嗜熱毀絲菌裂解性多糖單加氧酶TtLPMO9I 的酶學(xué)性質(zhì)及其功能研究

鄭菲 楊俊釗 牛羽豐 李蕊麟 趙國柱

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

纖維素能夠轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖類，生產(chǎn)出具有重要應(yīng)用價(jià)值的工業(yè)產(chǎn)品，這對于解決當(dāng)今世界面臨的環(huán)境污染、糧食短缺、飼料資源緊張和能源危機(jī)等問題都具有重要的現(xiàn)實(shí)意義［1］。傳統(tǒng)的纖維素降解酶系能夠有效的將木質(zhì)纖維素資源轉(zhuǎn)化為小分子糖類，因此得到了廣泛應(yīng)用。近年來，研究人員不斷挖掘出一些新型的木質(zhì)纖維素降解輔助酶（auxiliary activities,AA），包括漆酶、過氧化物酶、纖維二糖脫氫酶等［2］。其中，裂解性多糖單加氧酶（lytic polysaccharide monooxygenase，LPMO）是一種氧化裂解酶，可通過氧化裂解的方式破壞纖維素的結(jié)構(gòu)，在纖維素的高效酶解中發(fā)揮重要作用［3］。

LPMO 屬于銅離子依賴型單加氧酶，通過破壞纖維素、幾丁質(zhì)等多糖的結(jié)晶表面，輔助糖苷水解酶對底物的催化，在工業(yè)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中具有較高的應(yīng)用潛力［4］。隨著對LPMO 酶資源的挖掘和對催化機(jī)制的深入研究，目前LPMO 被歸類于CAZy 數(shù)據(jù)庫中的輔助活性蛋白家族AA9-AA11以 及AA13-AA17［5-9］。其 中，真菌源 的LPMO 主要分布在AA9 家族，即LPMO9，具有高活性和廣泛的底物譜［8］。例如，來源于梭孢殼屬（Thielavia australiensis）的TausLPMO9B 和H2O2共同降解磷酸膨脹纖維素時(shí)，促進(jìn)了底物的裂解［10］；來源于黏褶菌屬（Gloeophyllum trabeum）的GtLPMO9S 對纖維素、羧甲基纖維素、木葡聚糖等具有較高活性［11］。此外，LPMO 作為輔助活性蛋白，大多都與糖苷水解酶表現(xiàn)出一定的協(xié)同作用效果。例如，Agrawal等［12］用來源于曲霉屬（Aspergillus terreus 9DR）的LPMO（PMO_08942、PMO_07920）對甘蔗渣/稻草進(jìn)行預(yù)處理可顯著提高纖維素酶的糖化率；Müller等［13］將商業(yè)纖維素酶與15%的LPMO（TaLPMO9A）混合后，葡萄糖產(chǎn)量提高了31%。

研究發(fā)現(xiàn)，LPMO 的催化機(jī)制相對比較復(fù)雜，在還原劑，如抗壞血酸、還原性谷胱甘肽等和銅離子存在的情況下，從底物糖環(huán)上的1 位碳或4 位碳上奪取一個(gè)氫原子，同時(shí)反向摻入一個(gè)氧原子，在水分子的參與下可將底物轉(zhuǎn)變?yōu)樘侨┧峄蚨迹?4-15］。因此，根據(jù)生成底物類型可以初步將LPMO 分 為C1 催化酶、C4 催化酶或是C1 和C4共催化酶3 種類型。此外，近期研究還發(fā)現(xiàn)部分LPMO 可以氧 化C6 位，但并不 裂解糖苷鍵［16］。LPMO9 的結(jié)構(gòu)具有高度的保守性，其催化結(jié)構(gòu)由β三明治結(jié)構(gòu)組成，一般包含8-10 個(gè)由loop 結(jié)構(gòu)相連的β 折疊［17］?；钚晕稽c(diǎn)呈平面結(jié)構(gòu)，活性中心的銅離子由平面中兩個(gè)保守的組氨酸殘基共同穩(wěn)定，形成組氨酸支架［4］。此外，結(jié)合平面附近的芳香族殘基對底物的裂解方式具有選擇性。例如，Danneels等［18］將來源于紅褐肉座菌（Hypocrea jecorina）的LPMO9A 與底物結(jié)合平面的芳香族氨基酸殘基Y211突變成丙氨酸后，C4 氧化能力增強(qiáng)，C1 氧化能力減弱。

