鬼臼毒素脂質(zhì)體的制備及其質(zhì)量評價

張朗朗，戴粵湘，張涵，郭波紅*，索緒斌*（.廣東藥科大學 藥學院，廣州 50006；.廣東藥科大學 中藥學院，廣州 50006）

鬼臼毒素（POD，結構式見圖1）是從鬼臼屬植物中分離出來的芳基四氫萘型木脂素，其具有抗腫瘤活性[1-2]，抗腫瘤機制與阻斷細胞的有絲分裂及抑制有絲分裂器中微管的組裝有關[3]。研究表明，POD可用于治療非小細胞肺癌、淋巴癌、白血病、前列腺癌等疾病[4-6]。但因POD難溶于水，生物利用度低且毒副作用較大，選擇性較差，容易對健康組織產(chǎn)生影響，并且可能會導致一些嚴重不良反應，尤其是劇烈的胃腸道反應等，限制了其在抗腫瘤方面的應用。為克服這些缺陷，可將POD制備成納米制劑[7-9]。脂質(zhì)體可改善藥物的生物利用度，減小對正常細胞的毒性，延長循環(huán)時間，并增強藥物在腫瘤部位的靶向性以及對腫瘤細胞增殖和遷移的抑制作用[10]。脂質(zhì)體能使藥物集中于病灶部位并對病變細胞發(fā)揮治療作用，還能提高藥物的生物利用度以及降低藥物的毒副作用。因此，本試驗嘗試制備鬼臼毒素脂質(zhì)體（POD-Lps），并對其進行質(zhì)量評價，為該藥物的后續(xù)研究提供一定的依據(jù)。

圖1 鬼臼毒素結構式Fig 1 Structure of podophyllotoxin

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SCL-10AVP型高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱水浴鍋、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；JEM1230透射電鏡（日本電子株式會社）；TLEx-10脂質(zhì)體擠出器（蘇州艾特森制藥設備有限公司）；ME-204型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，d＝0.01 mg）；Winner802納米粒度儀（濟南微納顆粒儀器股份有限公司）；POWEREACH Zeta電位儀（上海中晨數(shù)字技術設備有限公司）。

1.2 試藥

POD原料藥（上海源葉生物科技有限公司，批號：S24887-5g，純度≥98%）；膽固醇（上海藍季科技發(fā)展有限公司）；卵磷脂（上海金伴藥業(yè)有限公司）；Sephadex G-50（Pharmacia公司，100～300 μm）；甲醇為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 POD-Lps的制備

采用乙醇注入法制備POD-Lps：精密稱取4.0 mg鬼臼毒素、8.0 mg膽固醇和120 mg卵磷脂于小燒杯中，加適量無水乙醇（約2 mL）并超聲10 min至溶解完全后，將混合液緩慢勻速地注入水浴恒溫55℃磁力攪拌的10 mL磷酸鹽緩沖液（pH 5.8）中，再減壓抽去無水乙醇后，經(jīng)通有氮氣的微孔濾膜（0.45 μm）擠出器擠出過濾2次，然后再更換0.2 μm微孔濾膜繼續(xù)擠出2次，得乳白色的POD-Lps，于4℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 脂質(zhì)體中鬼臼毒素的測定方法

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Platisil-ODS（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水＝（70∶30）；檢測波長292 nm；流速1.0 mL·min-1；柱溫為室溫；進樣量20 μL。

2.2.2 POD甲醇溶液的配制 精密稱取POD原料藥5.0 mg，置于25 mL量瓶中，加適量甲醇超聲溶解完全后稀釋并定容至刻度，搖勻，得POD儲備液。精密量取2.0 mL儲備液于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得POD甲醇溶液。

2.2.3 供試品溶液的配制 精密量取0.5 mL POD-Lps樣品于10 mL量瓶中，加少量甲醇破乳后，緩沖液稀釋并定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4 空白脂質(zhì)體溶液的配制 按“2.1”項下方法制備不含藥物的空白脂質(zhì)體。按“2.2.3”項下方法制備空白脂質(zhì)體溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 分別取POD甲醇溶液、供試品溶液以及空白脂質(zhì)體溶液20 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，分別記錄HPLC色譜圖（見圖2）。結果在該色譜條件下，空白脂質(zhì)體對POD的測定沒有干擾，專屬性較好。

圖2 POD-Lps的HPLC色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of POD-Lps

2.3.2 線性關系考察 精密量取“2.2.2”項下POD儲備液適量并依次稀釋，制成4.0、10、20、40、60、80、100 μg·mL-1的系列濃度線性溶液，進樣分析，測定峰面積，以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得線性回歸方程y＝2.036×107x＋1.263×104，r＝0.9993（n＝7）。結果表明，POD質(zhì)量濃度在4～100 μg·mL-1與峰面積的線性關系良好。

