三株無(wú)量山森林土壤芽孢桿菌鑒定及其生物活性挖掘

王楠 廖永琴 施竹鳳 申云鑫 楊童雨 馮路遙 矣小鵬唐加菜 陳齊斌 楊佩文

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650000；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，昆明 650205）

農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展是可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)文明建設(shè)的必由之路，在《“十四五”全國(guó)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展規(guī)劃》《全國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展規(guī)劃（2015-2030 年）》等政策的指導(dǎo)下，綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展得到了大力助推。多樣化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資源的形成得益于土壤中有效微生物資源的充分利用［1］，但在植物病害防治上仍面臨優(yōu)良菌株資源匱乏、菌株功能單一、難以在田間自然條件下定植、抗藥能力差等條件限制［2］，挖掘高效及功能多樣的菌株資源對(duì)充實(shí)生物防治資源，轉(zhuǎn)變傳統(tǒng)生產(chǎn)模式，構(gòu)建植物病害綠色防治技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義［3-7］。

拮抗微生物對(duì)作物根莖類(lèi)病害具有良好的防控作用，且對(duì)構(gòu)建健康土壤微生態(tài)，提高土壤有益微生物多樣性和豐富度具有顯著促進(jìn)作用［8］。目前應(yīng)用于植物病害生物防控的微生物包括細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌，其中細(xì)菌主要是芽孢桿菌（Baccillus sp.）和假單胞菌（Pesudomonas sp.）等［9］。前人研究表明，獨(dú)特的自然生境內(nèi)蘊(yùn)含豐富的具有生物防控潛力的菌株資源，Morais 等［10］從塞拉多-卡廷加交錯(cuò)帶森林分離的內(nèi)生木霉（Trichoderma）菌株對(duì)多種病原菌菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制活性。宋嘉寶等［11］從霉變雪茄（Cigarro）煙葉表面分離、純化的枯草芽孢桿菌（B.subtilis）和耐鹽芽孢桿菌（B.halotolerans），對(duì)籃狀菌屬（Talaromyces）、帚霉屬（Scopulariopsis）和曲霉屬（Aspergillus）的病原微生物具有良好的拮抗活性。Wen 等［12］從庫(kù)姆塔格沙漠中分離出具有較強(qiáng)的紫外輻照抗性和抗菌能力的鏈霉菌（Streptomycetaceae）。分離自小麥（Triticum aestivum L.）根際土壤的解淀粉芽孢桿菌，對(duì)禾谷鐮刀菌（F.graminearum）平均抑菌率達(dá)70%以上［13］。除了對(duì)植物病原菌高效地抑菌活性外，芽孢桿菌還可通過(guò)分泌次生代謝產(chǎn)物或揮發(fā)性物質(zhì)，在植株的生長(zhǎng)發(fā)育和抗性誘導(dǎo)上發(fā)揮作用［14］。Zhang 等［15］從鹽堿地分離出的解淀粉芽孢桿菌具有耐鹽堿、解磷和修復(fù)鉛污染的能力，這些功能與微生物在生存環(huán)境中的定殖及植物的生長(zhǎng)發(fā)育息息相關(guān)。

菌株功能的多樣性為植物病害的高效防治提供了保證，而在生防菌株挖掘過(guò)程中往往容易忽略對(duì)抑菌活性以外的功能活性進(jìn)行研究。本研究從菌株的特殊生境入手，考慮到目前生物資源豐富的無(wú)量山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)［16］，在潛在優(yōu)勢(shì)微生物資源活性和功能方面的挖掘和研究明顯不足。因此從中分離篩選拮抗活性強(qiáng)，且抑菌譜廣的可培養(yǎng)微生物，并針對(duì)有益于植物生長(zhǎng)、抗病的功能，驗(yàn)證其多樣化的生物活性，旨在提高植物病害綠色防控的高效性和可持續(xù)性，并為拮抗菌株的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)，充實(shí)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展所需的有效微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試土壤樣品：采樣地點(diǎn)位于云南省大理白族自治州無(wú)量山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，共5 個(gè)采樣小區(qū)，10 個(gè)樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)使用五點(diǎn)取樣法采集樣品，共采集得到50 份樣品，分裝于50 mL的無(wú)菌離心管中，帶回實(shí)驗(yàn)室做土壤細(xì)菌分離。

