白菜種子cDNA 酵母文庫的構(gòu)建及BrTTG1 互作蛋白的篩選及分析

任延靖 張魯剛 趙孟良 李江 邵登魁

（1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院 青藏高原種質(zhì)資源研究與利用實驗室，西寧 810016；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部青藏高原種質(zhì)資源保護(hù)與遺傳改良重點實驗室，西寧 810016；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，楊凌 712100）

白菜（Brassica rapa.L.）是我國栽培面積最廣，也是最常見的蔬菜作物之一，同時也是高海拔地區(qū)主要的油料作物，具有耐貧瘠、耐寒等優(yōu)點。種皮顏色是十字花科蕓薹屬作物一個重要的園藝性狀［1-2］，根據(jù)種皮顏色的不同可以將蕓薹屬作物的種子分為黃色種子和棕色種子兩大類，研究表明黃籽具有極耐貯存的特點［3］，同時黃籽作為優(yōu)質(zhì)的榨油材料，具有含油量高、蛋白含量高等優(yōu)點，在油料開發(fā)方面具有極大的潛力［4］。因此，對種皮顏色形成關(guān)鍵物質(zhì)——原花青素的研究，對于白菜品質(zhì)育種具有重要的意義。

在對種皮顏色的研究中發(fā)現(xiàn)，蕓薹屬作物種皮顏色的多樣性，主要是由于原花青素含量的差異積累造成的，黃色種皮的出現(xiàn)是由于缺少原花青素的積累，使得種皮顏色呈現(xiàn)透明色，最終表現(xiàn)出種胚的顏色［5］。研究還發(fā)現(xiàn)，TTG1 的突變能夠影響種皮色澤的形成［6］。在白菜中，Zhang 等［1］利用有光澤、黃籽的白菜和有刺毛、黑籽的白菜構(gòu)建了一個DH 群體，用以研究白菜種皮顏色、刺毛這兩個性狀，結(jié)果顯示TTG1 基因同時控制著種皮顏色和表皮毛性狀，并且通過異源表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，TTG1 可以有效的恢復(fù)擬南芥種皮變黃的性狀。

TRANSPARENT TESTA GLABRA 1（TTG1）是一種WDR（WD repeat）蛋白，研究表明WDR 蛋白家族具有廣泛的生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)功能，如參與細(xì)胞分裂和胞質(zhì)移動、細(xì)胞程序性死亡、光信號感受和傳導(dǎo)、細(xì)胞運動、花發(fā)育、開花等過程［7］。TTG1 作為WDR 家族成員在大多數(shù)植物的系統(tǒng)發(fā)育過程中起著重要的作用［8-9］，包括葉毛、莖、根的形成，類黃酮和花青素的生物合成，種皮和種皮色素的發(fā)育［6］等。在種皮顏色形成中，MYB 和bHLH 蛋白與TTG1 能夠結(jié)合形成三元蛋白復(fù)合物，稱為MBW復(fù)合物（MBW complex）。三元復(fù)合體調(diào)控植物類黃酮代謝相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，從而催化花青素和原花青素的合成、修飾和轉(zhuǎn)運，使其在特定組織部位積累，是植物種皮顏色形成的關(guān)鍵調(diào)控復(fù)合體［10-12］。

