基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的三種基原溪黃草及其干預(yù)小鼠肝纖維化的血清化學(xué)研究

覃萍，蘇陽靜，陳永苗，鄭瑞瑤，鐘佳妮，葉曉燕，葛躍偉，陳阿麗*（.廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心，廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 50006；.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 5006；.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 50006）

溪黃草是唇形科香茶菜屬的一種多年生草本，其性寒，味苦，主產(chǎn)于黑龍江、江西、廣東、廣西、福建等地，長期以來一直作為民間中草藥被廣泛使用[1]。溪黃草是一種多基原中藥，包括線紋香茶菜Rabdosialophanthoides（Buch.-Ham.exD.Don）Hara、纖花香茶菜Rabdosialophanthoides（Buch.-Ham.ex D.Don）Hara var.gerardiana（Benth）Hara以及溪黃草Rabdosiaserra（Maxim）Hara三種基原。研究表明，溪黃草具有清熱利濕、涼血散瘀的作用，可用于急性膽囊炎、急性黃疸型肝炎等病癥的治療[2]。

肝纖維化是一種肝組織細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積（特別是膠原沉積）的病理生理過程[3]。若肝纖維化不能及時(shí)治愈，可能會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化，甚至惡化為肝癌。肝纖維化是一個(gè)可逆的病理過程，減弱或消除纖維化形成的致病因素可逆轉(zhuǎn)肝纖維化病理過程[4-5]。

研究表明，溪黃草可以抵抗多種因素引起的肝纖維化，但不同基原溪黃草的化學(xué)成分差異大，各企業(yè)采用的基原也無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[6-7]。有學(xué)者采用經(jīng)典的肝纖維化誘導(dǎo)劑四氯化碳對(duì)小鼠進(jìn)行處理，在病理生理學(xué)上可使小鼠的肝臟組織與人的肝臟組織具有相似性[8]。本研究分析三種基原溪黃草的藥物化學(xué)成分及其口服給藥后肝纖維化小鼠血清中的化學(xué)成分，對(duì)后續(xù)溪黃草藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以及抗肝纖維化研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試藥

50只雄性SPF級(jí)8周齡C57BL/6J小鼠[河南斯克貝斯生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（豫）2020-0005]；線紋香茶菜藥材、纖花香茶菜藥材和溪黃草藥材（廣州白云山和記黃埔中藥有限公司溪黃草GAP基地，由廣東藥科大學(xué)田素英教授鑒定為真品）。甲醇、甲酸均為質(zhì)譜純（美國賽默飛公司）；蒸餾水[屈臣氏集團(tuán)（香港）有限公司]；其余試劑均為分析純。

1.2 三種基原溪黃草提取物的制備

取三種基原溪黃草藥材適量，粉碎，過80目篩，加入8倍體積的95%乙醇，于80℃水浴中回流提取1.5 h，提取2次，過濾，合并濾液并減壓濃縮，冷凍干燥后得三種基原溪黃草乙醇提取物凍干粉。

1.3 供試品溶液的制備

精密稱取溪黃草凍干粉25 mg、纖花香茶菜凍干粉41 mg、線紋香茶菜凍干粉33 mg（相當(dāng)于0.5 g藥材量），量取10 mL甲醇置于錐形瓶中，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min后，補(bǔ)重，10 000 r·min－1、4℃離心10 min，取500 μL上清液于5 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，使用0.22 μm微孔濾膜過濾，配制成供試品溶液。

1.4 動(dòng)物分組與給藥

50只雄性8周齡C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型組、線紋香茶菜給藥組、纖花香茶菜給藥組、溪黃草給藥組?？瞻讓?duì)照組腹腔注射橄欖油，其余4組腹腔注射四氯化碳溶液，給藥劑量為1 μL·g－1，一周2次，共8周。準(zhǔn)確稱取溪黃草凍干粉257 mg、纖花香茶菜凍干粉421.48 mg、線紋香茶菜凍干粉339.24 mg（相當(dāng)于5.14 g藥材量），分別溶解于10 mL羧甲基纖維素鈉溶液，配制成供試藥液?？瞻讓?duì)照組以及模型組小鼠每日灌胃羧甲基纖維素鈉溶液，各給藥組給予供試藥液，給藥劑量為5.14 g·kg－1，連續(xù)給藥8周。末次給藥12 h后摘眼球取血，并用1.5 mL EP管收集，4℃條件下4500 r·min－1離心12 min，取血清，保存于－80℃冰箱。

1.5 血清樣品的制備

將血清樣本從－80℃冰箱中取出解凍，渦旋混勻，取100 μL置于EP管中，加入400 μL提前預(yù)冷的甲醇，充分渦旋2 min，冰水浴超聲30 min后，10 000 r·min－1、4℃條件下離心10 min。取上清液，氮吹濃縮，殘留物加入80 μL的80%甲醇復(fù)溶，0.22 μm的微孔濾膜過濾，得到血清化學(xué)樣品。

