HPLC 法測(cè)定新樂康片相關(guān)藥材中8 種活性成分含量

鄧雨荷，張慶林，楊明武，陳 偉，何 珺*

（1. 貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 西南特色藥用生物資源開發(fā)利用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550025；3. 山西太原藥業(yè)有限公司，山西 太原 030021）

新樂康片，氣味特異，味微酸；有著平肝養(yǎng)心安神的作用，適用于神經(jīng)衰弱、證見失眠、煩躁等，是由鉤藤、酸棗仁和蘿芙木三味藥材組成的中藥復(fù)方片劑[1]。經(jīng)文獻(xiàn)查閱，鉤藤及其制劑質(zhì)量多以鉤藤總生物堿或者鉤藤堿含量作為評(píng)測(cè)指標(biāo)[2-3]；酸棗仁中斯皮諾素和酸棗仁皂苷A 為發(fā)揮鎮(zhèn)靜、催眠作用的主要成分[4-5]；蘿芙木中降壓、鎮(zhèn)靜的主要成分是吲哚類生物堿，包含利血平、阿義嗎啉、育亨賓等[6-7]。新樂康片原標(biāo)準(zhǔn)對(duì)鉤藤堿進(jìn)行薄層掃描法測(cè)定含量，但操作比較復(fù)雜，對(duì)于蘿芙木利用沉淀法測(cè)總堿，而對(duì)于酸棗仁僅是做了薄層鑒別；這些含量測(cè)定和鑒別誤差較大且不能有效控制片劑的內(nèi)在質(zhì)量。

現(xiàn)有報(bào)道中，關(guān)于鉤藤中相關(guān)組分的測(cè)定，羅俊等[8]采用乙腈-0.1%三乙胺水溶液（1%磷酸調(diào)pH=9）進(jìn)行梯度洗脫，覃春葉等[9]用含0.2 mg/mL乙酸銨的0.8 mg/mL 的磷酸氫二鈉溶液-甲醇進(jìn)行等度洗脫，而劉明[10]進(jìn)行了甲醇和乙腈兩個(gè)體系的篩選，最終選擇乙腈-磷酸二氫鉀體系進(jìn)行測(cè)定；關(guān)于酸棗仁相關(guān)組分測(cè)定的報(bào)道，溫子帥等[11]采用乙腈-水的流動(dòng)相體系進(jìn)行梯度洗脫，趙祥升等[12]采用乙腈-0.1%乙酸水進(jìn)行梯度洗脫；有關(guān)蘿芙木生物堿的測(cè)定，龍?jiān)苹莸萚13]采用甲醇-水（0.004 mol/L 二乙胺）進(jìn)行等度洗脫，鄧明等[14]和李文靜等[15]在其基礎(chǔ)上分別從洗脫梯度及水相組成進(jìn)行了改進(jìn)?；趯?duì)一系列文獻(xiàn)的理解與總結(jié)，發(fā)現(xiàn)這三種藥材相關(guān)組分的測(cè)定中柱型、溫度和流速基本一樣，流動(dòng)相的組成上大致相似且存在互通的可能性。

本文在上述方法上，進(jìn)行了流動(dòng)相篩選、洗脫梯度調(diào)整以及檢測(cè)波長(zhǎng)篩選，利用HPLC 一法對(duì)新樂康片的三種原料中8 種活性成分進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，測(cè)定鉤藤堿、異鉤藤堿、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、斯皮諾素、利血平、育亨賓、阿義嗎啉8 個(gè)有效成分，建立HPLC 法測(cè)定新樂康片三種原料中8 種活性成分的方法，為藥業(yè)在生產(chǎn)新樂康片前期的藥材選取以及片劑的質(zhì)量控制方面提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 原料與試劑