嗜熱毀絲菌（Thermothelomyces thermophilus）具有強(qiáng)效降解纖維素的能力，其基因組中除編碼多個(gè)糖苷水解酶外，還存在大量的LPMO9，目前，僅有少數(shù)幾個(gè)功能被鑒定［19-25］，需進(jìn)一步加深對LPMO9性質(zhì)及協(xié)同效率的研究。本文以嗜熱毀絲菌為出發(fā)菌株，系統(tǒng)地分析其基因組編碼的LPMO9 序列的多樣性，篩選出功能未鑒定的LPMO9 序列并進(jìn)行異源表達(dá)，對重組蛋白的功能進(jìn)行探究，獲得新型、高效的LPMO9。此外，本研究還探究了LPMO9 與商品化纖維素酶之間的協(xié)同作用效果，為高效降解纖維素提供新的策略，對提高生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基因和菌株 Ttlpmo9i 基因編碼序列由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成；用于目的基因克隆的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；用于構(gòu)建表達(dá)載體的質(zhì)粒和外源基因表達(dá)的pPIC9 和畢赤酵母GS115 購自美國Invitrogen 生命技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 無縫克隆與重組試劑盒、快速凝膠提取試劑盒、PCR 聚合酶2×TransStart?FastPfu Fly PCR SuperMix（-dye），限制性 內(nèi)切酶FlyCut?Bgl II,FlyCut?EcoR I,和FlyCut?Not I 均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉購自賽默飛世爾科技公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）和微晶纖維素購自Sigma-Aldrich；瓊脂糖購自Biowest 公司、YNB 購自北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司。不同量程的移液器購自艾本德公司；PCR 儀、核酸電泳儀、蛋白電泳儀、凝膠成像儀均購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；培養(yǎng)箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；分子過濾膜包購自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；M200 PRO 多功能酶標(biāo)儀購自帝肯Tecan 上海貿(mào)易有限公司；?KTA Pure蛋白純化儀購自思拓凡Cytiva。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 在CAZy（http://www.cazy.org/）和NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中獲取LPMO 的序列信息；使用在線網(wǎng)站ExPASy-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）對蛋白的理論分子量、等電點(diǎn)進(jìn)行分析；使用在線網(wǎng) 站SignalP 6.0（https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/）對蛋白的信號肽進(jìn)行預(yù)測；使用在線網(wǎng)站NetOGlyc 4.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetOGlyc-4.0）預(yù)測蛋白O-糖基化位點(diǎn)；利用BLASTp（Basic Local Alignment Search Tool protein）對蛋白序列進(jìn)行同源性分析；利用MEGA11 將LPMO9 已解析出晶體結(jié)構(gòu)的C1 催化酶：TtGH61E（Thermothielavioides terrestris，PDB ID：3EII）、PcLPMO9D（Phanerochaete chrysosporium，PDB ID：4B5Q）；C4 催化酶：NcLPMO9C（Neurospora crassa，PDB ID：4D7U）、NcLPMO9D（N.crassa，PDB ID：4EIR）；C1/4 催化酶：TaLPMO9A（Thermoascus aurantiacus，PDB ID：2YET）、NcLPMO9M（N.crassa，PDB ID：4EIS）蛋白氨基酸序列與嗜熱毀絲菌LPMO9 蛋白進(jìn)行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用Smart 在線網(wǎng)站（http://smart.embl-heidelberg.de/）對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測；利用SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/），以來源于大麗輪枝菌（Verticillium dahlia）的A0A2J8EXP9 為模板對蛋白質(zhì)進(jìn)行同源建模，將TtLPMO9I 序列相似度為67.11%的NcLPMO9C 中的銅疊加到TtLPMO9I蛋白模型上。LPMO 的命名參考Berka 等［26］的報(bào)道。Pymol（https://pymol.org/2/）用于模型結(jié)構(gòu)的可視化和制圖。

1.2.2 基因的克隆 將去除信號肽后的TtLpmo9i 編碼基因重組至pPIC9 表達(dá)質(zhì)粒的EcoR I/Not I 克隆位點(diǎn)處，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans1-T1 細(xì)胞中。利用3'AOX 和5'AOX 通用引物進(jìn)行菌落PCR，驗(yàn)證陽性克隆子并測序。將測序正確的陽性克隆子轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基（體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%酵母浸粉，1%胰蛋白胨，1%氯化鈉）中，37℃過夜培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒pPIC9-Ttlpmo9i。

