南藥學(xué) 2024年2期
    關(guān)鍵詞:腸段辛醇滲透性

    汪凱康,賈文,丁文華,劉群山,徐維平,,3*(.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,合肥 300;.安徽省老年醫(yī)學(xué)研究所,中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)科(安徽省立醫(yī)院),合肥 3000;3.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院 藥劑科(安徽省立醫(yī)院),合肥 3000)

    甘草素(liquiritigenin),別名4,7-二羥基黃烷酮[1],是一種從豆科植物甘草根部中提取的二氫黃酮單體化合物[2-3],在自然界中主要以糖苷苷元形式存在。近年來,甘草素的各種藥理活性,包括抗氧化應(yīng)激[4-5]、抗腫瘤作用[6-8]、抗抑郁[9-10]、抗血脂[11]和腸道菌群調(diào)節(jié)作用先后被發(fā)現(xiàn)[12-13]。甘草素藥效價值大,市場前景廣闊,目前已成為研究熱點[14]。

    類藥性是指先導(dǎo)化合物最終可能成為藥物的一些相似特性(包括溶解度、親脂性、解離常數(shù)等),以及化合物在機(jī)體內(nèi)的生物學(xué)參數(shù)。因此在藥物研發(fā)過程中,類藥性成為快速確認(rèn)候選化合物能否成為臨床前候選藥物的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[15-16]。

    本研究通過對甘草素的理化性質(zhì)及其滲透性研究,以大鼠各腸段為模型,測定大鼠對不同濃度的甘草素的吸收情況,結(jié)合其理化性質(zhì),為后續(xù)甘草素藥物研發(fā)設(shè)計提供依據(jù)。

    1 材料

    1.1 儀器

    Shimadzu LC-20AD高效液相色譜儀[島津企業(yè)管理(中國)有限公司];ZORBZX SB-Aq C18色譜柱[(250 mm×4.6 mm,5 μm)安捷倫科技(中國)有限公司];BT-50EA蠕動泵(重慶杰恒蠕動泵有限公司);BS224S萬分之一電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司);HH恒溫水浴鍋(江蘇金壇區(qū)中大儀器廠)。

    1.2 試藥

    甘草素對照品(純度>98%,批號:AF21021004)、甘草素原料藥(純度:98%,批號:AFBH3102)(成都埃法生物科技有限公司);葡萄糖[生工生物工程(上海)股份有限公司,批號:G715BA0008];氯化鈣(西隴化工股份有限公司,批號:1001042);氯化鉀(無錫市展望化工試劑有限公司,批號:70910076);氯化鈉(天津歐博凱化工有限公司,批號:20220320);碳酸氫鈉(批號:20180608)、鹽酸(批號:20210506)、磷酸二氫鉀(批號:20160226)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),磷酸氫二鈉(批號:D1811141)、氯化鎂(批號:B2307832)、磷酸二氫鈉(批號:F1829111)(上海阿拉丁生化科技有限公司);氨基甲酸乙酯(上海麥克林生化科技有限公司,批號:C15348963);乙腈(加拿大CALEDON試劑公司,批號:52931);磷酸(上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司,批號:R018659);甲醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠,批號:20230301);純水(自制)。

    1.3 實驗動物

    SPF雄性大鼠,體重約200 g [許可證號SCXK(蘇)2020-0009],本實驗獲得安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn),批件號:2023030。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 溶液的配制

    2.1.1 對照品溶液的配制 精密稱取10.20 mg的甘草素對照品于100 mL量瓶中,配制成質(zhì)量濃度為102.00 μg·mL-1的甘草素對照品母液備用。

    2.1.2 供試品溶液的配制 精密稱取10.0 mg的甘草素原料藥,加甲醇溶解、稀釋、定容至含甘草素質(zhì)量濃度為49.0 μg·mL-1的甘草素供試品溶液,備用。