供試病原菌：番茄枯萎病菌（F.oxysporum f.sp.lycopersici）、香蕉枯萎病菌（F.oxysporum f.sp.cubense）、煙草炭疽病菌（C.micotianae）、煙草赤星病菌（Alternaria alternate）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、草果葉斑病菌（Phoma matteuciicola），由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所分離、鑒定與保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 本研究所用培養(yǎng)基如表1 所示。

表1 供試培養(yǎng)基成分Table 1 Composition of test media

1.2 方法

1.2.1 功能菌株的分離篩選 土壤細(xì)菌的分離：取2 g 混合均勻的土壤樣品于200 mL 的無(wú)菌水內(nèi)，28℃條件下加入適量玻璃珠搖瓶培養(yǎng)4-6 h，吸取200 μL 土壤溶液均勻涂布于NA 平板，28℃恒溫培養(yǎng)24 h 后挑取形態(tài)不同的細(xì)菌單菌落作為待測(cè)菌株。

初篩：以番茄枯萎病菌為指示菌，通過(guò)平板對(duì)峙法在PDA 培養(yǎng)基兩側(cè)分別接種待測(cè)菌、直徑5 mm 的病原菌，置于25-30℃的恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)5-7 d，選擇具有抑菌效果的菌株作為候選拮抗菌株。

復(fù)篩：以番茄枯萎病菌為指示菌，28℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h 得到各待測(cè)候選拮抗菌株發(fā)酵液，PDA 培養(yǎng)基中央接種直徑5 mm 的菌餅，在距離菌餅上下左右各2.5 cm 處各放置一個(gè)牛津杯，菌株發(fā)酵液12 000 r/min 離心5 min 后過(guò)無(wú)菌濾膜后，每個(gè)牛津杯接入200 μL 候選拮抗菌株無(wú)菌發(fā)酵液，以接無(wú)菌水為對(duì)照，置于25-30℃的恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)5-7 d，利用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)菌株發(fā)酵液的抑菌效果，選出拮抗活性強(qiáng)的菌株作為后續(xù)試驗(yàn)的研究對(duì)象。

1.2.2 功能菌株抑菌廣譜性測(cè)定 PDA 培養(yǎng)基中央接種直徑為5 mm 的供試病原菌菌餅，上下左右各2.5 cm 點(diǎn)接待測(cè)菌，以接無(wú)菌水為對(duì)照，置于25-30℃的恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)5-7 d，計(jì)算抑菌率。

菌株抑制率（%）=（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對(duì)照組菌落直徑-0.5 cm）×100%

1.2.3 功能菌株對(duì)番茄枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的影響 拮抗菌株與指示菌于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)平板對(duì)峙培養(yǎng)5-7 d，每處理3 個(gè)重復(fù)，挑選拮抗交界處菌絲制樣，將樣品浸沒(méi)于含有體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛固定液（pH 6.8）中，室溫固定4 h，4℃固定過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.8）漂洗3 次，每次間隔10 min；固定后用不同濃度梯度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%）脫水10 min，最后脫水用100%的乙醇脫水3 次，每次30 min；將樣品置于高真空中進(jìn)行干燥，在離子濺射儀內(nèi)噴金，最后在掃描電子顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察并拍照［19］。

