大柴胡湯加味方對(duì)急性水腫型胰腺炎大鼠的治療作用及炎癥因子指標(biāo)的影響※

賈晶晶，陳戰(zhàn)，郭亞麗，陳玉珍

(1.山西省中醫(yī)院，山西太原 030012；2.山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，山西太原 030012)

急性胰腺炎是常見的腹部急癥之一，具有發(fā)病急、病情進(jìn)展快及治療費(fèi)用高的特點(diǎn)，部分患者反復(fù)發(fā)作，給患者造成很大的困擾。根據(jù)其病理發(fā)展分為急性水腫型胰腺炎和出血壞死型胰腺炎，其中急性水腫型胰腺炎比較常見，其特點(diǎn)為胰腺出現(xiàn)腫脹、充血，胰腺周圍積液，伴有局限性脂肪壞死，臨床以上腹部疼痛、惡心嘔吐、排氣少、便秘等癥狀，實(shí)驗(yàn)室檢查示血、尿淀粉酶水平升高等。隨著人們生活水平的提高，不規(guī)律飲食情況普遍，如過食酒漿、肉食等，導(dǎo)致急性胰腺炎發(fā)病率逐年升高，高三酰甘油及酒精也成為急性胰腺炎發(fā)病的主要誘因。目前，臨床治療該病主要采用禁飲食、胃腸減壓、抑制胰酶分泌、抗感染等常規(guī)療法。中醫(yī)特色療法(中藥灌腸、芒硝外敷等)對(duì)急性胰腺炎也有突出的治療作用[1]。本研究觀察大柴胡湯加味方治療急性胰腺炎的作用機(jī)制，為該方的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物 SD 雄性大鼠21只，體質(zhì)量200～240g，購自中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所(批號(hào)111251210100417652)。動(dòng)物在溫度(20±2)℃、濕度(43±5)%的環(huán)境下喂養(yǎng)，飼養(yǎng)于山西省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房。

1.2 主要試劑及藥物 雨蛙素購自索萊寶；二甲基亞砜購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒均購自伊萊瑞特生物試劑公司；大柴胡湯加味方組成藥物[大黃10g(后下)，黃芩9g，清半夏9g，白芍12g，牡丹皮10g，柴胡12g，丹參9g，枳實(shí)9g，厚樸15g，敗醬草9g，生姜6g]由山西省中醫(yī)院提供，先將10味中藥用300mL清水浸泡1h，加水300 mL 繼續(xù)煎煮30 min后加入生大黃再煎5 min，將藥液倒出，加水沒過藥渣約1cm繼續(xù)煎煮30min，再次將藥液倒出，將2次藥液混勻，濃縮至110mL，制成1000g/L的藥液。

1.3 主要儀器 萬能顯微鏡熒光成像系統(tǒng)(OLYMPUS BX51，門季生物科技有限公司)；SpectraMax M2e多功能酶標(biāo)儀[美谷分子儀器(上海)有限公司]；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；攤片機(jī)(湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司)；染色機(jī)(賽默飛有限公司)。

2 方法

2.1 急性水腫型胰腺炎大鼠模型制備及分組 取雄性SD 大鼠21只，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及治療組，每組7只。各組大鼠自由飲水條件下禁食12h后接受實(shí)驗(yàn)。用雨蛙素腹腔注射復(fù)制急性水腫型胰腺炎大鼠模型[2]。具體操作方法如下:將1 mg 雨蛙素用1mL二甲基亞砜溶解，于-20 ℃環(huán)境下保存，實(shí)驗(yàn)前取上述溶液用0.9%氯化鈉溶液稀釋成濃度2μg/mL溶液，操作時(shí)需放置于冰上保持溫度，按20μg/kg給模型組及治療組大鼠腹腔注射，每小時(shí)注射1次，連續(xù)注射4次。對(duì)照組腹腔注射同等劑量0.9%氯化鈉溶液。治療組及模型組在第1次注射前1h、注射后4h及處死前1h按10g/kg分別給予大柴胡湯加味方、0.9%氯化鈉溶液灌胃，對(duì)照組大鼠按照上述時(shí)間給予同等次數(shù)和劑量的0.9%氯化鈉溶液灌胃。于末次注射后3h用10%水合氯醛(按0.3mL/100g給藥)麻醉大鼠，腹腔動(dòng)脈穿刺取血4～5 mL，處死大鼠，取胰腺組織，血清標(biāo)本放置1h，用離心機(jī)離心(轉(zhuǎn)速3000r/min，離心半徑200px)10min，取血清，并于-80 ℃低溫凍存待測(cè)。

