喹啉酮類BRD4 抑制劑的3D-QSAR 研究

劉亞平，程 平，張淑平

（上海理工大學 材料與化學學院，上海 200093）

含溴域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）[1]參與調控細胞周期、增殖和凋亡等活動。開發(fā)BRD4 抑制劑被認為是一種治療癌癥的有前景的策略[2]。近年來，計算機輔助藥物設計逐漸成為開發(fā)和改造藥物的重要方法之一，在高效開發(fā)新型BRD4 抑制劑方面具有廣泛的應用前景。

盡管多種BRD4 抑制劑用于臨床階段的研究，但臨床試驗過程中所表現(xiàn)出的療效差和耐藥性等問題不容忽視，仍需研發(fā)出更多高活性的BRD4 抑制劑。傳統(tǒng)的藥物設計方法通常周期長達10 年，成本高達26 億美元，無法滿足臨床藥物需求[3]。

近年來，3D-QSAR 研究以更經濟高效的方式加快藥物研發(fā)效率而得到廣泛關注[4]。為了設計出高活性的喹啉酮類小分子p53-MDM2 結合抑制劑，尤等人建立了具有預測能力的3D-QSAR 模型[5]。Tong等利用一系列4,5-二氫-[1,2,4]三唑并[4,3-f]蝶啶類BRD4 抑制劑建立QSAR 模型，并成功設計出4 個新BRD4 抑制劑[6]。此外，基于CoMFA 和CoMSIA兩種不同的分析方法，Yu 等人使用一系列四氫喹喔啉類BRD4 抑制劑建立了3D-QSAR 模型，并獲得5 個高活性的候選化合物，為新型BRD4 抑制劑的合成和設計提供必不可少的理論依據(jù)[7]。很多研究者對各類BRD4 抑制劑進行QSAR 建模，并在開發(fā)新型BRD4 抑制劑方面取得了許多成果，但是關于喹啉酮類BRD4 抑制劑的3D-QSAR 相關研究還比較匱乏。

在現(xiàn)有CADD 技術的啟發(fā)下，本文利用已報道的一系列BRD4 抑制劑建立3D-QSAR 模型并開發(fā)了一系列新型BRD4 抑制劑。通過三維比較分子力場分析（comparative molecular field analysis，CoMFA ）[8]和比較分子相似性指數(shù)分析（comparative molecular similarity index analysis，CoMSIA）[9]預測BRD4 抑制劑的結構與活性之間的關系。此外，為了評估新設計分子的藥效，對其進行ADMET 性質和類藥性評價。所有研究成果為更高效地設計新型BRD4 分子提供了理論參考。

1 實驗

1.1 數(shù)據(jù)集構建和分子疊合

從文獻中提取33 個生物活性數(shù)據(jù)已知的喹啉酮類化合物，選取其中的27 個化合物作為訓練集來構建QSAR 模型，剩下的6 個化合物組成測試集來驗證模型的預測能力。33 個化合物的結構和生物活性數(shù)據(jù)如表S1 所示[10]。

本研究使用SYBYL-X 2.0 軟件繪制分子的化學結構并進行幾何優(yōu)化，然后使用最陡梯度下降法對這些結構進行能量最小化計算，從而獲得更穩(wěn)定的構象。原子電荷的計算和分子的能量最小化優(yōu)化步驟是在Chaube 等人的工作基礎上進行了改進，將最大迭代次數(shù)設置為10000 次[11]。隨后，將活性最高的化合物30 作為模板分子，并選擇一個合適的公共骨架進行分子疊合。選擇的公共骨架和訓練集分子疊合結果如圖1 所示。

圖1 BRD4 抑制劑的（a）公共骨架圖和（b）28 個分子疊合圖

1.2 CoMFA 和CoMSIA 模型構建和PLS 分析

為了探究抑制劑的生物活性與分子力場的關系，進行了CoMFA 和CoMSIA 模型的構建，模型構建過程中參考了李等人的方法和參數(shù)設置[12]。CoMFA 計算包括靜電場（electrostaic，E）和立體場（steric，S）。而CoMSIA 計算除了靜電場和立體場外，還有疏水場（hydrophobic，H）、氫鍵受體場（acceptor，A）和氫鍵供體場（donnor，D）。使用偏最小二乘（partial least-square，PLS）方法建立具有統(tǒng)計學意義的CoMFA 和CoMSIA 模型，將pIC50 值作為因變量，CoMFA 和CoMSIA 描述符作為自變量。在PLS 分析的交叉驗證方法中，采用留一法（left-one-out，LOO）得到最優(yōu)組成分值（optimal number of components，ONC）和交叉驗證回歸系數(shù)（cross-validation correlation coefficient，q2）。然后使用非交叉驗證方法得到標準誤差（standard error of estimation，SEE）、Fischer 檢驗值（Fischer test，F(xiàn)）和非交叉驗證相關系數(shù)（square of the non-cross-validation correlation coefficient，r2），這些參數(shù)用于評價模型的預測能力和穩(wěn)定性。此外，為了進一步評估3D-QSAR 模型的預測能力，利用建好的模型來預測測試集中所有化合物的pIC50 值，并通過計算預測相關系數(shù)r2pred來評估模型的外部預測能力。

1.3 ADMET 藥物動力學預測和類藥性分析

ADMET（藥物在人體內的吸收、分布、代謝、排泄和毒性）藥物動力學方法是藥物設計和篩選的重要方法。在藥物開發(fā)早期，使用ADMET 藥物動力學方法對候選化合物進行預測，可以有效提高藥物研發(fā)和篩選成功率，減少資金的浪費。在本研究中 ， 使 用 pkCSM[13]在 線 服 務 器（http://biosig.unimelb.edu.au/pkcsm/prediction）進行ADME 和毒性評估。此外，類藥性評估也是識別潛在的候選藥物的重要手段，廣泛使用的SwissADME[14]工具（http://www.swissadme.ch）可以預測新設計分子的合成可行性和類藥性。