鉤藤，安徽毫州；酸棗仁，河北；蘿芙木，云南麗江。

對(duì)照品：利血平，批號(hào)22060923，純度≥98%，購于上海同田生物技術(shù)股份有限公司；阿義嗎啉，批號(hào)HBWS220508-2，純度≥97.1%，購于北湖北魏氏化學(xué)試劑股份有限公司；其余對(duì)照品均購于四川萃益潤(rùn)物技術(shù)股份有限公司（育亨賓，批號(hào)：CYRY0264221008，純度≥98%；斯皮諾素，批號(hào)：CYRS0148201025，純度≥98%；酸棗仁皂苷A，批號(hào)：CYR-S0008211118，純度≥99%；酸棗仁皂苷B，批號(hào)：CYR-S0009220401，純度≥99%；鉤藤堿，批號(hào)：CYR-G0065220710，純度≥99%；異鉤藤堿，批號(hào)：CYR-Y0210220624，純度≥99%）。

乙腈，色譜級(jí)，德國MWE-GK；甲醇、無水乙醇、磷酸、三乙胺均為分析純；水，哇哈哈純凈水。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，LC-2040C 3D，日本島津制作所；數(shù)控超聲波清洗器，KQ3200DE，昆山市超聲儀器有限公司；電子天平，BSA1245S，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；恒溫電熱水浴鍋，HH-1，常州華奧儀器制造有限公司；粉碎機(jī)，F(xiàn)SJ-A05N6，龍港市創(chuàng)達(dá)商貿(mào)有限公司；其他為一般常規(guī)儀器。

1.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取斯皮諾素5.760 mg、育亨賓8.270 mg、異鉤藤堿7.750 mg、酸棗仁皂苷A8.840 mg、酸棗仁皂苷B 6.990 mg、利血平6.180 mg，用甲醇定容至10 mL；精密稱取阿義嗎啉5.720 mg用甲醇定容至5 mL；精密稱取鉤藤堿8.50 mg，用甲醇定容至100 ml。然后各吸取1 mL制備混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.4 供試品溶液的制備

精密稱取鉤藤粉末2.0 g，置于50 mL錐形瓶中，加入4 mL氨試液（氨水∶水∶乙醇=9∶30∶16）堿化30 min，再加入80 mL氯仿混勻后超聲處理80 min，濾過，回收溶劑至干，殘?jiān)糜?0 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得鉤藤供試品溶液。

精密稱取酸棗仁粉末1.0 g置于索氏提取器中，加石油醚適量，加熱回流4 h，濾過至干，得脫脂后的藥材粉末。取上述藥材粉末適量，以料液比1∶10 加70%乙醇溶液，加熱回流2 h，濾過，回收溶劑至干，殘?jiān)糜?0 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得酸棗仁供試品溶液。

精密稱取蘿芙木粉末5 g左右，加75%乙醇50 mL，加熱回流1 h，過濾，連續(xù)兩次，合并提取液，回收溶劑至干；殘?jiān)糜?0 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得蘿芙木供試品溶液。

1.5 色譜條件

色譜柱，Titank C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫，30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)，204 nm；流速，1.0 mL/min；進(jìn)樣量，10 μL。柱溫，30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)，204 nm；流速，1.0 mL/min；進(jìn)樣量，10 μL。

流動(dòng)相A為乙腈，B為0.4%磷酸水溶液（含0.05%三乙胺）。梯度洗脫：0.01～10 min，20%～25%A；10～20 min，25% A；20～25 min，25%～40% A；25～35 min，40% A ；35～50 min，40%～70% A；50～51 min，70%～90% A；51～55 min，90% A；55～60 min，90%～20% A；60～65 min，20% A。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性理論分析和實(shí)驗(yàn)

測(cè)定的8 種活性成分主要分為生物堿和皂苷兩個(gè)大類，針對(duì)本實(shí)驗(yàn)的兩大類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)之間差異較大，在液相測(cè)定中兩類成分基本上能互不干擾。

對(duì)于固定相與柱長(zhǎng)，進(jìn)行了Titank C18、Diamonsil C18、E clipse Plus C18 以及氨基柱的篩選，固定相為Titank C18 時(shí)分離度更好且理論塔板數(shù)能達(dá)要求；柱長(zhǎng)的篩選，短柱的出峰早，但峰分離度低，因此最終選擇Titank C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