2.3.3 精密度試驗 取POD甲醇溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果峰面積RSD值為0.58%，說明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批POD-Lps，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后，進樣分析，記錄峰面積。計算的RSD值為0.70%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復性試驗 取同一批POD-Lps，按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積并計算樣品濃度。結果樣品的平均質(zhì)量濃度為39.7 μg·mL-1，RSD為1.2%，表明本方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收試驗 精密量取“2.2.2”項下POD儲備液1.0、2.0、3.0 mL各3份，分別加入含0.5 mL空白脂質(zhì)體溶液的10 mL量瓶中，配制成低、中、高（20、40、60 μg·mL-1）3種濃度的溶液，進樣測定并計算。結果低、中、高濃度平均回收率分別為99.9%、98.4%、100.1%，RSD分別為0.38%、0.76%、1.1%，表明該方法準確度較好。

2.4 Sephadex G-50凝膠柱色譜法分離POD-Lps和游離POD

2.4.1 脂質(zhì)體分離洗脫曲線

① 葡聚糖凝膠的處理：精密稱取3.0 g Sephadex G-50，用煮沸的蒸餾水溶脹并放置過夜，使用前用洗脫液充分溶脹6 h，超聲脫氣后裝柱，柱內(nèi)徑約1.5 cm，柱高15 cm。

② 洗脫曲線：用磷酸鹽緩沖液（pH 5.8）以1.0 mL·min-1的流速沖洗平衡柱子1 h。然后對葡聚糖凝膠柱進行空白脂質(zhì)體預飽和，即精密移取空白脂質(zhì)體溶液0.5 mL上柱，用洗脫液洗脫，收集乳濁液并重復3次。取“2.2.2”項下POD甲醇溶液作為游離POD溶液，分別精密吸取POD-Lps 0.5 mL和游離POD溶液0.2 mL上柱，以磷酸鹽緩沖液（pH 5.8）洗脫，收集流份，每管收集1 mL，測定峰面積。以收集的管數(shù)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制POD-Lps的洗脫曲線，結果見圖3。由洗脫曲線可知，POD-Lps在4～10 mL被洗脫出來，而游離POD則在14～21 mL被洗脫出來，表明脂質(zhì)體和游離藥物能夠被很好地分離。

圖3 POD-Lps的洗脫曲線Fig 3 Elution curve of POD-Lps

2.4.2 POD-Lps包封率的測定 精密吸取0.5 mL POD-Lps溶液于10 mL量瓶中，加少量甲醇破乳后，用緩沖液稀釋并定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液進樣分析，計算脂質(zhì)體中POD的總濃度Cb；精密吸取POD-Lps溶液0.5 mL上柱，收集洗脫液，加少量甲醇破乳后，用緩沖液稀釋并定容至10 mL，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液進樣，計算包于脂質(zhì)體中的POD濃度Ca，包封率（EE）根據(jù)以下公式計算：EE（%）＝Ca/Cb×100%。

2.5 POD-Lps處方單因素考察

2.5.1 磷脂和膽固醇的質(zhì)量比的考察 固定其他因素不變，精密稱量4.0 mg POD和120 mg的卵磷脂，控制膽磷比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，按“2.1”項下方法制備脂質(zhì)體，測定包封率和粒徑，結果其對應包封率分別為27.84%、64.93%、83.47%、75.69%、58.76%，粒徑分別為198.37、211.23、157.31、206.45、179.68 nm。綜合考慮，選用1∶15的膽磷比進行后續(xù)處方優(yōu)化。

2.5.2 藥物和磷脂的質(zhì)量比的考察 精密稱取膽固醇8.0 mg和卵磷脂120 mg，固定其他因素不變，改變藥物和磷脂的質(zhì)量比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40，測定包封率和粒徑，結果其對應包封率分別為20.51%、45.86%、63.83%、87.57%、69.38%，粒徑分別為237.46、211.69、197.52、142.71、131.23 nm。綜合考慮，選擇1∶30的質(zhì)量比進行后續(xù)試驗。

2.5.3 水相介質(zhì)pH值考察 控制處方中其他因素不變，改變緩沖液的pH值，調(diào)節(jié)水相介質(zhì)的pH值分別為4.0、5.0、5.8、7.0、7.6，考察pH值對包封率和粒徑的影響，結果其對應包封率分別為29.43%、50.59%、85.76%、55.78%、37.35%，粒徑測定結果相差不大。故選擇pH值5.8的磷酸鹽緩沖液作為水相介質(zhì)。