1.2.4 功能菌株對(duì)番茄枯萎病菌孢子萌發(fā)的影響 病原菌培養(yǎng)15 d 后刮取分生孢子，加入無(wú)菌水過(guò)濾獲得病原菌孢子懸液，28℃下?lián)u床培養(yǎng)72 h 獲得功能菌發(fā)酵液，1∶1 等體積加入病原菌孢子懸浮液和功能菌的無(wú)菌發(fā)酵液至滅菌離心管制成混合液，以只加病原菌孢子懸液為對(duì)照，重復(fù)3 次，在25℃條件下孵育，于48 h 觀(guān)察孢子萌發(fā)情況，芽管長(zhǎng)度低于孢子短直徑的1/2 視為萌發(fā)受到抑制［20］。

1.2.5 功能菌株脂肽類(lèi)抗性基因PCR 檢測(cè) 取斜面保藏純化菌株，平板劃線(xiàn)法接種于NA 培養(yǎng)基上，挑取單菌落接種于NB 培養(yǎng)基，30℃ 180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，取1.5 mL 菌液10 000 r/min 離心處理5 min，去除上清液，用200 μL ddH2O 重懸，95℃沸水處理10 min，冰浴處理5 min，10 000 r/min 離心處理5 min，提取上清液為菌株DNA 模板。本研究所使用的10 對(duì)特異性引物（表2）均由北京擎科生物科技有限公司合成，利用上述特異性引物分別對(duì)菌株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為20 μL，具體參照申云鑫等［9］的方法：10×buffer 2.0 μL、dNTPs 1.6 μL、DNA 模板1.0 μL、Taq DNA 聚合酶 0.2 μL、上下游引物各1.0 μL、ddH2O 補(bǔ)滿(mǎn)體系。擴(kuò)增條件：98℃ 2 min；98℃ 10 s，52℃ 15 s（ituC）或54℃ 15 s（bymC）或 58℃ 15 s（srfA），72℃ 10 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min，擴(kuò)增結(jié)束后于4℃條件下保存?zhèn)溆?。使?.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，在凝膠成像系統(tǒng)中觀(guān)察檢測(cè)結(jié)果。

表2 脂肽類(lèi)抗性基因檢測(cè)引物Table 2 Detection primers for lipopeptide resistance genes

1.2.6 功能菌株促生及番茄枯萎病防治效果測(cè)定 刮取PDA 平板上28℃恒溫培養(yǎng)5-8 d 的病原菌，分散到6 g/L CMC（羧甲基纖維素鈉）溶液中制成孢子懸液，孢子濃度調(diào)至2.0×106CFU/mL。功能菌株28℃恒溫振蕩培養(yǎng)2-8 d，稀釋成2.0×108CFU/mL 的菌懸液。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且一致的盆栽苗，CK1 為空白組（單接無(wú)菌水）、營(yíng)養(yǎng)對(duì)照組CK2（單接NB 培養(yǎng)基）、對(duì)照組CK3（單接病原菌）、試驗(yàn)組（接種病原菌和功能菌），每個(gè)處理20 盆、每盆1 株，重復(fù)3 次，幼苗移栽定殖3 d 后，采用灌根的方式接種病原菌，每盆接種量為100 mL，待病原菌定殖3 d 接入等量功能菌懸液。30 d 后統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考王靜等［21］的方法：0 級(jí)為無(wú)癥狀；1 級(jí)為1 片或2 片葉子明顯變黃；2 級(jí)為3 片或4 片真葉變黃且葉片萎蔫下垂；3 級(jí)為5 片或6 片真葉變黃或真葉萎蔫下垂；4 級(jí)為全株嚴(yán)重萎蔫以致枯死。測(cè)定番茄苗的株高、根長(zhǎng)、莖葉鮮重、根鮮重、葉綠素含量等指標(biāo)，而后于180℃烘干至恒重，測(cè)定莖葉干質(zhì)量、根干重等指標(biāo)。

防效（%）=（對(duì)照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)）/對(duì)照組病情指數(shù)×100%

