日本落葉松LkF3H2 基因克隆及調控類黃酮代謝功能研究

李燦 蔣湘寧 蓋穎

（1.林木遺傳育種全國重點實驗室 北京林業(yè)大學生物科學與技術學院，北京 100083；2.樹木花卉育種生物工程國家林業(yè)和草原局重點實驗室，北京 100083）

黃酮類化合物是植物中含量豐富的次生代謝產物，參與植物生長發(fā)育、脅迫響應（抗逆性、抗病性、抗紫外線等）和花色形成等過程［1-2］。

黃烷酮3-羥化酶（F3H）在黃酮類化合物的代謝中發(fā)揮著關鍵作用，它能催化底物柚皮素和圣草酚轉化為二氫山奈酚和二氫槲皮素［3］，是黃酮醇生物合成的中間體。F3H 基因的cDNA 最早于1991 年從金魚草中分離出來，隨后不斷被學者研究。Jiang等［4］從草莓中克隆得到了F3H 基因并發(fā)現該基因在花青素生物合成途徑的早期將黃烷酮轉化為了二氫黃烷醇［4］。另外，有研究表明水稻中F3H 同源基因在植物抵御生物和非生物脅迫方面發(fā)揮著重要作用［5］。同樣地，F3H 基因功能還在擬南芥［6］、龍眼［7］、水稻［8］、三角梅［9］等物種中被研究。然而F3H 基因在日本落葉松中發(fā)揮的具體功能還沒有得到研究。

本研究根據實驗室前期日本落葉松轉錄組數據克隆獲得LkF3H2 基因并對其進行生物信息學分析及組織表達模式分析；同時將該基因穩(wěn)定轉化到煙草中，利用熒光定量PCR 技術檢測轉基因煙草不同組織中的基因表達，并分析了轉基因煙草中類黃酮的含量。研究結果為LkF3H2 基因在日本落葉松黃酮類化合物代謝調控過程中發(fā)揮功能研究提供了一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

日本落葉松幼苗種植于溫室營養(yǎng)土中，光周期為16 h 光/8 h 暗，溫度為23℃。用于轉基因的煙草（NT78）在Murashige Skoog 培養(yǎng)基上生長，培養(yǎng)基中添加4.74 g/L MS、30 g/L 蔗糖和6 g/L 瓊脂，調節(jié)pH 至5.8。本實驗中DH5α 菌株、pTOPO 載體、GV3101 菌株、反轉錄試劑盒、目的片段回收試劑盒、質粒提取試劑盒、RNA 提取試劑盒、熒光定量試劑盒均購于北京艾德萊生物科技有限公司，高保真 酶PrimeSTAR?Max DNA polymerase 購 于TaKaRa公司，植物類黃酮檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取與cDNA 合成 取3 株日本落葉松幼苗置于研缽中，加入液氮研磨成粉末，依據RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒說明書進行RNA 提取與cDNA 合成，用1%的瓊脂糖凝膠檢測RNA 質量，Nanodrop 微量分光光度計檢測RNA 濃度。

1.2.2 LkF3H2 基因克隆 以日本落葉松幼苗cDNA為模板，基于本實驗室前期轉錄組數據中基因參考序列設計兩對引物LkF3H2-1F（5'-ATGGCGCCCGCAGCAGTTGTGGCTA-3'）、LkF3H2-1R（5'-GTTGATCTTCTCAACAGTGGAATTC-3'）和LkF3H2-2F（5'-ATGGCGCCCGCAGCAGTTGTGGCTA-3'）、Lk-F3H2-2R（5'-GTTGATCTTCTCAACAGTGGAATTC-3'）。利用巢式PCR 進行目的基因克隆，隨后連接pTOPO 載體并送測序。

1.2.3 生物信息學分析 使用 ExPASy 分析 LkF3H2蛋白基本理化性質，使用 SignalP 預測LkF3H2 蛋白信號肽，使用相應在線分析網址預測蛋白質二、三級結構及結構域預測，使用MEGA7 將LkF3H2 蛋白與火炬松（登錄號：QBI90549.1）、輻射松（登錄號：AGY80772.1）、白云杉（登錄號：QBI90547.1）、歐洲云杉（登錄號：QBI90546.1）、銀杏（登錄號：AAU93347.1）、蓮（登錄號：XP_010268217.1）、陸地棉（登錄號：NP_001314423.1）、苦蕎麥（登錄號：ACQ99190.1）、沙梨（登錄號：ADP09378.1）、藥葵（登錄號：UOI87842.1）、擬南芥（登錄號：NP_190692.1）11 個物種的F3H2 蛋白進行氨基酸序列比對及系統(tǒng)進化樹構建。