本研究前期采用正向遺傳學(xué)的方法鑒定出TTG1為調(diào)控種皮顏色形成的候選基因，TTG1 的缺失突變導(dǎo)致了黃籽的產(chǎn)生［2-3］，但是在白菜中關(guān)于種皮原色形成的三元復(fù)合體尚未見報道?；诖耍狙芯恳郧捌讷@得的棕籽白菜自交系‘B147’為研究對象，構(gòu)建白菜種子酵母雙雜交文庫并篩選TTG1 互作蛋白，以期為闡釋白菜種皮顏色形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定良好的基礎(chǔ)，同時為其他作物種皮顏色形成機理的研究提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用棕籽白菜高代自交系‘B147’作為試驗材料，于2017 年3 月定植于西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院試驗基地，待抽薹開花后，選擇花期進(jìn)行自交授粉，獲得不同發(fā)育時期的新鮮種子（花期自交授粉后10、14、18、22、26、30、34 d），選擇原花青素開始積累后的不同發(fā)育時期的種子，包括14、18 和22 DAF 的種子，進(jìn)行cDNA 文庫的構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 cDNA 文庫構(gòu)建 參考TRIzol Reagent 試劑盒（Invirtrogen，USA）說明書分別進(jìn)行總RNA 的提取，根據(jù)Oligotex mRNA Midi Kit 說明書（QIAGEN，德國）進(jìn)行mRNA 分離純化，并進(jìn)行質(zhì)量評估及純度檢測，用于后續(xù)的文庫構(gòu)建。

參考CloneMinerTMII cDNA Library Construction Kit（Invirtrogen，USA）試劑盒說明書合成雙鏈cDNA 并與attB1 重組接頭連接，將cDNA 分級分離并回收500-4 000 bp 的雙鏈cDNA，采用BP 反應(yīng)將雙鏈cDNA 與pDONR222 載體連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌（Escherichia coli）DH10B 感受態(tài)細(xì)胞中，獲得初級文庫菌液。取菌液10 μL 稀釋100 倍后，取50 μL涂布于含有卡那霉素（Kan）的LB 平板進(jìn)行庫容量的鑒定。隨機挑選24 個克隆進(jìn)行菌落PCR，鑒定文庫的重組率和插入片段長度。文庫滴度（CFU/mL）=平板上的克隆數(shù)/平板上涂布菌液的體積（μL）×稀釋倍數(shù)（100）× 103μL；文庫總庫容（CFU）=文庫滴度（CFU/mL）×文庫菌液總體積（mL）。

從上述鑒定合格的初級文庫中抽提質(zhì)粒并稀釋至300 ng/μL，通過LR 重組反應(yīng)與pGADT7-DEST進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B 感受態(tài)細(xì)胞中，獲得次級文庫菌液，并按照上述相同的方法進(jìn)行庫容量、重組率和插入片段長度的鑒定。

1.2.2 誘餌載體pGBKT7-TTG1 的構(gòu)建與自激活性鑒定 根據(jù)TTG1 基因的序列［3］和pGBKT7 載體序列，設(shè)計TTG1 誘餌克隆的引物，引物上下游分別包含EcoR I 和BamH I 的酶切位點（上游引物為5'-CCGAATTCATGGACAACTCAGCTCCGGACTCC-3'，下游引物為5'-ACGGATCCTCAAACTCTAAGGAGCTG CATTTT-3'），以棕籽白菜‘B147’花期自交授粉后第14 天的種子總RNA 反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 第一鏈為模板，擴增獲得帶有EcoR I 和BamH I 酶切位點的TTG1 基因序列。采用EcoR I 和BamH I 雙酶切PCR 獲得的TTG1 基因產(chǎn)物，獲得含有酶切位點黏性末端的TTG1 基因序列并純化，同時采用EcoR I和BamH I 雙酶切pGBKT7 質(zhì)粒并純化，同樣獲得含有酶切位點黏性末端的線性化pGBKT7 質(zhì)粒載體，最后采用DNA 聚合酶將TTG1 基因融合到線性化的pGBKT7 質(zhì)粒載體上，獲得含有TTG1 基因的重組pGBKT7-TTG1 質(zhì)粒，參照Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System（Clontech，USA）操作手冊，將構(gòu)建好的pGBKT7-TTG1 載體質(zhì)粒以LiAc 法轉(zhuǎn)化Y2H Gold 菌株，并將重組質(zhì)粒整合到Y(jié)2H Gold 酵母菌株（Clontech，USA）基因組中，獲得酵母雙雜交TTG1-誘餌菌株。