    2.1.3 Krebs-Ringer’s(K-R)溶液的配制 精密稱取NaCl 3.90 g、KCl 0.18 g、NaH2PO40.16 g、NaHCO30.69 g、MgCl20.01 g、葡萄糖0.70 g于500 mL量瓶中,加適量純水超聲溶解,另取一燒杯,精密稱取CaCl20.19 g,加少量純水溶解后,分多次少量加入量瓶中,并保持超聲,補(bǔ)水定容至刻度,充分搖勻,即得。

    2.1.4 含甘草素K-R溶液的配制 稱取少量的甘草素對照品于量瓶中,加入適量的K-R溶液溶解,配制成含甘草素的人工腸液。

    2.2 甘草素含量測定方法學(xué)的建立

    2.2.1 色譜條件 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相0.1%磷酸溶液-乙腈(60∶40);流速 1 mL·min-1;柱溫 30℃;檢測波長 275 nm;進(jìn)樣量10 μL;進(jìn)樣時間 20 min。

    2.2.2 專屬性試驗 取甘草素對照品溶液、甲醇溶劑、人工腸液溶液、人工腸液+對照品溶液適量,0.22 μm濾膜過濾后,進(jìn)樣檢測,比較各溶液之間的色譜峰,進(jìn)行峰定位,結(jié)果見圖1,各溶液色譜峰之間無干擾,方法專屬性良好。

    圖1 4種溶液的HPLC圖Fig 1 HPLC chromatogram of 4 solutions

    圖2 甘草素在不同腸段和濃度下的Papp(rat)(n=6)Fig 2 Papp(rat)of liquiritigenin in different intestinal segments and concentrations(n=6)

    圖3 甘草素在不同腸段和濃度下的Ka(rat)(n=6)Fig 3 Ka(rat)of liquiritigenin in different intestinal segments and concentrations(n=6)

    2.2.3 線性關(guān)系考察 取“2.1.1”項下對照品母液適量,逐級稀釋成質(zhì)量濃度為102.00、51.00、25.50、12.75、6.38 μg·mL-1的梯度溶液,于0.22 μm濾膜過濾后,進(jìn)樣檢測,以甘草素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),峰面積(y)為縱坐標(biāo),得到線性回歸方程為y=3.33×104x+648.54,R2=0.9999,表明甘草素對照品質(zhì)量濃度在6.38~102.00 μg·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好。

    2.2.4 精密度試驗 取供試品溶液,0.22 μm濾膜過濾后,連續(xù)進(jìn)樣6次,分別測定峰面積,計算得峰面積RSD值為0.88%,表明該方法精密度良好。

    2.2.5 重復(fù)性試驗 按“2.1.2”項下方法,平行制備6組供試品溶液,0.22 μm濾膜過濾后,進(jìn)樣檢測,計算得峰面積RSD值為0.15%,表明該方法重復(fù)性良好。

    2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液,0.22 μm濾膜過濾后,于0、2、4、6、8 h分別進(jìn)樣測定,計算得各時間點峰面積RSD值為0.58%,表明溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.2.7 加樣回收試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液,按照低、中、高3組(1∶0.8,1∶1,1∶1.2)分別加入甘草素對照品,0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)樣測定,每組平行測定3次,低、中、高3組平均加樣回收率分別為99.15%、98.74%、98.94%,RSD值分別為2.8%、1.4%、1.4%,表明該方法準(zhǔn)確度高。

    2.3 甘草素平衡溶解度和脂水(PBS)分配系數(shù)測定

    2.3.1 緩沖液配制 參考2020年版《中國藥典》中關(guān)于pH緩沖液制備的規(guī)定,配制pH分別為1.2、2.0、5.0、6.8、7.4的磷酸鹽(PBS)緩沖液。

    2.3.2 飽和介質(zhì)的配制 取適量正辛醇,分別與水、PBS緩沖液混合,于37℃恒溫水浴條件振搖24 h,10 000 r·min-1離心15 min,收集上層與下層,即制備得正辛醇飽和的水、正辛醇飽和的PBS溶液、水飽和的正辛醇、PBS溶液飽和的正辛醇。