1.6 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS檢測(cè)條件

采用Shim-pack GIST-HP C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm），預(yù)柱為Shim-pack GIST-HP C18，流動(dòng)相為0.1% 甲酸水（A）-甲醇（B）；流速為0.3 mL·min－1；柱溫30℃；進(jìn)樣量2 μL，梯度洗脫（0～3 min，10%B；3～8 min，10%→35%B；8～30 min，35%→55%B；30～35 min，55%→65%B；35～56 min，65%～95%B；56～58 min，95%；58～63 min，95%→10%；63～65 min，10%B）。采用電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子模式下進(jìn)行Fullscan及MS/MS掃描，MS/MS采用數(shù)據(jù)依賴型（DDA）數(shù)據(jù)采集，掃描范圍m/z100～1500；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；鞘氣流速：45 arb；輔助氣體流速：10 arb；毛細(xì)管溫度：350℃。

1.7 不同基原溪黃草藥材及血清樣品化學(xué)成分鑒定

應(yīng)用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術(shù)對(duì)三種不同基原溪黃草藥材樣品以及給藥小鼠血清樣品進(jìn)行分析，包括保留時(shí)間、高分辨準(zhǔn)分子離子峰、MS/MS碎片離子等，結(jié)合對(duì)照品比對(duì)及文獻(xiàn)報(bào)道，進(jìn)行化合物推定。

2 結(jié)果

2.1 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 色譜圖的采集

以負(fù)離子模式為例，采集的三種基原溪黃草藥材樣本及其給藥小鼠血清樣本的色譜圖結(jié)果見圖1，鑒定藥物化學(xué)成分結(jié)果見表1。

表1 鑒定藥物化學(xué)成分結(jié)果Tab 1 Identification of chemical components

圖1 溪黃草藥材（A）及其給藥組血清（B）負(fù)離子模式基峰離子流色譜圖Fig 1 ESI－of based peak chromatogram of Rabdosia serra（A）and the serum of Rabdosia serra administration group（B）

2.2 三種不同基原溪黃草藥材樣品化學(xué)成分的裂解規(guī)律

2.2.1 酚酸類成分的裂解規(guī)律 結(jié)果顯示，酚酸類成分主要有香草酸、原兒茶酸和迷迭香酸等。以迷迭香酸為例，在負(fù)離子模式下，保留時(shí)間為17.61 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z359.0778[MH]－，其在裂解過程中丟失一分子丹參素和一分子咖啡酸，前者生成碎片離子m/z197.0454和m/z161.0228，后者生成碎片離子m/z179.0348。此外，丹參素通過中性丟失一分子H2O可生成碎片離子m/z179.0348，該碎片離子再失去一分子CO2，生成m/z135.0446。碎片離子m/z133.0295則推測(cè)為m/z161.0228通過中性丟失一分子CO生成。此裂解規(guī)律與文獻(xiàn)報(bào)道一致[19]，因此推測(cè)該結(jié)構(gòu)為迷迭香酸，其質(zhì)譜裂解規(guī)律見圖2。

2.2.2 黃酮類成分的裂解規(guī)律 結(jié)果顯示，黃酮類成分主要有夏佛塔苷和蘆丁等。以蘆丁為例，在負(fù)離子模式下，保留時(shí)間為17.03 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z609.1470[M-H]－，其在裂解過程中丟失一分子糖苷，生成碎片離子m/z301.0347。該碎片離子通過發(fā)生RDA反應(yīng)裂解生成m/z178.9984，而后通過中性丟失一分子CO生成碎片離子m/z151.0021，此裂解規(guī)律與文獻(xiàn)報(bào)道一致[20]。蘆丁質(zhì)譜裂解規(guī)律見圖3。

圖3 蘆丁質(zhì)譜裂解規(guī)律Fig 3 Proposed fragmentation pathways of rutin

2.2.3 二萜類成分的裂解規(guī)律 結(jié)果顯示，二萜類成分主要有horminone、kamebakaurin和maoecrystal A等。其中maoecrystal A是一種有代表性的對(duì)映貝殼杉烷類二萜化合物，其3，20-環(huán)氧 C-20 位被氧化。Maoecrystal A的保留時(shí)間為38.06 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z387.1815[M-H]－，其在裂解過程中丟失了一分子CH3COOH，生成碎片離子m/z327.1606，該碎片離子再丟失一分子H2O，生成m/z309.1502，這與其他 C-20 位被氧化的對(duì)映貝殼杉烷類二萜的碎裂途徑一致，并且此裂解規(guī)律與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]。Maoecrystal A的質(zhì)譜裂解規(guī)律見圖4。