以pGBKT7-Lam/pGADT7-T 為陰性對照、pGBKT7-53/pGADT7-T 為陽性對照、pGBKT7-TTG1/p-GADT7 為自激活檢測組，分別共轉(zhuǎn)至Y2H Gold 酵母菌株中，采用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl 溶液重新懸浮細(xì)胞并稀釋后，分別取50 μL 涂布于SD/-Trp/-leu/X-α-gal（陰性對照、陽性對照和自激活檢測組）、SD/-Trp 和SD/-Trp/X-α-gal/AbA（自激活檢測組）培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3-5 d 后，觀察菌落生長情況。

1.2.3 酵母雙雜交篩選TTG1 互作蛋白并驗證 取5 μL pGBKT7-TTG1 質(zhì)粒與10 μg 酵母文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化后，涂布于SD/-Trp/-Leu 平板上用以計算轉(zhuǎn)化效率，涂布于SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA 進(jìn)行初篩，將初篩平板上藍(lán)色陽性克隆轉(zhuǎn)移到二次篩選培養(yǎng)基SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/AbA 上進(jìn)行 高嚴(yán)謹(jǐn)度篩選，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-5 d，挑取平板上藍(lán)色菌落，并提取酵母質(zhì)粒，參考Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System 操作手冊，分別將Prey 質(zhì)粒與Bait 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Y2H Gold 菌株后涂布于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA 平板上進(jìn)行驗證，驗證正確的互作蛋白基因送至上海生工生物科技有限公司進(jìn)行測序，根據(jù)測序獲得的編碼候選互作蛋白的ORF 序列，參考NCBI 數(shù)據(jù)庫預(yù)測各候選互作蛋白的功能。

1.2.4 互作蛋白基因的克隆及生物信息學(xué)分析 參考大白菜基因組數(shù)據(jù)庫設(shè)計引物，上游序列為5'-AT GTCAGGTCCGTCTAGAAAGAACAT-3'，下游引 物為5'-CTACTCCATCTTCCCAATACCGATT-3'，以棕籽‘B147’的cDNA 為模板進(jìn)行MYB73 基因序列的擴增，擴增反應(yīng)體系如下：PrimeSTAR?Max DNA Polymerase 為10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板cDNA（100 ng/μL）為1.0 μL，用ddH2O 補充至20.0 μL。將反應(yīng)產(chǎn)物使用Universal DNA Purification Kit（TaKaRa，大連，中國）進(jìn)行純化，將膠回收產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α 感受態(tài)中，置于LB 平板上培養(yǎng)。挑單克隆進(jìn)行菌液PCR 檢測，陽性菌液送公司測序。

采用NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析，測序結(jié)果通過DNAMAN 軟件進(jìn)行分析整理，采用在線工具ExPaSy-Protparam 和ExPaSy-Translate［13］預(yù)測基因開放閱讀框編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、ExPaSy-ProtScale［13］分析氨基酸的親疏水性、SOPMA［14］軟件分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，利用MEGA X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 互作蛋白基因的表達(dá)分析 選取棕籽白菜‘B147’和黃籽白菜‘B80’生殖生長過程中，共7 個時期的新鮮種子，采用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（TaKaRa，大連，中國）提取總RNA，并檢測提取總RNA 的完整性、濃度及質(zhì)量。通 過PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大連，中國）試劑盒去除基因組DNA 及合成cDNA。

根據(jù)獲得的基因cDNA 序列，采用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計實時熒光定量PCR 引物，上游序列為5'-GAAGAACCGACAACGCTATCA-3'，下游引物 為5'-CCGTCAGTAACCGTATTCTCATT-3'，分析MYB73 基因在棕籽材料‘B147’不同發(fā)育時期的種子中的mRNA 積累水平。每個樣本3 次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)，采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 酵母文庫的構(gòu)建及鑒定