3 觀察指標(biāo)及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3.1 觀察指標(biāo) ①處死大鼠前觀察模型組及治療組大鼠的精神狀態(tài)。②組織病理學(xué)改變。取3組大鼠胰腺組織，浸泡于10%中性甲醛液中固定，并進(jìn)行脫水、包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色。光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺組織的病理改變，采用盲法由2位病理專業(yè)人員在光鏡下閱片。③處死大鼠后取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清淀粉酶(AMY)、脂肪酶(LPS)，采用半導(dǎo)體激光流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)全血白細(xì)胞(WBC)水平。以上指標(biāo)均由山西省中醫(yī)院檢驗(yàn)科測(cè)定。④血清IL-6、TNF-α水平。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)。

3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3 結(jié)果

(1)大鼠精神狀態(tài) 與對(duì)照組和治療組比較，模型組大鼠外觀觀察可見精神萎靡、少動(dòng)、蜷縮、呼吸急促，對(duì)外界反應(yīng)遲鈍。與模型組相比，治療組大鼠精神狀態(tài)好，自主活動(dòng)正常，對(duì)外界反應(yīng)靈敏，小便次數(shù)增多、色黃，未見排稀便。

(2)組織病理學(xué)結(jié)果 對(duì)照組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)無脂肪壞死、間質(zhì)無水腫、無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，胰島多為橢圓形，且形態(tài)完整。模型組大鼠胰腺葉、小葉間隔增寬，間質(zhì)水腫明顯，胰島數(shù)量減少，可見少許脂肪壞死、少量炎癥細(xì)胞。治療組大鼠胰腺葉、小葉間隔擴(kuò)張及間質(zhì)水腫較模型組減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯。見圖1(見正文第125頁)。

圖1 3組大鼠胰腺組織顯微鏡組織病理學(xué)結(jié)果(×200)

(3)血清AMY、LPS及全血WBC 水平比較 模型組血清AMY、LPS 及全血WBC 水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。治療組血清AMY、LPS及全血WBC水平均低于模型組、對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 3組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶及全血白細(xì)胞水平比較(±s)

表1 3組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶及全血白細(xì)胞水平比較(±s)

注:1.AMY，淀粉酶；LPS，脂肪酶；WBC，白細(xì)胞。2.與對(duì)照組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。3.模型組、治療組為急性水腫型胰腺炎大鼠。

組別 只數(shù) AMY(U/L) LPS(U/L) WBC(×109/L)對(duì)照組 71377.5±56.45 9.11±3.38 7.49±0.85模型組 7 14098.24±525.09△13.07±0.51△治療組 7 11121.44±987.98△▲723.70±43.73△629.50±22.71△▲10.99±0.62△▲

(4)血清IL-6、TNF-α水平比較 模型組血清IL-6、TNF-α水平均高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。治療組血清IL-6、TNF-α水平均低于模型組、對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 3組大鼠血清白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子α水平比較(pg/mL,±s)

表2 3組大鼠血清白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子α水平比較(pg/mL,±s)

注:1.IL-6，白細(xì)胞介素-6；TNF-α，腫瘤壞死因子α。2.與對(duì)照組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。3.模型組、治療組為急性水腫型胰腺炎大鼠。

組別只數(shù)IL-6TNF-α對(duì)照組737.57±1.3060.78±4.20模型組751.73±2.60△88.14±2.98△治療組742.88±1.18△▲74.8±5.23△▲

4 討論

急性胰腺炎指因胰酶異常激活對(duì)胰腺自身及周圍器官產(chǎn)生消化作用而引起的以胰腺局部炎性反應(yīng)為主要特征，甚至可導(dǎo)致器官功能障礙的急腹癥。本病的發(fā)病機(jī)制主要有胰酶激活、炎癥介質(zhì)活化、胰腺血液循環(huán)紊亂、腸道屏障、細(xì)胞凋亡等[3]。其中炎癥介質(zhì)在急性胰腺炎發(fā)生、發(fā)展中起到很大的作用，IL-6 主要是由單核巨噬細(xì)胞分泌的一種炎癥介質(zhì)，是參與炎癥和免疫反應(yīng)的一個(gè)非常重要的促炎因子，對(duì)調(diào)節(jié)急性胰腺炎的炎性反應(yīng)起著重要的作用；TNF-α主要由單核巨噬細(xì)胞激活后分泌，可調(diào)節(jié)炎癥、免疫反應(yīng)，升高TNF濃度，引起胰腺腺泡細(xì)胞壞死，還可刺激其他細(xì)胞因子釋放，引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[4-5]。有報(bào)道稱，IL-6、TNF-α在急性胰腺炎早期就明顯升高，且與胰腺炎的嚴(yán)重程度相關(guān)[6-7]。促炎因子升高，會(huì)使血管壁受損、通透性增加，進(jìn)而損傷機(jī)體的重要器官，導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)[8]。故TNF-α、IL-6水平對(duì)急性胰腺炎的早期診斷及預(yù)后評(píng)估均有重要價(jià)值?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療急性胰腺炎以內(nèi)科常規(guī)療法為主，主要采用胃腸減壓、灌腸、抑制胰液分泌、抑制胰酶活性、營(yíng)養(yǎng)支持、抗感染、鎮(zhèn)痛、防治并發(fā)癥等綜合對(duì)癥支持治療[9]?；诒静≈委煹膹?fù)雜性，臨床仍有待繼續(xù)尋找治療急性胰腺炎有效的治療方法。