2.5.4 水浴溫度考察 控制處方中的其他因素不變，改變脂質(zhì)體制備時的水浴溫度（分別為35℃、45℃、50℃、55℃），并測定包封率和粒徑。結果顯示隨著水浴溫度的提高，包封率先下降后逐漸增大，55℃時達到85.25%；粒徑逐漸減小，55℃時粒徑減小至159.78 nm。故采用水浴溫度55℃。

2.5.5 水相和油相的體積比考察 固定處方中其他因素不變，改變類脂溶液和緩沖液的體積比，分別為1∶2、1∶5、1∶8、1∶10，測定包封率和粒徑，結果其對應包封率分別為81.24%、88.36%、79.69%、83.04%；粒徑先減小后增大，1∶5時粒徑達到最小，為141.25 nm。故選用水相和油相體積比1∶5的比例。

2.6 Box-Behnken響應面分析法

2.6.1 試驗設計 根據(jù)單因素考察結果，選擇對POD-Lps包封率影響較顯著的3個因素作為考察對象，即膽磷比（A）、藥脂比（B）、緩沖液pH值（C），以包封率為指標進行試驗，Box-Behnken試驗設計見表1。

表1 響應面因素水平表Tab 1 Factor and level of central response surface method

2.6.2 響應面數(shù)據(jù)分析結果 采用Design-ExpertV 10.0.4軟件進行處理，結果見表2。以EE對A、B、C進行二次項式回歸方程擬合。得到擬合方程：EE（%）＝84.43-0.80A＋3.72B-11.98C＋0.09AB＋2.09AC-1.03BC-5.71A2-8.27B2-34.57C2。結果表明，建立的模型P值小于0.01，失擬項水平不顯著（P＞0.05）。膽磷比（A）、藥脂比（B）以及pH（C）對包封率的影響顯著（P＜0.05），各因素之間交互不顯著（AB、BC、AC的P＞0.05）。以包封率為評價指標的各因素交互作用響應圖見圖4。模型與實際情況擬合程度良好，對上述所建立的數(shù)學模型進行綜合分析，保證包封率與擬合度均最高的前提下，最終確定了各因素的最佳取值：A＝1∶14.49，B＝1∶32.36，C＝5.82。

表2 Box-Behnken響應面結果Tab 2 Results of Box-Behnken response surface analysis

圖4 POD-Lps制備工藝各因素相互作用的響應面圖Fig 4 Response surface of each factor for POD-Lps preparation

2.6.3 最優(yōu)處方驗證試驗 按優(yōu)化后處方，采用乙醇注入法以POD與磷脂質(zhì)量比1∶32.36、膽固醇與磷脂質(zhì)量比1∶14.49、緩沖液pH值5.82的條件制備3批POD-Lps。測得包封率分別為87.73%、85.49%、89.08%，接近模型預測值（85.92%），說明制備工藝可行且重復性良好。

2.7 POD-Lps的質(zhì)量評價

2.7.1 POD-Lps包封率 取3批POD-Lps，按“2.4.2”項下方法測定包封率，結果其包封率為（87.43±1.8）%。

2.7.2 POD-Lps形態(tài)電鏡觀察 取適量最優(yōu)制備條件制得的POD-Lps，蒸餾水稀釋10倍后，將其滴于碳膜生物銅網(wǎng)表面，用濾紙吸掉多余混懸液，用1%磷鎢酸負染30 s后晾干，干燥后在透射掃描電子顯微鏡（TEM）下觀察并拍攝，結果如圖5所示，POD-Lps呈球形或類球形，結構完整。

圖5 POD-Lps電鏡圖Fig 5 Transmission electron micrograph of POD-Lps

2.7.3 粒徑和Zeta電位 取POD-Lps，稀釋10倍后取適量于樣品池中，通過激光納米粒度儀和Zeta電位儀對脂質(zhì)體的粒徑和Zeta電位進行測定，平行測定3次，見圖6。結果顯示，POD-Lps平均粒徑為（139.12±9.81）nm，多分散系數(shù)（PDI）為（0.21±0.04），Zeta電位為（-26.37±0.36）mV。表明POD-Lps粒徑分布均勻，且表面帶負電。