1.2.4 轉基因煙草的篩選與鑒定 采用葉盤法轉化煙草，轉化后的煙草首先在MS 培養(yǎng)基中22℃ 暗培養(yǎng)2 d，隨后轉入再生培養(yǎng)基中于22℃ 光照16 h/黑暗8 h 的條件培養(yǎng)，大約4 周后將長出來的煙草芽轉入生根培養(yǎng)基中，待幼苗生根后栽植于土壤中。消除農桿菌影響2-3 周后，采用CTAB 法提取抗性苗葉片DNA，PCR 擴增鑒定轉基因煙草。

1.2.5 實時熒光定量分析 分別取一月齡、一年生日本落葉松和二月齡轉基因煙草的根、莖、葉于研缽中加入液氮研磨成粉末，隨后參照1.2.1 中方法進行RNA 提取與cDNA 合成，根據克隆得到基因序列設計熒光定量引物F3H2-F（CCAACGCCTGTGCTGAATG）、F3H2-R（CTCACCACAAATCCTCCACG），以煙草Actin 基因（登錄號：107821481）和落葉松EF1A 基因（登錄號：JX157845）為內參，體系為20 μL：2×SYBR qMix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL，cDNA 1 μL。PCR反應條件：95℃ 2 min；95℃ 變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

1.2.6 轉基因煙草類黃酮含量測定 取3 株生長狀況一致的轉基因煙草根、莖和葉60℃烘干并研磨成粉末，隨后具體實驗操作參照植物類黃酮檢測試劑盒說明書。實驗共重復3 次。

2 結果

2.1 LkF3H2基因克隆

以日本落葉松cDNA 為模板進行目的片段擴增得到一條1 100 bp 的單一條帶（圖1），測序正確后將該條帶命名為LkF3H2 基因（登錄號：OP970996）。

圖1 LkF3H2 基因克?。∕arker: DL2000）Fig.1 Cloning of LkF3H2 gene（Marker: DL2000）

2.2 LkF3H2氨基酸序列分析及蛋白進化分析

日本落葉松LkF3H2 基因cDNA 序列開放閱讀框包含1 074 個核苷酸，可編碼358 個氨基酸。對LkF3H2 蛋白理化性質進行預測，分子式C1785H2807N481O541S18，蛋白分子量為40.24 kD，理論等電點為5.28，不穩(wěn)定系數47.69，親水性為 -0.352，說明該蛋白是不穩(wěn)定的親水性蛋白。信號肽預測顯示該蛋白不含信號肽和前導肽。氨基酸序列比對顯示日本落葉松LkF3H2 蛋白序列與火炬松（Pinus taeda）、輻射松（Pinus radiata）、白云杉（Picea glauca）、和歐洲云杉（Picea abies）F3H 蛋白序列高度同源（圖2）。

圖2 LkF3H2 蛋白氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid sequence alignment of LkF3H2 protein

LkF3H2 蛋白二級結構分析表明該蛋白結構以無規(guī)卷曲為主，占40.50%，其次為α-螺旋，占35.75%，延伸鏈占18.44%，占比最低的是β-折疊，為5.31%（圖3-A）。在三級結構分析中，分別以序列一致性為30.53%的擬南芥花青素合成酶（圖3-B）和序列一致性為34.17%可能的2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶At5g05600 為模板進行同源建模（圖3-C）。結構域預測顯示該蛋白含有保守結構域2OG-Fe（II）oxygenase superfamily，位于202-300 bp 之間（圖3-D），屬于2-酮戊二酸依賴性雙加氧家族成員之一。

圖3 LkF3H2 蛋白二三級結構預測、保守結構域預測Fig.3 LkF3H2 protein secondary and tertiary structure prediction,conserved domain prediction

日本落葉松LkF3H2 蛋白與其他11 個物種F3H蛋白構建系統(tǒng)進化樹，結果表明日本落葉松與火炬松、輻射松、白云杉和歐洲云杉等物種親緣關系較近，這些物種均為裸子植物。但與陸地棉、藥葵、擬南芥等物種親緣關系較遠（圖4）。說明F3H 蛋白在同一種屬生物中進化保守。