急性胰腺炎歸屬中醫(yī)“胃心痛”“結(jié)胸”“脾心痛”“腹痛”等范疇。對(duì)于本病的病因，不同學(xué)者各抒己見，多有膽石、暴飲暴食、蟲積、創(chuàng)傷和情志不舒等病史，多辨為里實(shí)熱證[10]。病機(jī)演變是各種病因引起中焦氣機(jī)不暢，脾胃升降失常，痰濕內(nèi)停，郁久化熱，濕熱內(nèi)結(jié)，久則血瘀，濕、熱、濁、瘀膠結(jié)，阻滯胃腸，從而導(dǎo)致“腑氣不通，不通則痛”[11-13]。其中，腑氣不通為發(fā)病的關(guān)鍵。臨床醫(yī)家多采取通里攻下法治療急性胰腺炎，常用方劑有大承氣湯、大柴胡湯、大陷胸湯、清胰湯等，除了口服湯藥外，還有中藥灌腸、針刺、外敷等外治法[14]。本課題組在大柴胡湯基礎(chǔ)上加牡丹皮、丹參、厚樸、敗醬草，增加通腑泄熱、化瘀解毒的功效。大柴胡湯出自《傷寒雜病論》，是治療少陽陽明合病的方劑，原方組成為柴胡半斤，半夏半斤，大黃2兩，黃芩、芍藥各3兩，枳實(shí)4枚，生姜5兩，大棗12枚。方中，柴胡合黃芩可疏肝瀉膽，清少陽經(jīng)郁熱；大黃、枳實(shí)、厚樸配伍，取小承氣湯之意，可行氣通腑，瀉陽明里實(shí)；生姜伍半夏可和胃止嘔，且生姜辛散上行，可牽制大黃峻下之力，進(jìn)而和胃護(hù)胃?？紤]熱實(shí)內(nèi)結(jié)，血脈不通，故加丹參、牡丹皮增強(qiáng)活血清熱作用，且白芍合丹參、大棗可緩急止痛，配大黃以平膽逆之火。諸藥合用，既可解肝膽之郁，又能通陽明之實(shí)。筆者在臨床上多用該方治療肝膽郁熱、胃腸壅滯、氣血運(yùn)行不利所致急性、實(shí)性病證。研究表明，大柴胡湯能夠抑制胃酸分泌，松弛Oddi括約肌張力，降低血脂水平，改善毛細(xì)血管滲透性，還能促進(jìn)胃蠕動(dòng)，減輕腸麻痹，減少IL-6、TNF-α的釋放[15-17]。柴胡、敗醬草、黃芩、大黃具有明顯的抗菌、抗炎作用[18]。

本研究結(jié)果表明，大柴胡湯加味方能明顯降低急性水腫型胰腺炎大鼠血清TNF-α、IL-6 及全血WBC水平，從而減少胰腺局部炎性反應(yīng)，降低血清AMY、LPS水平。通過光鏡下觀察大鼠胰腺組織病理，也證實(shí)大柴胡湯加味方對(duì)急性水腫型胰腺炎大鼠具有明顯的治療作用，其作用機(jī)制主要與減少早期炎癥介質(zhì)釋放、促進(jìn)細(xì)菌和毒物排泄有關(guān)。段會(huì)強(qiáng)等[19]認(rèn)為大柴胡湯能夠改善急性胰腺炎患者的凝血狀態(tài)，減少腸道細(xì)菌移位，降低炎癥因子的表達(dá)。

本課題組從炎癥介質(zhì)著手，論證大柴胡湯加味方治療急性水腫型胰腺炎的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用大柴胡湯加味方提供了基礎(chǔ)支持。在用藥方面，在大柴胡湯基礎(chǔ)上增加行氣活血的藥物，加強(qiáng)通腑活血的力度，使氣行瘀通，可見大鼠胰腺相關(guān)指標(biāo)及鏡下組織病理學(xué)結(jié)果得到改善。本研究樣本量小，大柴胡湯加味方的劑量為臨床常用劑量換算所得，尚未進(jìn)行大柴胡湯加味方更大劑量的實(shí)驗(yàn)研究，后續(xù)研究將進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)方案，以明確大柴胡湯加味方治療急性水腫型胰腺炎的最佳劑量。