選用棕籽白菜高代自交系‘B147’花期自交授粉后14、18 和22 DAF 的種子提取總RNA 后，經(jīng)過mRNA 分離、純化、連接轉(zhuǎn)化涂板后，得到cDNA 初級文庫，平板計數(shù)顯示菌群數(shù)為3.0×106CFU/mL，克隆總數(shù)約為1 500 個，計算庫容量約為1.2×107CFU（圖1-A），隨機挑取24 個克隆進(jìn)行菌落PCR 鑒定，凝膠電泳結(jié)果顯示，24 個克隆均具有單一條帶，片段平均長度＞1 000 bp 且主要集中在1 000-2 000 bp（圖1-B），重組率為100%，達(dá)到初級文庫的要求。

圖1 文庫的構(gòu)建及鑒定Fig.1 Construction and identification of library

從上述鑒定合格的初級文庫中抽提質(zhì)粒，與pGADT7-DEST 進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化并涂板，得到次級文庫，菌群數(shù)為4.0×106CFU/mL，容量約為1.6×107CFU（圖1-C），隨機挑取24 個克隆進(jìn)行菌落PCR 鑒定，凝膠電泳顯示24 個克隆具有單一條帶，片段平均長度＞1 000 bp（圖1-D），重組率為100%，表明其多態(tài)性好。

提取文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Y187 酵母菌株，細(xì)胞密度為5.0×107cells/mL（圖1-E），隨機挑取24 個克隆進(jìn)行菌落PCR 電泳檢測，結(jié)果顯示插入片段均大于1 000 bp（圖1-F）。以上結(jié)果顯示該文庫滿足酵母cDNA 文庫要求，具備篩庫條件。

2.2 誘餌載體pGBKT7-TTG1的構(gòu)建與自激活性鑒定

根據(jù)TTG1 基因全長，擴增獲得目的片段1 014 bp，送公司測序后結(jié)果對比一致，使用同源重組方法獲得含有TTG1 基因的重組pGBKT7-TTG1 質(zhì)粒。提取重組質(zhì)粒，分別將陽性對照和陰性對照共轉(zhuǎn)至AH109 酵母感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞涂布于SD/-Leu/-Trp/X-α-gal 固體培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)。將自激活檢測組分別涂布于SD/-Leu/-Trp/X-α-gal、SD/-Leu/-Trp/-His/X-α-gal、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-αgal/AbA（200 ng/mL）固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。結(jié)果（圖2）顯 示，pGBKT7-53 和pGADT7-T 于SD/-Leu/-Trp/Xα-gal 培養(yǎng)基中有克隆生長且顏色藍(lán)色（圖2-A），pGBKT7-Lam 和pGADT7-T 于SD/-Leu/-Trp/X-α-gal培養(yǎng)基中有克隆生長但不變藍(lán)（圖2-B），pGBKT7-TTG1+pGADT7 于SD/-Leu/-Trp/X-α-gal 培養(yǎng)基上生長且變藍(lán)色（圖2-C），在SD/-Leu/-Trp/-His/X-α-gal 培養(yǎng)基上生長（圖2-D），說明pGBKT7-TTG1 質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入酵母菌株中，且在SD/-Leu/-Trp/-His/X-α-gal上存在自激活現(xiàn)象；在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-αgal/AbA 培養(yǎng)基上不生長（圖2-E），自激活活性受到抑制，說明SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal/AbA 篩選條件可以抑制pGBKT7-TTG1 的自激活，進(jìn)行后續(xù)的篩庫實驗。

圖2 pGBKT7-TTG1 誘餌載體的自激活鑒定Fig.2 Self-activation identification of pGBKT7-TTG1 bait vector