2.3 日本落葉松組織中LkF3H2基因的表達分析

以LkF3H2 基因在根中表達量為參照，在一月齡日本落葉松幼苗中，LkF3H2 基因在莖中表達量是根中的0.9 倍，在葉中的表達量是根中的2.1 倍；并且根與葉、莖與葉之間的基因表達量差異極顯著。這表明一月齡日本落葉松幼苗葉中的LkF3H2 基因表達量最高，其次為根、莖中表達量最低。然而隨著幼苗的生長，在一年生落葉松中LkF3H2 基因表達量發(fā)生變化，同樣以根中表達量做對照，莖中的表達量是根中的2.5 倍，葉中的表達量是根中的1.4倍；并且根與葉、莖與葉之間表達量差異極顯著，根與葉之間表達量差異較顯著。這表明一年生落葉松中LkF3H2 基因在莖中的表達量增加，遠遠大于在葉和根中的表達量（圖5）。LkF3H2 基因可能在日本落葉松生長發(fā)育不同階段發(fā)揮著不同的作用。

圖5 LkF3H2 基因在日本落葉松中不同組織部位表達量變化Fig.5 Expressions of LkF3H2 gene in different tissues in Larix kaempferi

2.4 轉基因煙草的鑒定及LkF3H2基因在轉基因煙草中組織表達分析

經預培養(yǎng)、再生培養(yǎng)、生根培養(yǎng)及煉苗4 個階段獲得LkF3H2 基因過表達煙草植株，對這些植株進行PCR鑒定獲得了一條大小為473 bp的目的條帶，與陽性對照條帶一致，陰性對照無條帶，這表明該基因成功轉入到煙草中（圖6）。

圖6 轉基因煙草生長發(fā)育各階段Fig.6 Growth and development stages of transgenic tobacco

隨后我們對轉基因煙草不同組織部位中LkF3H2基因表達量進行了分析，以根中表達量做對照，莖中表達量是根中的1.1 倍，葉中表達量是根中的2.1倍。這表明LkF3H2 基因在葉中表達量最高，這與在一月齡日本落葉松幼苗中表達程度相一致，其次為莖，根中的表達量最低（圖7）。此外顯著性分析表明根與莖之間的差異顯著，莖與葉之間差異極顯著?？傊D基因煙草不同部位LkF3H2 基因表達量由高到低依次為：葉、莖、根。

圖7 轉基因煙草中LkF3H2 基因表達量與類黃酮含量Fig.7 Expression of the LkF3H2 gene and flavonoid content in transgenic tobacco

2.5 轉基因煙草中類黃酮含量與LkF3H2 基因表達量關系的分析

轉基因煙草葉中的類黃酮含量為6.8 mg/g，莖中的類黃酮含量為5.4 mg/g，根中類黃酮含量為4.1 mg/g。這表明轉基因煙草葉中的類黃酮含量最高，其次為莖和根；葉中類黃酮含量是根中的1.66 倍，莖中類黃酮含量是根中的1.31 倍。轉基因煙草中不同組織部位類黃酮含量分布與LkF3H2 基因表達模式一致。另外顯著性分析表明，根與莖、莖與葉、根與葉不同組織之間類黃酮含量差異極顯著，相關性分析表明，轉基因煙草中類黃酮含量與LkF3H2基因表達量呈正相關關系（圖7）。以上結果說明了類黃酮含量與LkF3H2 基因表達量之間呈正相關，日本落葉松LkF3H2 基因在類黃酮的合成代謝過程中發(fā)揮著重要作用。

3 討論

黃烷酮3-羥化酶基因（F3H）屬于2-酮戊二酸雙加氧家族，該家族基因在生物響應脅迫過程及黃酮類化合物合成代謝中發(fā)揮著重要作用［10］。前期有研究表明檸條錦雞兒（Caragana korshinskii Kom.）CkF3H 基因在適應低溫、高鹽、干旱和高溫脅迫的過程中發(fā)揮作用［11］。另外，朱順華等［12］發(fā)現野生胡蘿卜（Daucus carota L.）DcF3H 基因表達量與類黃酮含量呈不顯著正相關關系。然而日本落葉松F3H 基因在生物響應脅迫及黃酮類化合物合成代謝中的相關功能并沒有被研究。在本研究中，我們對日本落葉松LkF3H2 基因進行了克隆、氨基酸序列及進化分析、組織表達分析，隨后將該基因穩(wěn)定轉化煙草并對LkF3H2 基因過表達轉基因煙草進行組織表達分析及類黃酮測定，分析LkF3H2 基因表達量與類黃酮含量之間的相關性，從而為LkF3H2 基因表達調控研究及LkF3H2 基因在日本落葉松黃酮類化合物代謝調控過程中發(fā)揮功能研究提供了一定的參考依據。