圖6 POD-Lps的粒徑分布和Zeta電位Fig 6 Particle size and Zeta potential of POD-Lps

2.7.4 體外釋放試驗 采用透析袋法測定體外釋放度。取1 mg POD置于10 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，作為POD溶液。分別取1 mL POD-Lps和1 mL POD溶液置預處理后的透析袋（MW＝8000～14 000）中，夾緊兩端，置于裝有100 mL的含0.5%十二烷基硫酸鈉（SDS）PBS緩沖液（pH 7.4）的燒杯中，然后于（37±2）℃水浴恒溫振蕩器中進行釋放，轉速為100 r·min-1，分別于0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12、24、36 h取出1 mL釋放介質(zhì)，同時補充1 mL新鮮釋放介質(zhì)。測定POD質(zhì)量濃度并計算累計釋放率（Q，%）。以Q對時間t繪制曲線并進行方程擬合，結果見表3，體外釋放曲線見圖7。結果表明游離POD溶液Q12h達到96%以上，POD-Lps釋放緩慢，Q12h為60.73%；Q36h接近80%。擬合方程結果顯示PODLps符合一級動力學模型（R2＝0.979）。

表3 擬合方程Tab 3 Regression equation

圖7 POD和POD-Lps的體外釋放曲線Fig 7 In vitro release behaviors of POD and POD-Lps

2.7.5 脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察 取2批POD-Lps，分別在25℃以及4℃條件下放置，再分別在0、15、30 d取樣，觀察外觀性狀，并測定包封率、粒徑以及電位等參數(shù)，考察脂質(zhì)體穩(wěn)定性，結果見表4。POD-Lps在25℃條件下放置30 d后，可見樣品有少量沉淀聚集，包封率明顯下降，粒徑及電位變化較大，PDI也明顯升高。4℃條件下放置一個月的樣品，包封率未有明顯下降，粒徑、Zeta電位以及PDI變化較小，觀察外觀沒有沉淀聚集，說明4℃下的POD-Lps穩(wěn)定性較好。

表4 POD-Lps穩(wěn)定性考察結果Tab 4 Storage stability of POD-Lps

3 討論

3.1 脂質(zhì)體制備方法的考察

根據(jù)相關文獻，POD-Lps的制備方法主要是薄膜水化超聲分散法[11]，暫無其他方法的報道。采用薄膜水化超聲分散法制備POD-Lps時發(fā)現(xiàn)，旋轉蒸發(fā)后成膜性較差且水化后所得脂質(zhì)體的粒徑較大，通過探頭超聲后，包封率顯著降低。乙醇注入法是將磷脂溶解到有機溶劑中，并進一步將脂質(zhì)分散到水相中。乙醇溶液在水相中立即被稀釋，引起脂質(zhì)分子析出并形成雙層平面片段，進而轉變?yōu)橹|(zhì)體系統(tǒng)，可以直接得到粒徑較小且均勻的脂質(zhì)體[12]。該方法條件溫和，試驗過程中所用無水乙醇的量較少，可以減壓揮發(fā)除去，避免了制劑中有機溶劑的殘留。

分離脂質(zhì)體和游離藥物選擇了葡聚糖凝膠柱色譜法。超濾法成本較高；微柱離心法操作較為麻煩且離心轉速、時間以及溫度都難以確定；透析法耗時長且操作難度較高[13]。本試驗初期曾嘗試采用離心法分離脂質(zhì)體，但分離效果不佳，因此采用葡聚糖凝膠柱色譜法。葡聚糖凝膠G50有良好的親水性、大網(wǎng)架結構以及無特異性吸附的特點，利用其分子篩原理可將脂質(zhì)體和游離鬼臼毒素完全分離。在本試驗中，通過用空白脂質(zhì)體來預飽和凝膠，減少其對脂質(zhì)體的吸附[14]。

3.2 脂質(zhì)體包封率影響因素的考察

本試驗中，藥脂比以及緩沖液pH值對脂質(zhì)體包封率的影響最為顯著，隨著藥物濃度的升高，包封率先升高后下降。本試驗通過摸索，發(fā)現(xiàn)磷酸鹽緩沖液pH值在5.8時，可以得到包封率較高的POD-Lps。當pH值在5.0以下或6.0以上時，POD-Lps的包封率會顯著降低，這可能是因為POD的結構中含有內(nèi)酯環(huán)，在弱堿性和強酸性環(huán)境中不穩(wěn)定，易發(fā)生開環(huán)水解[15]，且磷脂最穩(wěn)定的pH條件為6.5左右，太高或太低都容易使其水解。

綜上所述，本試驗成功以乙醇注入法將POD制備成脂質(zhì)體，采用的處方與工藝簡單可行、包封率較高、穩(wěn)定性較好，可為后續(xù)POD-Lps的進一步研究提供參考。