圖4 Maoecrystal A質(zhì)譜裂解規(guī)律Fig 4 Proposed fragmentation pathways of maoecrystal A

2.3 三種不同基原溪黃草在給藥小鼠血清中入血成分的鑒定

M1在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z118.0867[M＋H]＋，推測(cè)其分子式為C5H11NO2。在其二級(jí)質(zhì)譜圖中檢測(cè)到特征碎片離子m/z59.0738，在溪黃草藥材及其血清中均被檢出，結(jié)合文獻(xiàn)[9]推測(cè)該化合物為甜菜堿。M2在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z188.9858[M-H]－，推測(cè)分子式為C6H6O5S，其特征碎片為m/z109.0283，推測(cè)是M2丟失一分子SO3所得。纖花藥材中可檢出原兒茶酸，但在血清中未檢出原型，可能是由于其具有3個(gè)羥基易與硫酸結(jié)合，因而推測(cè)M2為原兒茶酸失去一分子CO2所形成的O-硫酸酯化合物[21]，其在小鼠體內(nèi)可能的代謝途徑見圖5。M3在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z179.0343[M-H]－，推測(cè)分子式為C9H8O4，其特征碎片離子m/z135.0442可能是前體離子裂解過程中失去一分子CO2所得，且該碎片離子通過丟失一分子CO，進(jìn)而產(chǎn)生m/z107.0492，推測(cè)該結(jié)構(gòu)為咖啡酸，在三種基原溪黃草血清中均被檢出原型。結(jié)合文獻(xiàn)，迷迭香酸在體內(nèi)代謝產(chǎn)物有咖啡酸，因而推測(cè)咖啡酸可能是其代謝產(chǎn)物[22]。咖啡酸的質(zhì)譜裂解規(guī)律見圖6，該裂解途徑與文獻(xiàn)報(bào)道一致[23-24]。

圖5 原兒茶酸體內(nèi)代謝途徑Fig 5 Metabolic way of protocatechuic acid

圖6 咖啡酸質(zhì)譜裂解規(guī)律Fig 6 Proposed fragmentation pathways of caffeic acid

具體三種基原溪黃草給藥小鼠血清中入血成分及可能代謝產(chǎn)物見表2。

表2 小鼠血清中入血成分及可能代謝產(chǎn)物的鑒定Tab 2 Identification of blood components and possible metabolites in mouse serum

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術(shù)研究四氯化碳致肝纖維化小鼠模型中三種基原溪黃草的入血成分。結(jié)果在三組藥材中共鑒定出40個(gè)化合物，包括二萜、酚酸、黃酮及其他類化合物；在給藥小鼠血清中鑒定出2個(gè)入血成分，包括1個(gè)有機(jī)酸類和1個(gè)生物堿類，鑒定出2個(gè)可能的代謝產(chǎn)物均為酚酸類化合物。其中，在溪黃草藥材和給藥組血清中分別鑒定出26個(gè)和2個(gè)化合物；在線紋香茶菜藥材和給藥組血清中分別鑒定出34個(gè)和1個(gè)化合物；在纖花香茶菜藥材和給藥組血清中分別鑒定出33個(gè)和2個(gè)化合物。

研究表明，氧化應(yīng)激是四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化發(fā)病的重要機(jī)制之一[25]。甜菜堿為生物堿類化合物，具有抗氧化及抗炎作用，能夠抑制肝星狀細(xì)胞的活化進(jìn)而達(dá)到抗肝纖維化的效果[24，26]。原兒茶醛與原兒茶酸同為抗氧化、抗炎作用較強(qiáng)的酚酸類化合物，都具有很好的護(hù)肝功效[27-29]。在藥材和給藥小鼠血清中均檢出酚酸類化合物咖啡酸，研究發(fā)現(xiàn)，其通過激活NRF2/ARE信號(hào)通路，提高抗氧化相關(guān)基因水平，增強(qiáng)肝細(xì)胞清除自由基的能力，改善肝細(xì)胞氧化應(yīng)激，從而達(dá)到保肝作用[30]。

綜上所述，以上入血成分及代謝產(chǎn)物在抗炎、抗氧化等方面發(fā)揮著重要作用，由此推測(cè)這些成分可能是三種藥材發(fā)揮作用的潛在藥效物質(zhì)。雖然三種基原溪黃草藥材中均檢出較多二萜類成分，但未在入血成分中檢出，其原因可能為二萜類成分進(jìn)入小鼠體內(nèi)后發(fā)生了生物轉(zhuǎn)化過程，因而難以檢出原型成分[31-32]。

本研究應(yīng)用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術(shù)完成了三種基原溪黃草及其給藥后入血成分的初步鑒定，為后續(xù)研究溪黃草的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其抗肝纖維化作用提供了理論參考。