2.3 BrTTG1互作蛋白篩選

將pGBKT7-TTG1 質(zhì)粒與文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)至AH109 酵母感受態(tài)細(xì)胞，于SD/-Leu/-Trp/-His/X-αgal（TDO/X）篩選平板上進(jìn)行初次篩選，共有120個藍(lán)色克隆。轉(zhuǎn)化效率＞2×105CFU/μg，總轉(zhuǎn)化子數(shù)＞2×106CFU，挑取TDO/X篩選平板上的藍(lán)色克隆，轉(zhuǎn)到SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal/AbA（QDO/X/A）篩選平板上進(jìn)行二次篩選，共有82 個克隆生長藍(lán)色（圖3），隨后挑取上述82 個藍(lán)色克隆進(jìn)行搖菌，提取酵母質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抽提AD 質(zhì)粒后再與pGBKT7-TTG1 質(zhì)粒進(jìn)行一對一互作回轉(zhuǎn)驗證并測序，測序結(jié)果顯示，藍(lán)色克隆50、51、52 和53 的ORF 序列信息相同，預(yù)測為同一個基因，獲得44個陽性互作基因。對44 個陽性克隆測序結(jié)果進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示藍(lán)色克隆11、18、21、32、58 以及72 的序列信息不是完整的開放閱讀框，無法進(jìn)行后續(xù)的試驗，故排除這6 個陽性克隆，最終得到38 個測序正確陽性互作基因（圖4，表1）。

圖3 BrTTG1 在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal/AbA（QDO/X/A）平板篩選的藍(lán)色克隆Fig.3 Blue colonies screened by BrTTG1 in SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal/AbA（QDO/X/A）medium

圖4 BrTTG1 候選互作蛋白的一對一互驗證Fig.4 One-to-one verification of BrTTG1 candidate interaction protein

綜合分析這38 個基因，有一個陽性互作基因注釋為MYB44 基因，根據(jù)其測序的結(jié)果及其在BRAD（http://brassicadb.org/brad/）數(shù)據(jù)庫中比對結(jié)果聯(lián)合分析，確定該候選基因為大白菜MYB73 基因，推測該基因可能為參與MBW 三元復(fù)合體的候選基因。

2.4 MYB73基因的克隆及生物信息學(xué)分析

測序結(jié)果（圖5）顯示，白菜MYB73 基因CDS全長為987 bp，編碼328 個氨基酸的肽鏈，利用SMART 軟件進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測及分析，結(jié)果（圖6）顯示，MYB73 含有2 個典型的SANT-MYB 結(jié)構(gòu)域和MYB 型抑制子的保守基序C1-motif 和C2-motif，推測MYB73 屬于R2R3-MYB 類型抑制子，理化性質(zhì)分析顯示，該蛋白相對分子質(zhì)量35.36 kD，蛋白質(zhì)等電點為6.27，不穩(wěn)定指數(shù)為63.37，脂肪指數(shù)58.20，該蛋白富含Gly（13.7%）、Ser（10.7%）、Glu（8.8%）、Arg（7.0%），其中帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp,Glu）數(shù)為39 個，帶正電荷的氨基酸殘基（Arg,Lys）數(shù)為37 個。二級結(jié)構(gòu)分析顯示該蛋白中無規(guī)則卷曲占比最大，為62.5%；α-螺旋次之，占比26.83%，延伸鏈占比為7.01%，而β-轉(zhuǎn)角所占比例最小為3.66%。蛋白質(zhì)的碳端和氮端大多為α-螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，親水性分析顯示該蛋白為親水性蛋白。

圖5 MYB73 基因PCR 擴增電泳圖Fig.5 Electrophoretic map of MYB73 gene PCR amplification

圖6 MYB73 氨基酸序列與其他MYB 型抑制子序列比對圖Fig.6 Sequences alignment of MYB73 amino acid with other MYB type suppressors