病情指數(shù)=Σ（各級(jí)病株數(shù)×該病級(jí)值）/（總株數(shù)×最高級(jí)值）×100

1.2.7 功能菌其他生物活性測(cè)定 產(chǎn)鐵載體功能測(cè)定時(shí)，先取0.060 5 g 鉻天青S 溶于50 mL 去離子水，加入0.002 7 g 氯化鐵攪拌混勻獲得A 液；再稱(chēng)取0.072 9 g 十六烷基三甲基溴化銨溶于40 mL 去離子水獲得B 液，將A 液緩慢倒入B 液攪拌均勻得CAS顯色液，將待測(cè)菌株點(diǎn)接于CAS 雙層顯色培養(yǎng)基的中心上層，若菌落周?chē)兗t或產(chǎn)生透明圈則表明有活性。解磷、解鉀、固氮、溶鋅、體外產(chǎn)酶功能測(cè)定時(shí)，將待測(cè)菌株點(diǎn)接于平板中心的上下左右各2.5 cm 處，置于28℃條件下恒溫箱暗培養(yǎng)24 h，觀(guān)察各功能平板是否有透明圈產(chǎn)生以檢測(cè)其相應(yīng)活性，觀(guān)察淀粉酶活性時(shí)需滴加盧戈氏碘液（碘5.0 g、碘化鉀10.0 g、蒸餾水加至100 mL）顯色?？股厮幟魴z測(cè)：取300 μL 菌株發(fā)酵液均勻涂布于NA 平板上，待平板干燥后將藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司）放置于平板中央，28℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)24 h觀(guān)察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，產(chǎn)生透明圈則證明菌株對(duì)相應(yīng)抗生素敏感，不產(chǎn)生則證明菌株對(duì)相應(yīng)抗生素不敏感。

1.2.8 功能菌株鑒定 平板劃線(xiàn)法接種拮抗活性菌株，28℃的恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)24-48 h 觀(guān)察并拍攝記錄掃描電子顯微鏡下的菌株形態(tài)，參照《伯杰氏系統(tǒng)分類(lèi)手冊(cè)》［22］和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［23］進(jìn)行形態(tài)特征和生理生化鑒定分析。

分子生物學(xué)鑒定：接種功能菌株至NB 液體培養(yǎng)基，30℃、180 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)，無(wú)菌條件下取樣測(cè)定菌液OD600值，當(dāng)OD600值近似于1（約1×109CFU/mL）時(shí)停止培養(yǎng)，用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 試劑盒提取菌株的基因組DNA。采用細(xì)菌16S rRNA 通用引物27F/1492R（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3',5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）、gyrA 基 因引 物F/R（5'-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3',5'-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3）、rpoB 基因引物2292F/3354R（5'-AGGTCAACTAGTTCAGTATGGAC-3',5'-AAGAACCGTAACCGGCAACTT-3'）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收，送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST 檢索后與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)種屬的基因序列進(jìn)行比較分析，選同源性較高的菌株的序列作為參比對(duì)象，用Clustal X 進(jìn)行多序列比對(duì)，并采用鄰接法（neighbor-joining）用Mega7.0 構(gòu)建供試菌株與參比菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 使用Excel 和SPSS Statistics 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 8.0 制圖。

2 結(jié)果

2.1 功能菌株分離篩選

經(jīng)過(guò)初篩，10 株菌株對(duì)番茄枯萎病菌具有較強(qiáng)的拮抗活性，抑菌率均在70%以上（表3），其中菌株SH-53、N4471 和N9456 的抑菌率最高，分別為92.35%、87.29%和88.47%，經(jīng)過(guò)復(fù)篩，菌株SH-53、N4471 和N9456 的無(wú)菌過(guò)濾發(fā)酵液對(duì)番茄枯萎病菌抑菌效果顯著高于其他菌株，故以該3 株菌株作為后續(xù)研究對(duì)象。