流動(dòng)相和波長(zhǎng)選擇上，根據(jù)甲醇的最大吸收波長(zhǎng)為210 nm，乙腈的最大吸收波長(zhǎng)為190 nm，酸棗仁皂苷A和B的最大吸收在204 nm，生物堿在200～280 nm均有紫外吸收，考慮到甲醇在低波長(zhǎng)處有較強(qiáng)的末端吸收，為減少干擾并提高信噪比，同時(shí)兼顧皂苷的吸收波段，故選擇乙腈為有機(jī)相、波長(zhǎng)為204 nm；水相選擇上，由于皂苷類化合物在中性或堿性條件下易發(fā)生電離，需采用磷酸調(diào)整流動(dòng)性的酸堿性，而生物堿通常為堿性，測(cè)定時(shí)因硅膠表面的硅羥基對(duì)堿性物質(zhì)的吸附，容易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，故流動(dòng)相水相中考慮加入三乙胺作為掃尾劑，最終確定流動(dòng)相為乙腈和0.4%磷酸水溶液（含0.05%三乙胺）。針對(duì)流速的選擇上，設(shè)定了多個(gè)不同流速，1.0 mL/min流速雖縮短了保留時(shí)間，但各分峰分離效果較差且使色譜柱壓力增大，0.6mL/min延長(zhǎng)了保留時(shí)間，但分離效率卻不高，故流動(dòng)相流速選擇0.8 mL/min。進(jìn)而得到1.5 所對(duì)應(yīng)的色譜條件。

分別取1.3 與1.4 配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液，按1.5 所對(duì)應(yīng)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見圖1。由圖可知，測(cè)定的混合對(duì)照品色譜峰與測(cè)定的鉤藤、酸棗仁及蘿芙木相關(guān)活性成分色譜峰均有良好的分離度，中藥材品溶液中各成分有少數(shù)無干擾，表明該方法專屬性均良好。

圖1 混合對(duì)照品、鉤藤、酸棗仁、蘿芙木的色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察

將1.3 配制好的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各組分的濃度如表1；用0.45 μm微孔過濾膜過濾后放入樣品瓶中，準(zhǔn)備上機(jī)檢測(cè)。按1.5 所設(shè)定的色譜條件，進(jìn)樣量為10 μL，做高效液相色譜分析，以對(duì)照品的濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，作線性回歸。結(jié)果表明斯皮諾素、育亨賓、阿義嗎啉、異鉤藤堿、鉤藤堿、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、利血平8 種活性成分分別在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程與線性范圍見表2。

表1 8 種成分的濃度

表2 8 種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3 儀器精密度試驗(yàn)

按照1.4 制備鉤藤、酸棗仁及蘿芙木的樣品溶液各1 份，對(duì)其中8 種活性成分進(jìn)行含量測(cè)定，按1.5 的色譜條件進(jìn)行分析，連續(xù)進(jìn)樣6 次（n=6），每次進(jìn)樣量均為10 μL，通過HPLC響應(yīng)值計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值（RSD）。結(jié)果顯示，鉤藤中鉤藤堿和異鉤藤堿的RSD依次為1.08%、0.54%；酸棗仁中斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B的RSD依次為1.29%、0.98%、1.36%；蘿芙木中阿義嗎啉、育亨賓、利血平的RSD依次為1.23%、1.02%、1.94%，RSD＜2%；三味藥材的相關(guān)活性成分的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%，可知本實(shí)驗(yàn)所用儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1.4 處理的供試品溶液，在1.5 色譜條件下，測(cè)定室溫下放置0、4、8、12、24、48 這6 個(gè)時(shí)間段的供試品溶液，記錄峰面積。數(shù)據(jù)顯示12 h內(nèi)鉤藤中鉤藤堿和異鉤藤堿的RSD依次為1.93%、0.72%，RSD均小于2%，而48 h內(nèi)峰面積RSD異鉤藤堿為1.29%，鉤藤堿為3.15%，表明鉤藤樣液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。酸棗仁樣液在48 h內(nèi)斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B的RSD依次為1.57%、0.95%、1.98%，RSD均小于2%，表明酸棗仁供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。蘿芙木樣液在24 h內(nèi)阿義嗎啉、育亨賓、利血平的RSD依次為0.93%、1.13%、1.97%，而48 h內(nèi)阿義嗎啉、育亨賓、利血平的峰面積RSD依次為4.29%、2.98%、4.83%，表明蘿芙木樣液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 樣品重復(fù)性試驗(yàn)