1.2.3 蛋白的表達(dá)與純化 用限制性內(nèi)切酶Bgl Ⅱ線性化處理重組質(zhì)粒pPIC9-Ttlpmo9i，通過電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布在固體MD 培養(yǎng)基（體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%瓊脂糖，2%葡萄糖，滅菌后加入體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.34% YNB，4×10-5%生物素）上。30℃倒置培養(yǎng)48 h 后，在MD 培養(yǎng)基中挑選24個(gè)單克隆，培養(yǎng)在3 mL BMGY（體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%酵母粉，1%胰蛋白胨，體積分?jǐn)?shù)為0.5%甘油，經(jīng)121℃高溫滅菌20 min 后加入體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.34%YNB，4×10-5%生物素）培養(yǎng)基中。在30℃，200 r/min 條件下培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞并重新懸浮于1 mL 的BMMY（體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%酵母粉，1%胰蛋白胨，經(jīng)121℃高溫滅菌20 min 后加入體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.34% YNB，4×10-5%生物素，體積分?jǐn)?shù)0.5% 甲醇）誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。在30℃，200 r/min 條件下誘導(dǎo)表達(dá)72 h 后，以12 000 r/min 離心10 min收集上清液，并通過基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF）和SDS-PAGE 篩選出重組蛋白。將篩選出陽性克隆子接種至30 mL YPD 液體培養(yǎng)基（體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%酵母浸粉，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖）中，30℃，200 r/min 培養(yǎng)48 h 后，以體積分?jǐn)?shù) 0.5%的接種量接種至400 mL BMGY 液體培養(yǎng)基中。30℃，200 r/min 培養(yǎng)48 h 后，收集菌體轉(zhuǎn)移至200 mL BMMY 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h，每隔24 h 補(bǔ)加一次甲醇（體積分?jǐn)?shù)0.5%）。48 h 后收集上清液，利用10 kD 膜包濃縮至15 mL 體積后進(jìn)行脫鹽處理。然后加入到平衡后的HiTrap QXL 陰離子交換層析柱中，在10 mmol/L 的pH 8.0 的Tris-Hcl 緩沖液中，使用0-1 mol/L NaCl 進(jìn)行線性梯度洗脫，收集相應(yīng)的峰所對應(yīng)的蛋白并進(jìn)行酶活性的測定和SDS-PAGE 分析。

1.2.4 酶活力的測定 將含有體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%CMC-Na、3 μmol/L 酶液、1 mmol/L 抗壞血酸和0.1 mmol/L CuSO4的反應(yīng)體系在特定條件下培養(yǎng)6 h，后采用DNS 法檢測反應(yīng)過程中還原糖的釋放量來測定LPMO 的活性。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)建立校正曲線。酶活定義為：在酶的最適條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為1 個(gè)單位（U）。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.2.5.1 不同濃度抗壞血酸對酶活性的影響 以10 mg/mL CMC-Na 為底物，取3 μmol/L TtLPMO9I，0.1 mmol/L CuSO4，以不同濃度抗壞血酸（0、0.1、1、10 mmol/L）在50℃，pH 5.0 的條件下處理12 h。在各濃度抗壞血酸反應(yīng)體系中，以沸水浴10 min 滅活后的TtLPMO9I 作為實(shí)驗(yàn)對照，每組3 次重復(fù)，計(jì)算不同濃度抗壞血酸條件下還原糖的產(chǎn)生量并繪制柱形圖。

1.2.5.2 最適溫度和溫度穩(wěn)定性的測定 在不同溫度（40-80℃）和酶的最佳pH 值下確定酶的最適溫度。將最大酶活值設(shè)定為100%，計(jì)算相對酶活。取3 μmol/L 酶分別在60℃、70℃和80℃下處理4 h、8 h 和12 h，在最佳條件下測定剩余酶活力。未處理酶液的初始酶活定義為100%，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)和溫度點(diǎn)下的相對酶活值并繪制溫度穩(wěn)定性趨勢圖。