日本落葉松LkF3H2 蛋白基本理化性質分析表明該蛋白是不穩(wěn)定的親水性蛋白，氨基酸序列比對及系統(tǒng)進化分析顯示LkF3H2 蛋白序列與火炬松、輻射松、白云杉和歐洲云杉LkF3H 蛋白序列高度同源且物種親緣關系較近，說明LkF3H2 蛋白在進化過程中具備一定的保守性。同樣地，將長葉紅砂（Reaumuria trigyna）RtF3H3 與其他物種F3H 蛋白進行系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現RtF3H3 與川桑（Morus notabilis）、胡楊（Populus euphratica）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、大豆（Glycine max）和煙草（Nicotiana tabacum L.）等植物F3H 同源性較高［13］。隨 后LkF3H2 蛋白二級結構分析表明該蛋白結構以無規(guī)卷曲為主，其次為α-螺旋，占比最低的是β-折疊。蛋白三級結構分析及結構域預測顯示該蛋白含有保守結構域2OG-Fe（II）oxygenase superfamily，位于202-300 bp 之間，屬于2-酮戊二酸雙加氧家族。另外，陳可欣等［14］也發(fā)現紫薇（Lagerstroemia indica L.）LiF3H 蛋白中含有PcbC 保守結構域和2OG-Fe（II）oxygenase superfamily 結構域。

基因表達量與基因調控模式之間具備緊密的關系［15-16］，因此在本實驗中我們分別對一月齡和一年生日本落葉松幼苗不同組織部位LkF3H2 基因表達量進行了研究發(fā)現，在一月齡日本落葉松幼苗中，LkF3H2 基因在葉中表達量最高，在莖中表達量最低。然而隨著幼苗的生長，在一年生落葉松中LkF3H2基因在莖中的表達量增加，遠遠大于在葉和根中的表達量。這表明了LkF3H2 基因在日本落葉松生長發(fā)育不同階段發(fā)揮著不同的功能。Khumkarjorn等［17］通過RT-qPCR 分析5 個不同發(fā)育階段的蘭花（Cymbidium）中AcF3H 基因的表達顯示AcF3H基因在未開放的花蕾中含量豐富，在部分開放和完全開放的花中表達量逐漸下降。同樣地，有研究表明小麥（Triticum aestivum）F3H 三個同源基因在果皮、莖、胚芽鞘和葉等部位均表達，可能參與了類黃酮化合物的生物合成［18］。

轉基因技術在基因功能研究中應用廣泛［19］，我們將LkF3H2 基因穩(wěn)定轉化到煙草中，對基因過表達煙草植株進行組織表達分析及類黃酮測定，煙草葉中顯示了最高的LkF3H2 基因表達量和類黃酮含量，其次為莖和根。并且相關性分析表明轉基因煙草中類黃酮含量與LkF3H2 基因表達量呈正相關關系。這些結果說明了LkF3H2 基因在日本落葉松類黃酮合成代謝過程中發(fā)揮著關鍵功能。值得一提的是，在鐵皮石斛（Dendrobium officinale）中，F3H基因主要在花中積累，其次是根、莖和葉，這種模式與類黃酮分布一致［20］。另外，桑樹（Morus alba L.）MazsF3H 基因在莖、葉、柱頭和子房中表達，芽中不表達，并且MazsF3H 表達水平在富含花青素的果實成熟過程中與花青素含量呈正相關［3］。這些研究都表明F3H 基因在類黃酮生物代謝過程中發(fā)揮著關鍵功能，然而其具體調控機制還需要進一步研究。

4 結論

本研究從日本落葉松中克隆得到LkF3H2 基因，該基因屬于2-酮戊二酸依賴性雙加氧家族且與火炬松、輻射松、白云杉和歐洲云杉等物種親緣關系較近。同時，LkF3H2 基因在日本落葉松不同發(fā)育階段不同組織中均表達，其中在一月齡幼苗葉中表達量最高，在一年生幼苗莖中表達量最高。另外該基因轉化煙草后，轉基因煙草葉中LkF3H2 基因表達量和類黃酮含量最高，其次為莖和根，相關性分析表明轉基因煙草中類黃酮含量與LkF3H2 基因表達量之間呈正相關關系，這些結果表明了日本落葉松LkF3H2基因在類黃酮生物合成代謝過程中發(fā)揮著重要功能。