按照上述相關(guān)試驗(yàn)方法平行制備鉤藤、酸棗仁及蘿芙木的樣品溶液各6 份，分別按1.5 色譜條件進(jìn)行上機(jī)，每次進(jìn)樣量均為10 μL，通過HPLC響應(yīng)值計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值（RSD），結(jié)果表明藥材中均含有測(cè)定的相關(guān)活性成分，鉤藤中鉤藤堿和異鉤藤堿的RSD依次為1.06%、0.56%；酸棗仁中斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B的RSD依次為0.62%、1.11%、0.98%；蘿芙木中阿義嗎啉、育亨賓、利血平的RSD依次為1.06%、1.24%、1.56%；由三味藥材中八種組分的RSD均小于2%，可知本實(shí)驗(yàn)樣品重復(fù)性良好。

2.6 回收率試驗(yàn)

各取已知濃度鉤藤樣液8 mL、酸棗仁樣液2 mL、蘿芙木樣液5 mL，按100%添加量加入8 種對(duì)照品溶液混合搖勻，采用本文1.5 色譜條件進(jìn)行上機(jī)分析，根據(jù)響應(yīng)值，計(jì)算平均回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果顯示見表3。

表3 8 種活性成分加標(biāo)回收率（n=3）

2.7 含量測(cè)定

按本文1.4 的條件制得鉤藤、酸棗仁及蘿芙木供試品溶液，吸取適量待測(cè)液，采用1.5 的色譜條件測(cè)定藥材相關(guān)組分的含量，本次實(shí)驗(yàn)所得的HPLC色譜圖如圖1。其含量測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 藥材中8 種成分的含量測(cè)定（±s，n=3）

表4 藥材中8 種成分的含量測(cè)定（±s，n=3）

藥材 組分 含量/(μg/g)鉤藤 鉤藤堿 11.46±0.5異鉤藤堿 62.61±0.6斯皮諾素 705.90±1.5酸棗仁酸棗仁皂苷A 1709.85±6.3酸棗仁皂苷B 31.70±0.7阿義嗎啉 62.68±1.1蘿芙木育亨賓 11.86±0.4利血平 211.29±1.8

3 結(jié)論

本文建立了HPLC測(cè)定鉤藤、酸棗仁及蘿芙木中8 種活性成分的含量檢測(cè)方法。由于中藥混合制劑成分復(fù)雜，本文采用一法多測(cè)對(duì)新樂康片的三味藥材進(jìn)行主要有效成分的測(cè)定，對(duì)分離度要求較高，本文的色譜條件從多個(gè)維度進(jìn)行了考察；其中對(duì)流動(dòng)相的選擇上考慮到新樂康片相關(guān)藥材中生物堿類成分多，其通常為堿性，在進(jìn)樣分析時(shí)，由于硅膠表面的硅羥基對(duì)堿性物質(zhì)吸附，容易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，因此在考慮流動(dòng)相水相時(shí)加入0.50%三乙胺作為掃尾劑。結(jié)果表明流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃、流動(dòng)相體系為乙腈-0.4%磷酸水溶液（含0.05%三乙胺）、梯度洗脫、檢測(cè)波長(zhǎng)為204 nm時(shí)，分離效果良好，響應(yīng)值較高。在該色譜條件分離效果較好，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明儀器精密度良好，測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確、高效。

綜上所述，本文為三味藥材中8 種相關(guān)活性成分測(cè)定建立了一種準(zhǔn)確、快速、高效的檢測(cè)方法，為生產(chǎn)新樂康片前期選材上節(jié)約了測(cè)定時(shí)間，提高了生產(chǎn)效率，同時(shí)為新樂康片中活性成分HPLC 含量測(cè)定方法建立及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)升級(jí)提供參考。