1.2.5.3 最適pH 及pH 穩(wěn)定性的測定 在不同pH值（pH 3.0-7.0：100 mmol/L 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液；pH 8.0-9.0：100 mmol/L Tris-HCl 緩沖液；pH 10.0：甘氨酸-NaOH）和酶的最佳溫度下測定酶的最適pH 值。將最大酶活值設(shè)定為100%，計(jì)算相對酶活，繪制最適pH 趨勢圖。將酶在pH 6.0-8.0、37℃條件下孵育4、8、12 h 后，在最佳條件下測定剩余酶活性。以初始酶活定義為100%，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)和pH 條件下的相對酶活值并繪制pH 穩(wěn)定性趨勢圖。

1.2.6 TtLPMO9I 與商業(yè)酶的協(xié)同作用 分別以20 mg/mL 預(yù)處理玉米秸稈、10 mg/mL 微晶纖維素為底物，將50、100、200 μg TtLPMO9I 在50℃、pH 5.0的條件下與適當(dāng)稀釋的商業(yè)酶（Novozymes 188）分別對預(yù)處理玉米秸稈、微晶纖維素進(jìn)行協(xié)同酶解，反應(yīng)時(shí)間為12 和24 h。以單獨(dú)添加各濃度TtLPMO9I 和單獨(dú)添加纖維素酶的反應(yīng)作為對照。將反應(yīng)后的體系進(jìn)行離心，取上清液，采用DNS 法測定還原糖含量，并計(jì)算TtLPMO9I 與商業(yè)酶作用的還原糖增長率與協(xié)同度。

預(yù)處理玉米秸稈的制備：取10 g 玉米秸稈，用100 mL 1%（W/V）NaOH 溶液在121℃下處理1 h；用蒸餾水洗滌至中性，并通過120 目濾網(wǎng)過濾收集；在烘箱中干燥24 h 備用。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析

從CAZy 數(shù)據(jù)庫中獲得嗜熱毀絲菌基因組序列，分析編碼LPMO9 的22 個(gè)蛋白氨基酸序列（表1）。結(jié)果顯示，這些氨基酸數(shù)目和相對分子質(zhì)量分別在151-444 aa 和16.2-46.6 kD 之間。對蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析顯示，僅有4 個(gè)LPMO（LPMO9B、AEO54509.1、MtLPMO9、LPMO9I）在催化結(jié)構(gòu)域的C 端存在一個(gè)碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBM）。圖1為該菌株LPMO9 家族成員與同家族已解析出晶體結(jié)構(gòu)的LPMO 系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果圖，由圖可知，按照底物切割方式可分為3 類，大部分集中在C1/C4 催化酶的分類中。

圖1 嗜熱毀絲菌AA9 家族LPMO 蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.1 Phylogenetic tree of LPMO proteins in the AA9 family of T.thermophilus

表1 嗜熱毀絲菌AA9 家族LPMO 蛋白性質(zhì)預(yù)測Table 1 Protein property prediction of the LPMO AA9 family from T.thermophilus

本研究的核心材料TtLPMO9I（GenBank Accession No.: AEO56416.1）核苷酸序列全長為921 bp，編碼了306 個(gè)氨基酸，前15 個(gè)氨基酸為信號肽序列，去除信號肽后的成熟蛋白理論分子量為29.9 kD，等電點(diǎn)為5.81。多序列比對結(jié)果顯示（圖2-A），TtLPMO9I 包含了大多數(shù)LPMO9 的保守氨基酸殘基，如H1、H84、H156、G163、Q165、Y167、Y205。其中，H1 和H84，Y167 是主要的銅離子結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)成TtLPMO9I 的活性中心。