    2.3.3 平衡溶解度測定 分別稱取適量甘草素原料藥置于離心管中,分別加入不同pH的緩沖液和水,保持各溶液處于過飽和狀態(tài),離心管底部有剩余甘草素原料藥存在,移至恒溫水浴振蕩器內(nèi)(溫度25℃,速度120 r·min-1),振搖1 d。稀釋一定倍數(shù)后,進(jìn)樣檢測,測定最大溶解度,甘草素在各溶劑中溶解度均低于100 μg·mL-1,為不溶或幾乎不溶。

    2.3.4 油水分配系數(shù)測定 取兩份甘草素原料藥適量于具塞錐形瓶中,加入正辛醇飽和的水或正辛醇飽和的PBS溶液,振搖均勻,再分別加入等體積的水飽和的正辛醇或PBS緩沖液飽和的正辛醇,蓋上錐形瓶塞,37℃振搖24 h,10 000 r·min-1離心10 min,分液、取樣,稀釋一定倍數(shù)后于0.22 μm針式過濾器過濾,進(jìn)樣檢測,測定水飽和的正辛醇中甘草素濃度為C1、正辛醇飽和的水中甘草素濃度為C2、PBS飽和的正辛醇中甘草素濃度為C3、正辛醇飽和的PBS中甘草素濃度為C4;計算正辛醇/水分配系數(shù):logPwater=log(C1/C2),正辛醇/PBS分配系數(shù):logPPBS=log(C3/C4),結(jié)果見表1。

    表1 甘草素脂水(PBS)分配系數(shù)(±s,n=6)Tab 1 Distribution coefficient of liquiritigenin lipid-water (PBS)(±s,n=6)

    表1 甘草素脂水(PBS)分配系數(shù)(±s,n=6)Tab 1 Distribution coefficient of liquiritigenin lipid-water (PBS)(±s,n=6)

    溶劑體系甘草素質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)脂水(PBS)分配系數(shù)水(PBS)飽和的正辛醇水-正辛醇2.36±0.17975±1.232.64±0.33 PBS-正辛醇1.87±0.22612±1.172.51±0.14正辛醇飽和的水(PBS)

    2.4 滲透性測定

    2.4.1 含藥K-R溶液的配制 分別精密稱取0.0125、0.0250、0.0375 g甘草素原料藥于500 mL量瓶中,取“2.1.3”項下人工腸液,配制成質(zhì)量濃度約為25、50、75 μg·mL-1的含甘草素灌流溶液,待用。

    2.4.2 腸灌流實驗 取SPF雄性大鼠12只,分成低、中、高濃度3組。正常喂養(yǎng),實驗前禁食不禁水24 h,麻醉,剃去大鼠腹部毛發(fā),沿腹腔中線后打開腹腔,分離出十二指腸,腸兩端連接注射導(dǎo)管,將預(yù)熱至37℃的生理鹽水以緩速清洗掉腸中殘留瘀血和內(nèi)容物,蓋上生理鹽水浸潤過的紗布。將含甘草素的K-R溶液置于37℃恒溫水浴鍋中,連接蠕動泵,調(diào)節(jié)流速,將蠕動循環(huán)裝置連接在手術(shù)后大鼠的十二指腸兩端。待流速穩(wěn)定30 min后開始計時,用稱好質(zhì)量的試管在十二指腸流出導(dǎo)管口處每隔20 min收集一次流出液體。重復(fù)操作6次后,分別測定收集后液體的試管質(zhì)量。實驗結(jié)束后處死大鼠,測量十二指腸長度和內(nèi)徑。將收集后的液體稀釋后過濾,進(jìn)樣檢測,測定不同時間點的藥物濃度,計算藥物在大鼠十二指腸內(nèi)的吸收速率常數(shù)Ka(rat)、藥物表觀滲透系數(shù)Papp(rat)。同法測定大鼠回腸、結(jié)腸、空腸的Ka(rat)和Papp(rat)[17]。結(jié)果見圖 2、3,大鼠各腸段Papp(rat)均大于1.2×10-3cm·min-1,表明甘草素在各腸段中滲透性高,而隨著甘草素濃度的增加,藥物存在自身吸收抑制、藥物有吸收飽和現(xiàn)象。