表3 功能菌株篩選結(jié)果Table 3 Results of screening functional strains

2.2 功能菌株抑菌廣譜性測(cè)定

3 個(gè)功能菌株對(duì)多種病原菌均表現(xiàn)良好拮抗活性（圖1），菌株SH-53 對(duì)香蕉枯萎病菌、煙草炭疽病菌、煙草赤星病菌、玉米大斑病菌、油菜菌核病菌、草果葉斑病菌拮抗活性分別達(dá)到75.3%、82.4%、84.1%、88.8%、81.2%、87.6%，菌株N4471 對(duì)香蕉枯萎病菌、煙草炭疽病菌、煙草赤星病菌、玉米大斑病菌、油菜菌核病菌、草果葉斑病菌抑菌率分別達(dá)71.8%、80.6%、77.6%、85.9%、77.6%、85.9%，菌株N9456 對(duì)香蕉枯萎病菌、煙草炭疽病菌、煙草赤星病菌、玉米大斑病菌、油菜菌核病菌、草果葉斑病菌的抑菌率分別達(dá)76.5%、81.8%、80.0%、87.1%、84.1%、90.6%。

圖1 功能菌株SH-53、N4471、N9456 抑菌譜Fig.1 Bacteriostatic spectrum of functional strain SH-53,N4471,and N9456

2.3 功能菌株對(duì)番茄枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

與正常的病原菌菌絲相比，在菌株SH-53 的影響下，番茄枯萎病菌菌絲發(fā)生畸形彎曲，部分節(jié)間腫大，還出現(xiàn)斷裂、泡囊結(jié)構(gòu)；菌株N4471 使番茄枯萎病菌的菌絲出現(xiàn)不規(guī)則形變，菌絲鈍化且菌絲量變少、節(jié)間縮短，菌絲發(fā)生斷裂；受菌株N9456影響，番茄枯萎病菌菌絲畸形、變短、數(shù)量減少、彎曲變細(xì)（圖2）。

圖2 功能菌株對(duì)番茄枯萎病菌菌絲的影響Fig.2 Effects of functional strains on the mycelia of Fusarium oxysporum causing tomato wilt disease

2.4 功能菌株對(duì)番茄枯萎病菌孢子萌發(fā)的影響

菌株SH-53、N4471、N9456 發(fā)酵液對(duì)番茄枯萎病菌的分生孢子萌發(fā)有明顯抑制作用。48 h 番茄枯萎病菌孢子萌發(fā)效果如圖3 所示，對(duì)照組大部分孢子長(zhǎng)出了明顯的芽管，而處理組大部分孢子還未產(chǎn)生芽管，或芽管長(zhǎng)度低于孢子短直徑的1/2。

圖3 番茄枯萎病菌孢子萌發(fā)（孵育48 h）顯微鏡觀(guān)察效果Fig.3 Microscopic observation of spore germination of tomato wilt bacterium F.oxysporum（Incubated for 48 h）

2.5 功能菌株脂肽類(lèi)抗性基因PCR檢測(cè)

對(duì)10 組功能基因進(jìn)行的PCR 檢測(cè)，結(jié)果（圖4）顯示，3 個(gè)功能菌株均具有脂肽類(lèi)抗性基因srfA（1 300 bp）、fenA（1 000 bp）、ituA（1 047 bp）、ituC（575 bp）、ituD（647 bp）、bymC（875 bp），其中菌株SH-53 和菌株N9456 還具有脂肽類(lèi)抗性基因sfp（675 bp）、fenB（1 600 bp）、bymA（1 200 bp），菌株N9456 還具脂肽類(lèi)抗性基因bymB（983 bp）。

圖4 功能菌株脂肽類(lèi)抗性基因PCR 電泳產(chǎn)物Fig.4 PCR electrophoresis products of lipopeptide synthesis genes in functional strains