圖2-B 為SWISS-MODEL 同源建模得到的TtLPMO9I 模擬結(jié)構(gòu)。預(yù)測結(jié)果表明，TtLPMO9I 為雙結(jié)構(gòu)域蛋白，包含一個(gè)由226 個(gè)殘基組成的催化結(jié)構(gòu)域（H1-I226），在蛋白C 端存在一個(gè)由34 個(gè)氨基酸殘基組成的CBM1（P258-P291）。TtLPMO9I 的催化結(jié)構(gòu)域具有8 個(gè)β 折疊片，形成β 三明治結(jié)構(gòu)。前組由β1、β3、β6 組成，另一組由β4、β7、β8 組成。β2 參與兩組β 折疊的形成，每個(gè)β 折疊片相互疊加、包裹形成蛋白質(zhì)的核心。CBM1 結(jié)構(gòu)域則由β9和β10 與連接兩個(gè)折疊片的loop 區(qū)構(gòu)成。TtLPMO9I的活性位點(diǎn)呈平面結(jié)構(gòu)，銅離子與H1（3.0 ?）和H84（2.2 ?）的側(cè)鏈和H1 的氨基末端的氮原子（3.5 ?）相連形成一個(gè)“T 型”結(jié)構(gòu)的組氨酸支架，并且兩個(gè)組氨酸與Y167 的側(cè)鏈酚基（2.8 ?）與銅離子之間的相互作用，共同穩(wěn)固了銅離子，對底物的催化具有重要作用。在催化結(jié)構(gòu)域中，有3 個(gè)loop 區(qū)（L2 loop：L17-I50；LS loop：G115-G131；LC loop：G177-I226）共同參與形成TtLPMO9I 的催化平面，其中，LS loop 中的G119 與LC loop 中的G214-G215之間可形成疏水作用，維持蛋白的穩(wěn)定。

2.2 TtLPMO9I的表達(dá)和純化

SDS-PAGE 結(jié)果（圖3-A）顯示，TtLPMO9I 的表觀分子量大于其理論分子量（TtLPMO9I：31.4 kD）。經(jīng)網(wǎng)站預(yù)測，其包含3 個(gè)O 糖基化位點(diǎn)（S227、S229、S231），均位于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的連接區(qū)。這可能是造成表觀分子量大于理論分子量的原因之一。為進(jìn)一步確認(rèn)表達(dá)的蛋白是否為目的蛋白，將表達(dá)純化的TtLPMO9I 通過MALDI-TOF 進(jìn)行質(zhì)譜分析（圖3-B）。如圖所示，共有8 段肽段序列與目標(biāo)蛋白的理論序列匹配，蛋白序列的覆蓋度為24.4%，因此能夠確定純化后的蛋白即為目的蛋白，可將該蛋白進(jìn)行后續(xù)的研究。

圖3 重組蛋白TtLPMO9I 的驗(yàn)證Fig.3 Validation of the recombinant protein TtLPMO9I

2.3 TtLPMO9I酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 不同濃度抗壞血酸對TtLPMO9I 活性影響 由于LPMO 通過氧化裂解的方式作用于纖維素底物，在加入抗壞血酸、還原性谷胱甘肽等還原劑的條件下可顯著提高反應(yīng)效率。由圖4 可知，當(dāng)抗壞血酸終濃度為1 mmol/L 時(shí)，TtLPMO9I 的還原糖產(chǎn)生量達(dá)到最高值（579 ± 9）mg/L，較不加抗壞血酸時(shí)增加84%，顯著提高了TtLPMO9I 的催化活性。

圖4 抗壞血酸對TtLPMO9I 酶活性的影響Fig.4 Effect of ascorbic acid concentration on the enzyme activity of TtLPMO9I

2.3.2 最適溫度及溫度穩(wěn)定性分析 在pH 5.0 條件下測定TtLPMO9I 在不同溫度（40-80℃）下的酶活力，由圖5-A 可知，TtLPMO9I 的最適溫度為60℃，在50-70℃之間的酶活力均在80%以上，對溫度的耐受性較好。將TtLPMO9I 分別在60-80℃下分別孵育4、8、12 h，檢測其剩余酶活力（圖5-B）。結(jié)果表明，TtLPMO9I 在60℃條件下孵育4、8、12 h 后，其剩余酶活隨孵育時(shí)間延長逐漸降低，處理12 h 后剩余酶活為54%。TtLPMO9I 在70℃孵育8 h、80℃孵育4 h 條件下，其剩余酶活降為0。

圖5 TtLPMO9I 的酶學(xué)性質(zhì)Fig.5 Enzymatic properties of TtLPMO9I

2.3.3 最適pH 及pH 穩(wěn)定性分析 在pH 3.0-10.0范圍內(nèi) 測定最 適pH 值（圖5-C）。TtLPMO9I 在pH 5.0 達(dá)到酶活最高值，在pH 5.0-9.0 相對酶活均保持在80%以上，說明其對pH 耐受性的范圍較廣。此外，TtLPMO9I 在pH 6.0-8.0 條件下孵育12 h 后，其相對酶活均在80%以上，表明TtLPMO9I 具有良好的pH 穩(wěn)定性（圖5-D）。