    3 討論

    目前,測定藥物在腸道吸收的方法主要有3種,包括體內(nèi)法、體外法和在體法[18-19],體內(nèi)法通常以機(jī)體的整體為研究對象,通過測定機(jī)體血液中的藥物濃度、藥物達(dá)峰時間(tmax)、表觀分布容積(Vd)、藥時曲線下面積(AUC)等其他藥動學(xué)參數(shù),進(jìn)而比較藥物在機(jī)體內(nèi)的吸收效率和速率。體外法包括外翻腸囊法、組織流動室法、Caco2細(xì)胞模型法等,在體法包括腸道血管插管法、腸灌流法等[20-23]。本研究采用單向腸灌流法來測定甘草素在大鼠各腸段的吸收情況,相較于其他測定方法,本方法實驗?zāi)P蜆?gòu)造相對簡單,且成本低,易操作,能較為準(zhǔn)確地反映出藥物在腸道的真實吸收情況[24-25]。此外在實驗過程中,為了減少大鼠各腸段中所吸收或分泌的水分對實驗產(chǎn)生的誤差,本研究以重量法來消除灌流液流入和流出時的藥物濃度差,從而降低實驗誤差,能夠更加真實地反映出藥物的吸收情況[17]。

    通過不同濃度的甘草素灌流液對大鼠的腸吸收數(shù)據(jù)來看,甘草素在不同腸段中的吸收情況不同,在回腸和結(jié)腸中吸收效果比十二指腸和空腸好,可能與腸段中膜成分、膜層厚度差異性有關(guān),后期在給藥劑量方面應(yīng)當(dāng)考慮不同腸段對藥物吸收的影響,且隨著甘草素給藥濃度的增加,其Papp(rat)、Ka(rat)呈下降趨勢,推測甘草素在大鼠腸吸收中存在自身吸收抑制,而隨著其濃度進(jìn)一步的提高,各腸段對甘草素吸收趨于飽和。藥物可能在吸收過程中,存在主動轉(zhuǎn)運或擴(kuò)散等轉(zhuǎn)運機(jī)制。藥物在腸道中的吸收大小按Papp(rat)分為3類:當(dāng)Papp(rat)<0.18×10-3cm·min-1,表明藥物滲透性差;當(dāng)Papp(rat)數(shù)值超過1.2×10-3cm·min-1,則表明藥物滲透性高;當(dāng)Papp(rat)在兩者之間則藥物滲透性一般。通過上述數(shù)據(jù)判斷甘草素為易吸收藥物,藥物滲透性高[26]。

    本研究中選擇pH 1.2、4.0、6.8、7.4緩沖液和水為溶解介質(zhì)對甘草素溶解度進(jìn)行考察,通過2020年版《中國藥典》對溶解度的相關(guān)規(guī)定,1 g溶質(zhì)在10 000 mL溶劑中不能完全溶解定性為不溶或幾乎不溶,甘草素在不同pH溶液中溶解度基本一致,且都為不溶或幾乎不溶。通過對甘草素溶解度、親脂性以及滲透性進(jìn)行研究,綜上所述,預(yù)測甘草素為生物藥劑學(xué)Ⅱ類藥物,為低溶解度,高滲透性藥物。

    目前以甘草素為研究對象的相關(guān)藥理研究較為廣泛,但以其為主成分設(shè)計的藥物劑型較少,可能與其自身溶解度差有關(guān),本課題通過研究不同濃度甘草素在不同腸段的吸收情況及其溶解度和親脂性特點,為甘草素成藥性提供數(shù)據(jù)參考,同時也為后期甘草素的劑型設(shè)計、給藥劑量方面提供思路。

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