2.6 功能菌株促生及番茄枯萎病防治效果

番茄幼苗經(jīng)功能菌株接種處理30 d 后，3 個(gè)功能菌株對(duì)番茄幼苗促生效果良好（圖5）。處理組SH-53、N4471、N9456 株高分別較空白對(duì)照組（CK1）顯著增加47.5%、38.9%和45.3%，分別較營(yíng)養(yǎng)對(duì)照組（CK2）增加34.6%、26.7%和32.5%；莖粗分別較對(duì)照組（CK1）增加64.9%、67.8%和61.5%，分別較營(yíng)養(yǎng)對(duì)照組（CK2）增加20.2%、22.3%和17.7%；根長(zhǎng)分別較對(duì)照組（CK1）增長(zhǎng)76.8%、36.4%和52.9%，分別較營(yíng)養(yǎng)對(duì)照組（CK2）增長(zhǎng)52.3%、17.5%和31.7%；地上部分鮮重分別較對(duì)照組（CK1）增重54.2%、52.8% 和69.4%，分別較營(yíng)養(yǎng)對(duì)照組（CK2）增重50.7%、49.2%和65.5%；地上部分干重分別較對(duì)照組（CK1）增重113.6%、165.4%和125.4%，分別較營(yíng)養(yǎng)對(duì)照組（CK2）增重47.5%、83.2%和55.6%；地下部分鮮重分別較對(duì)照組（CK1）增重49.3%、101.9%和86.5%，分別較營(yíng)養(yǎng)對(duì)照組（CK2）增重11.8%、51.2%和39.7%；地下部分干重分別較對(duì)照組（CK1）增重214.3%、278.6%和150.0%，分別較營(yíng)養(yǎng)對(duì)照組（CK2）增重109.5%、152.4%和66.7%（表4）。

圖5 番茄苗促生效果圖Fig.5 Growth-promoting effect diagram on tomato seedling

表4 功能菌株對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)的影響Table 4 Effects of functional strains on the growths of tomato seedlings

處理30 d 后，接種病原菌孢子懸浮液處理的番茄苗表現(xiàn)出莖基部皺縮的癥狀，且葉片自下而上逐漸發(fā)黃枯萎，剖開(kāi)莖基部維管束明顯呈現(xiàn)褐色發(fā)黑狀。只接種病原菌的對(duì)照組（CK3）發(fā)病較為嚴(yán)重，病情指數(shù)達(dá)75.6，在混接病原菌及功能菌株SH-53、N4471、N9456 發(fā)酵液處理下，番茄幼苗發(fā)生番茄枯萎病的病情指數(shù)顯著降低為11.7、33.9、30.0，表明3 株功能菌對(duì)番茄枯萎病均有顯著的抑制作用（P＜0.05），功能菌株SH-53、N4471、N9456 對(duì)番茄枯萎病的防治效果分別為84.7%、55.0%、59.7%。表明3 個(gè)菌株均能有效抑制番茄枯萎病的發(fā)生，其中以菌株SH-53 的防治效果最好，其植株健康狀態(tài)與營(yíng)養(yǎng)對(duì)照組（CK2）的番茄幼苗無(wú)明顯差異（圖6）。

圖6 功能菌株對(duì)番茄幼苗枯萎病的防控效果Fig.6 Effects of functional strains on the prevention and control of tomato fusarium wilt

2.7 功能菌株其他生物活性測(cè)定

研究結(jié)果表明（圖7），3 株功能菌均具有溶鋅功能，均能分泌蛋白酶、淀粉酶，菌株SH-53、N4471 還具有解磷、固氮的功能，并具有分泌纖維素酶及產(chǎn)鐵載體的能力。菌株SH-53 對(duì)青霉素、氨芐西林不敏感，對(duì)紅霉素、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素敏感；菌株N4471 對(duì)慶大霉素敏感，而對(duì)紅霉素、鏈霉素、四環(huán)素、青霉素、萬(wàn)古霉素、氨芐西林不敏感；菌株N9456 對(duì)青霉素、氨芐西林、紅霉素、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素均表現(xiàn)出不同程度的敏感。