2.4 TtLPMO9I與纖維素酶在反應(yīng)中的協(xié)同效應(yīng)

由圖6-A-B 的結(jié)果圖顯示，添加不同量的TtLPMO9I 后，與纖維素酶協(xié)同降解玉米秸稈所產(chǎn)生的還原糖增加了34%-142%，根據(jù)1.2.6 協(xié)同度計(jì)算公式得到協(xié)同度在1.14-2.10 之間。當(dāng)以玉米秸稈為底物時(shí)，在反應(yīng)體系中分別添加50、100、200 μg的TtLPMO9I 和100 μL 稀釋后的纖維素酶，反應(yīng)12 h 后體系中的還原糖含量與未添加TtLPMO9I 相比分別增加了34%、70%、99%，協(xié)同度為1.14、1.36、1.51。反應(yīng)24 h 后協(xié)同產(chǎn)糖量較未添加TtLPMO9I 增加了45%、102%、142%，協(xié)同度分別為1.20、1.73、2.10。由以上數(shù)據(jù)可知，在降解玉米秸稈過程中，還原糖產(chǎn)量和協(xié)同度隨反應(yīng)時(shí)間及TtLPMO9I 濃度的增加而增加。在纖維素酶中添加200 μg TtLPMO9I 反應(yīng)24 h，還原糖增加量和協(xié)同度達(dá)到最大值。

圖6 TtLPMO9I 與纖維素酶（Novozymes 188）降解玉米秸稈、微晶纖維素的協(xié)同反應(yīng)Fig.6 Synergistic reaction between TtLPMO9I and cellulase（Novozymes 188）for the degradation of pretreated corn straw and Avicel

此外，在降解微晶纖維素的過程中，TtLPMO9I與纖維素酶也表現(xiàn)出協(xié)同作用效果，但還原糖的增加量與協(xié)同度均低于玉米秸稈，分別為6%-46%和0.92-1.24（圖6-C-D）。在反應(yīng)體系中分別添加50、100、200 μg 的TtLPMO9I 和100 μL 稀釋后的纖維素酶，反應(yīng)12 h 后還原糖含量較未添加TtLPMO9I 增加了11%、38%、46%，協(xié)同度為0.92、1.20、1.24。反應(yīng)24 h 后，較未添加TtLPMO9I 的還原糖增加量分別為6%、15%、18%，協(xié)同度為0.96、1.04、1.05。

3 討論

LPMO9 分布廣泛，大多數(shù)來源于真菌，如在構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）基因組中編碼9 個(gè)LPMO9 基因［27］；柄孢霉（Podospora anserina）基因組中編碼33 個(gè)LPMO9 基因［28］；粗糙脈孢霉（Neurospora crassa）基因組中編碼14 個(gè)LPMO9 基因［29］，這些真菌均具有良好的木質(zhì)纖維素降解能力，因此，推測LPMO 在降解木質(zhì)纖維素過程中扮演著重要角色。嗜熱毀絲菌基因組中也編碼了大量的木質(zhì)纖維素降解酶基因，是潛在的高效中高溫酶庫［26］。測序結(jié)果顯示，嗜熱毀絲菌基因組中共編碼22 個(gè)LPMO9 蛋白的基因［26］，目前，僅有7 個(gè)被報(bào)道［19-25］。本研究基于已報(bào)道的嗜熱毀絲菌基因組序列，挖掘其中未鑒定的TtLPMO9I，探究其功能，豐富LPMO9 酶資源庫。此外，選擇工業(yè)應(yīng)用中常見的商業(yè)纖維素酶與TtLPMO9I 進(jìn)行協(xié)同作用，探究協(xié)同作用效果，優(yōu)化酶資源的復(fù)配方案，從而提高生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率。