選取已知的參與MBW 三元復(fù)合體的MYB 轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，包括R2R3-MYB 型激活子AtTT2（AED93980.1）、AtMYB5（NM_112200.3）、AaMYB3（MH_349476）、DkMYB2（AB_503699）、DkMYB4（AB_503701）、FaMYB1（AF_401220.1）、FaMYB9（OK_001453）、HtMYB2（MN887536.1）、MdMYB11（NM_001294029.1）、MdMYB12（HM122616）、MtMYB5（AES71860.2）、MtMYB14（JN157821）、TaMYB14（JN052773）和VvMYBPA1（NM_001281231），R2R3-MYB 型抑制 子AtMYB4（AB005889.1）、AtMYB6（NM_117014.3）、AtMYB7（NM_127224.6）和FaMYB1（AF_401220.1）。利用MEGA X 軟件，采用最大似然法重復(fù)1 000 次進(jìn)行MYB 轉(zhuǎn)錄因子的親緣關(guān)系分析，結(jié)果（圖7）顯示，所有的MYB 轉(zhuǎn)錄因子被聚為5 類，其中所有的MYB 激活子被聚為一類，AtMYB6 和AtMYB7 被聚為一類，MYB73、FaMYB1 和HtMYB2 分別單獨聚為一類。

圖7 MYB 轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析Fig.7 Phylogenetic relationships of MYB transcription factors

2.5 MYB73在棕籽和黃籽不同發(fā)育時期的表達(dá)特征分析

通過實時熒光定量PCR 分析MYB73 基因在棕籽白菜‘B147’和黃籽白菜‘B80’的7 個不同發(fā)育時期種子中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果（圖8）顯示，MYB73 基因在‘B147’的表達(dá)量始終高于在‘B80’中的表達(dá)量，且在14 d 時的表達(dá)量最高，該結(jié)果與TTG1 基因在‘B147’與‘B80’中的相對表達(dá)量趨勢一致，暗示著MYB73 可能參與了白菜種皮原花青素形成，從而影響種皮的顏色。

圖8 MYB73 基因在‘B147’與‘B80’不同時期發(fā)育種子中的相對表達(dá)量Fig.8 Relative expression of MYB73 in seeds at different development stages in ‘B147’ and ‘B80’

3 討論

隨著功能基因組學(xué)的發(fā)展，利用酵母雙雜交技術(shù)研究蛋白之間的相互作用已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一［15］。TRANSPARENT TESTA GLABRA 1（TTG1）作為WDR（WD repeat）蛋白，具有廣泛的生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)功能，Imamura等［16］認(rèn)為TTG1 是一種參與毛狀體形成的WD40 蛋白，WD40 結(jié)構(gòu)域的功能是能夠提高與其他蛋白的相互作用，具有廣泛的生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)功能，如參與細(xì)胞分裂和胞質(zhì)移動、細(xì)胞程序性死亡、光信號感受和傳導(dǎo)、細(xì)胞運動、花發(fā)育、開花等過程［7］。