圖7 菌株生物活性測(cè)定結(jié)果Fig.7 Results of strain biological activity assay

2.8 功能菌株鑒定結(jié)果

3 個(gè)功能菌在NA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及掃描電鏡下的形態(tài)如圖8 所示，3 個(gè)菌株在掃描電鏡下均表現(xiàn)為桿狀形態(tài)，菌株SH-53 菌落中心呈乳白色，邊緣半透明，產(chǎn)色素，菌落形狀不規(guī)則呈褶皺狀，邊緣整齊，較規(guī)整，菌落表面黏稠，略微凸起。菌株N4471 菌落中心呈乳白色，邊緣半透明，不產(chǎn)色素，菌落形狀不規(guī)則，略呈放射狀，較規(guī)整。菌株N9456 菌落中心呈乳白色，黏液狀且形狀不規(guī)則，具有整個(gè)邊緣且邊緣半透明，略微凸起，不產(chǎn)色素。經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定菌株SH-53、N4471、N9456 為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。

圖8 功能菌株菌落形態(tài)及掃描電鏡圖Fig.8 Colony morphology and scanning electron microscopy of functional strains

生理生化鑒定結(jié)果（表5）顯示，3 個(gè)菌株均為革蘭氏陽(yáng)性菌，需氧且均能產(chǎn)生芽孢，接觸酶、V-P實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性，且均能發(fā)生硝酸還原反應(yīng)及使明膠液化，此外菌株SH-53、N4471 還具有產(chǎn)吲哚的能力。

經(jīng)NCBI Blastn 搜索并 與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)種屬基因序列比較分析后，菌株SH-53、N4471、N9456 屬于芽孢桿菌屬。菌株SH-53 與B.amyloliquefaciens ZJU1，菌株N4471 與B.cabrialesii TE3，菌株N9456 與B.siamensis LS5 分別處于同一獨(dú)立分支，且其引導(dǎo)支持率分別達(dá)到100%、100%、99%（圖9）。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化特征，鑒定菌株SH-53 為解淀粉芽孢桿菌，菌株N4471 為卡式芽孢桿菌，菌株N9456 為暹羅芽孢桿菌。

圖9 菌株SH-53、N4471 和N9456 基于16S rRNA、gyrA、rpoB 序列的系統(tǒng)分析發(fā)育樹(shù)Fig.9 Phylogenetic trees of the strain SH-53,N4471 and N9456 based on 16S rRNA,gyrA,and rpoB sequences

3 討論

芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）作為植物病害生物防治的主要微生物種群，具有抑菌譜廣、抗逆性高和不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)［24］。3 株芽孢桿菌SH-53、N4471、N9456 對(duì)自然環(huán)境適應(yīng)性良好，除番茄枯萎病菌以外，對(duì)香蕉枯萎病菌、煙草炭疽病菌、玉米大斑病菌等多種病原菌均有良好抑菌活性。從微觀(guān)角度探尋菌株高效抑菌的機(jī)制，本研究發(fā)現(xiàn)3 株拮抗菌對(duì)番茄枯萎病菌菌絲均有不同程度的破壞、致畸作用。前人研究表明，芽孢桿菌在生長(zhǎng)代謝的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，其中包括具有廣譜抑菌活性的脂肽類(lèi)抗生素，如polymyxins、surfactins、iturins、fengycins 等［25］，許本宏［26］通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脂肽類(lèi)化合物iturin A 和bacillomycin F 能使菌絲發(fā)生變形、畸形發(fā)育而破壞其生長(zhǎng)，而3 株拮抗菌均具有srfA、fenA、ituA、ituC、ituD、bymC 等脂肽類(lèi)抗性基因，表明其高效廣譜的抑菌活性可能來(lái)自于這些基因的高效表達(dá)，通過(guò)脂肽類(lèi)抗生素的合成來(lái)抑制菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育。