生物信息學(xué)分析表明，TtLPMO9I 是一類雙結(jié)構(gòu)域的LPMO，在催化結(jié)構(gòu)域的C 端包含了一個(gè)CBM1結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)，大約30%的LPMO 含有非催化性的CBM［30］，CBM 在結(jié)合纖維素底物并增強(qiáng)催化效率方面具有重要作用［31］。通常，雙模塊LPMO9的催化結(jié)構(gòu)域在N 端，因?yàn)镹 末端的組氨酸可與銅結(jié)合，對活性至關(guān)重要，C 端含有第一家族非催化性CBM，可與纖維素中的結(jié)晶區(qū)結(jié)合［32］。Agrawal等［12］通過比較單結(jié)構(gòu)域LPMO 和含有CBM1 的雙結(jié)構(gòu)域LPMO 的酶學(xué)性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，雙結(jié)構(gòu)域的LPMO有更加廣泛的底物譜，其對纖維素和木聚糖均表現(xiàn)出明顯的活性。綜上所述，CBM 的存在可以加強(qiáng)LPMO 和底物的結(jié)合能力，有利于增加可溶性產(chǎn)物的釋放。

酶學(xué)性質(zhì)結(jié)果顯示，純化的TtLPMO9I 蛋白在60℃，pH 5.0 時(shí)具有最高活性，在pH 5.0-9.0 范圍內(nèi)活性在80%以上，這與大多數(shù)LPMO9 性質(zhì)相似，均在50-60℃和pH 4.0-6.0 的范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高的酶活性［12,33-34］。此外，TtLPMO9I 具有良好的熱穩(wěn)定性，在60℃條件下處理12 h，剩余酶活為54%。然而，在相同溫度條件下，來源于灰霉菌的flLPMO處理20 min，酶活完全喪失［35］；來源于黃孢原毛平革菌的PMO_08942 和PMO_07920 最適溫度均為50℃，溫度升高催化活性急劇下降［12］。綜上，TtLPMO9I可以長時(shí)間抵抗高溫環(huán)境，具有商業(yè)應(yīng)用的潛力。

LPMO 是一類新型的木質(zhì)纖維素降解輔助酶，通過氧化作用裂解糖苷鍵，使木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)更加松散，有利于糖苷水解酶降解底物，達(dá)到協(xié)同效果。例如Dimarogona 等［36］證明LPMO StCel61a 和纖維素酶Celluclast 的比例為1∶2 時(shí)，對云杉的降解效率提高了42%；Bulakhov 等［37］將3 種LPMO9 分別與纖維素酶進(jìn)行協(xié)同降解微晶纖維素底物，與纖維素酶單獨(dú)降解相比，協(xié)同作用后的還原糖產(chǎn)量提高了17%-31%；Li 等［34］將PdLPMO9A 與纖維素酶共同作用在玉米秸稈上，還原糖產(chǎn)量比PdLPMO9A與纖維素酶單獨(dú)降解產(chǎn)生還原糖量高29.9%。本研究中，TtLPMO9I 促進(jìn)纖維素降解效果較為顯著。當(dāng)200 μg TtLPMO9I 添加到商業(yè)酶中處理玉米秸稈，產(chǎn)糖效率和協(xié)同度隨反應(yīng)時(shí)間的增加而增加，反應(yīng)24 h 后，產(chǎn)糖量較未添加時(shí)增加142%，其協(xié)同作用效果較其他材料具有突出的優(yōu)勢。此外，Harris 等［38］發(fā)現(xiàn)，GH61 蛋白（現(xiàn)已歸類于LPMO）對纖維素酶活性的促進(jìn)作用僅發(fā)生在木質(zhì)纖維素底物上，而不是純纖維素底物。有研究報(bào)道，LPMO 發(fā)揮功能需要電子供體，除可以外加抗壞血酸等還原劑外，底物中的木質(zhì)素也可以提供電子，并且激活LPMO 的能力與木質(zhì)素預(yù)處理的水平有關(guān)［39］。本研究以玉米秸稈為底物時(shí)，TtLPMO9I 與纖維素酶的最大協(xié)同度達(dá)到2.10，而以純纖維素類底物—微晶纖維素為底物時(shí)，最大協(xié)同度僅為1.24。由此推測，TtLPMO9I與纖維素酶的協(xié)同效果可能與底物的組成有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究從嗜熱毀絲菌基因組中獲得了一個(gè)新型的氧化裂解酶TtLPMO9I 的編碼基因并成功進(jìn)行了異源表達(dá)。酶學(xué)性質(zhì)檢測發(fā)現(xiàn)TtLPMO9I 的pH 穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性較好，并且與纖維素酶表現(xiàn)出良好的協(xié)同作用效果，顯著提高還原糖的產(chǎn)生量。本研究豐富了AA9 家族LPMO 的酶資源庫，可以為木質(zhì)纖維素的高效降解提供新的材料。