本研究前期采用正向遺傳學(xué)的方法，鑒定出TTG1 為調(diào)控種皮顏色形成的候選基因，TTG1 的缺失突變導(dǎo)致了黃籽的產(chǎn)生［2-3］，但是在白菜中關(guān)于種皮原色形成的三元復(fù)合體尚未見報道，因此本研究首次開展了白菜種子組織酵母文庫的構(gòu)建，并篩選獲得與TTG1 相互作用的一個MYB 抑制子MYB73，在其他作物種皮色素的研究中，MYB和bHLH 蛋白與TTG1 可以形成MBW 復(fù)合物，調(diào)控植物類黃酮生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，從而催化花青素和原花青素的合成、修飾和轉(zhuǎn)運，使其在特定組織部位積累，是植物種皮顏色形成的關(guān)鍵調(diào)控復(fù)合體［10-12］。在擬南芥（Arabidopsis thaliaba）中，目前已經(jīng)報道了4 種MBW 復(fù)合物，包括TT2-TT8-TTG1、MYB5-TT8-TTG1、TT2-EGL3-TTG1 和TT2-GL3-TTG1，這些復(fù)合物在花青素積累中具有重要的調(diào)節(jié)作用［11］，此外，Liu 等［17］在對蒺藜苜蓿（Medicago truncatula Gaertn）種皮顏色的研究中發(fā)現(xiàn)，MtMYB5 和MtMYB14 能夠和bHLH、TTG1 形成單獨的MYB5/MYB14-TT8-TTG1 三元復(fù)合體，兩者之間還可以相互作用，最終形成MYB5-MYB14-TT8-TTG1 四元復(fù)合體調(diào)控蒺藜苜蓿種皮原花青素的積累，經(jīng)鑒定MtMYB5 和MtMYB14 均為激活型的R2R3-MYB。Zhu 等［18］通過對彩葉草（Solenostemon scutellarioides）SsMYB3 在擬南芥中的異位表達(dá)及酵母雙雜交試驗發(fā)現(xiàn)，彩葉草SsMYB3 可以與AtTT8 與AtTTG1 相互作用，以改變其三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。在轉(zhuǎn)基因煙草（Nicotiana tabacum）中，還發(fā) 現(xiàn)SsMYB3 能夠與煙草bHLH 蛋 白（NtAn1a 和NtJAF13-1）和一個WD40 蛋白NtAn11-1 相互作用增加濃縮單寧的積累。Zhao 等［19］發(fā)現(xiàn)煙草R2R3-MYB 因子NtMYB330 被表征為PA 特異性調(diào)節(jié)劑，其中PA 生物合成在NtMYB30 過表達(dá)系的花中被促進(jìn)，而在NtMYB330 突變體的花中減少，NtMYB330可以與類黃酮相關(guān)bHLH 伴侶NtAn1b 和WDR 蛋白NtAn11-1 相互作用，并且需要NtMYB330-NtAn1b復(fù)合物來實現(xiàn)PA 相關(guān)結(jié)構(gòu)基因NtDFR1、NtANS1、NtLAR1 和NtANR1 的強轉(zhuǎn)錄激活。Zhou 等［20］在桃子（Prunus persica）的研究中報道了桃子中的一個R2R3-MYB 抑制子PpMYB18，它可作為PA 積累的負(fù)調(diào)節(jié)劑；隨后Rajput 等［21］在香蕉（Musa nana L.）的研究中發(fā)現(xiàn)了R2R3-MYB 激活子和R2R3-MYB 抑制子可以相互作用調(diào)節(jié)原花青素的生物合成。Qu等［22］在對油菜（B.napus）黃籽的研究中發(fā)現(xiàn)，編碼R2R3-MYB 型轉(zhuǎn)錄因子的BnA09MYB47a 直接激活TT18 來促進(jìn)原花青素的積累。本研究中以TTG1作為誘餌蛋白，篩選出了白菜中與TTG1 相互作用的一個MYB 抑制子，與已知的參與MBW 三元復(fù)合體的MYB 蛋白均不同，可能是尚未被報道的能夠與TTG1 互作的R2R3-MYB 型抑制子，也是白菜種皮顏色中首次報道的R2R3-MYB 型抑制子。

綜合分析目前對于原花青素的研究，已經(jīng)報道了眾多能夠和bHLH、TTG1 相互作用促進(jìn)或抑制原花青素合成的MYB 轉(zhuǎn)錄因子，且報道的基因各不相同，說明在不同作物中，原花青素的調(diào)控可能有不同的MYB 轉(zhuǎn)錄因子參與。本研究為種皮原花青素的形成提供了新的MYB 轉(zhuǎn)錄因子，有助于完善種皮原花青素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)了一個能夠與TTG1 相互作用的MYB 蛋白，注釋為MYB73 基因，結(jié)合序列保守基序和系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果，說明MYB73 與已經(jīng)報道的參與MBW 三元復(fù)合體的MYB 蛋白均不同，可能是尚未被報道的能夠與TTG1 互作的R2R3-MYB型抑制子，這也是首次在白菜中發(fā)現(xiàn)調(diào)控原花青素形成的MYB 抑制子，暗示著白菜中可能存在不同MYB 轉(zhuǎn)錄因子參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響著原花青素的形成，為后期探究白菜種皮原花青素的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定良好的基礎(chǔ)。