菌株SH-53、N4471、N9456 分別被鑒定為解淀粉芽孢桿菌、卡式芽孢桿菌和暹羅芽孢桿菌，對(duì)番茄枯萎病防效良好，國(guó)內(nèi)外均有學(xué)者驗(yàn)證了這些種群作為生防菌株的應(yīng)用潛力。解淀粉芽孢桿菌作為一種重要的生防微生物，具有防治植物病害、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、改善根際土壤微生物種群結(jié)構(gòu)等作用［27］，該種群對(duì)橡膠樹(shù)炭疽病菌（C.acutatum）、水稻基腐病菌（Dickeya zeae）、西瓜枯萎病菌（F.oxysporum f.sp.niveum）等多種病原物都有良好的抑菌活性［28-30］?？ㄊ窖挎邨U菌也被證實(shí)在小麥種植過(guò)程中具備生防促生潛力［31］，并對(duì)番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）具有較強(qiáng)抑菌活性［32］。暹羅芽孢桿菌［33］對(duì)附子白絹病菌（Sclerotium rolfsii）、花生冠腐病菌（Aspergillus niger）、灰葡萄孢等也有較好抑菌效果［34-36］。雖然生防微生物自身具備病原拮抗能力，但投放田間后常常會(huì)因農(nóng)藥施用或殘留等影響，影響種群數(shù)量，進(jìn)而影響生防效果［2］。菌株SH-53、N4471 對(duì)多種抗生素的抗性，將有助于提高其在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中的穩(wěn)定性。不僅如此，菌株包括分泌蛋白酶、溶鋅、產(chǎn)鐵載體在內(nèi)的諸多生物活性，也被證實(shí)能通過(guò)改善農(nóng)藝性狀、提高土壤肥力、促進(jìn)土壤中難溶性化合物的降解［37］等提高植物的抗病能力。肖瑀軒等［38］分離的暹羅芽孢桿菌CML548 能同時(shí)產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶，并發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)良的益生性狀。褚睿等［39］發(fā)現(xiàn)具解鉀、分泌蛋白酶、鐵載體功能的貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）N6 對(duì)黃瓜（Cucumis L.）幼苗生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用。土壤中的鐵元素通常以氧化物等溶解度極低的形式存在，微生物產(chǎn)生的鐵載體，可以特異螯合Fe3+，促進(jìn)植物對(duì)鐵元素的吸收［40］。另外環(huán)境中鋅離子濃度過(guò)高也會(huì)影響菌株生物膜的形成［41］，進(jìn)而影響其拮抗病原菌的能力。Sellappan 等［42］發(fā)現(xiàn)配施可溶性鋅肥和可溶鋅的芽孢桿菌，有助于提高玉米（Zea mays L.）籽粒的生長(zhǎng)及產(chǎn)量特性和養(yǎng)分積累。故菌株的抗病能力及各種生物活性的加持有利于應(yīng)用過(guò)程中作物的生物強(qiáng)化。

本研究所篩選菌株的優(yōu)勢(shì)在于其高效廣譜的抗病能力及豐富的生物活性，如何有針對(duì)性地提高其抗病能力并發(fā)揮生物活性的功效，在生產(chǎn)實(shí)踐中是不可忽略的環(huán)節(jié)。后續(xù)可通過(guò)菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化來(lái)提高其生長(zhǎng)量和抑菌效果，并尋找生物相容性強(qiáng)的載體、助劑提高其穩(wěn)定性，從而提升生物菌劑的開(kāi)發(fā)速度，降低菌株開(kāi)發(fā)成本，為植物病害綠色防控充實(shí)微生物菌株資源。

4 結(jié)論

本研究篩選的3 株生防芽孢桿菌（SH-53：解淀粉芽孢桿菌，N4471：卡式芽孢桿菌，N9456：暹羅芽孢桿菌）具有高效廣譜的抑菌活性，可分泌蛋白酶和淀粉酶，且具有溶鋅的功能，并具有srfA、fenA、ituA、ituC、ituD、bymC 等脂肽類(lèi)抗性基因，可顯著降低番茄枯萎病病情指數(shù)，并對(duì)番茄植株生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。