2 結果與討論

2.1 CoMFA 和CoMSIA 研究

經過PLS 分析得到的CoMFA 和CoMSIA 模型相關統(tǒng)計參數(shù)如表1。在CoMFA 模型中，立體場和靜電場的貢獻率分別為0.610 和0.390，經過交叉驗證得到q2為0.926，ONC 為7。采用非交叉驗證得到的r2為0.997，SEE 為0.078，F(xiàn)為907.047，以及經過計算得到r2pred為0.744。由于CoMSIA 計算中包含五種不同的立場，為了獲得性能更優(yōu)的CoMSIA 模型，選取了不同的立場進行CoMSIA 建模，各個模型的PLS 結果如表2 所示，一般情況下，q2＞0.5，r2pred＞0.7，說明該模型具有良好的魯棒性和預測能力，構建的所有模型的q2和r2值均接近1，說明這些模型均具有較好的穩(wěn)定性和預測能力。其中SEHA 組合的CoMSIA 模型的q2和r2值分別為0.939 和0.991，具有更突出的預測能力。因此，選擇CoMSIA-SEHA 模型進行后續(xù)的分析和使用。在CoMFA 模型和CoMSIA-SEHA 模型中，訓練集化合物的實驗值和預測pIC50 值的散點圖如圖2 所示。從圖中可以觀察到，訓練集（黑點）和測試集（紅點）都均勻散布在直線y=x周圍，進一步說明建立的模型具有良好的預測能力和擬合能力。

表1 CoMFA 和CoMSIA 模型統(tǒng)計分析總結

表2 不同立場組合的CoMSIA 模型PLS 結果

圖2 CoMFA 模型和CoMSIA 模型的實驗pIC50 值與預測pIC50 值散點圖

2.2 3D-QSAR 等勢圖分析

結合活性最好的化合物30，對CoMFA 和CoMSIA 等勢圖進行合理分析，發(fā)現(xiàn)能提高化合物活性的取代基，得到更多分子改造的重要信息，進而為設計出理論活性更好的化合物提供理論指導。

CoMFA 等勢圖的立體場和靜電場如圖3 所示，在立體場中，綠色區(qū)域（貢獻度為80%）表示增大基的空間位阻有利于增加化合物活性，而黃色區(qū)域（貢獻度為20%）表示減小基團會增加化合物活性。在圖3a 中，A 環(huán)周圍存在大面積的黃色區(qū)域，表明此區(qū)域內合理減少基團的空間位阻，能促進化合物活性增加。化合物13（pIC50=6.149）比化合物14（pIC50=5.524）的活性高，也許是因為前者的甲基空間位阻明顯小于后者的苯基空間位阻。在靜電場中，藍色區(qū)域（貢獻度為80%）表示增加正電性基團有利于增加化合物活性，而紅色區(qū)域（貢獻度為20%）表示增加負電性基團有利于增加化合物活性。從圖3b 中可以看到，A 環(huán)由大量藍色色塊包圍，表明該區(qū)域加入吸電子基團有助于提高化合物生物活性，這也解釋了含有給電子基團-NH2的化合物 32（pIC50=7.310）的活性遠小于化合物 33（pIC50=8.046）。

圖3 基于3D-QSAR 的結構與活性關系的主要特征

CoMSIA 等勢圖如圖4 所示，圖4a 和圖4b 表示出的立場信息與圖3 類似。圖4c 表示疏水場，黃色色塊表示增加疏水基團有利于增加活性，而白色表示增加親水性基團更有利于提高化合物的生物活性。圖中A 環(huán)的第6 位置有白色色塊，表面該位置降低疏水基團可有效增加化合物活性，化合物30（pIC50=8.523）在該區(qū)域的基團多為親水性烴基，而化合物32（pIC50=7.310）在該位置的基團是疏水性胺基，所以前者的生物活性明顯大于后者。圖4d表示氫鍵受體場，明顯的紅色區(qū)域表明減少氫鍵受體有利于增加抑制劑的生物活性，含有氮和氧元素的A 環(huán)第3 位置被大塊紅色色塊包裹，該現(xiàn)象可以解釋為何化合物11（pIC50=5.469）的活性值小于化合物12（pIC50=6.292）。

圖4 模板化合物30 的CoMFA 等勢圖：a. 立體場；b. 靜電場

圖5 模板化合物30 的CoMSIA 等勢圖：a. 立體場；b. 靜電場；c. 疏水場；d. 氫鍵受體場

2.3 新BRD4 抑制劑分子設計

根據(jù)等勢圖的分析結果，最終設計出7 個新化合物，這些新化合物的pIC50 值均大于活性最好的化合物30，其具體結構和預測值如表3 所示。

表3 新設計化合物的結構及預測活性

2.4 ADMET 屬性預測和類藥性分析

為了提高藥物研發(fā)的成功率，減少藥物毒性和副作用，并指導臨床合理用藥，在藥物研發(fā)前期需要對藥物進行藥代動力學研究。對新設計的BRD4抑制劑進行ADMET 預測，同時進行了類藥性研究，進一步分析這些抑制劑是否具備理想藥物所表現(xiàn)出來的理化性質和結構特性。ADMET 性質預測結果如表4 所示，類藥性預測如表5 所示。

表4 新設計分子的ADMET 性質

表5 新設計分子的藥物相似性及其合成可達性

藥物從作用部位進入體循環(huán)的過程中，需要考慮人體腸道吸收率，一般吸收率大于30%的分子則表現(xiàn)出良好的吸收性。表4 所示的7 個新分子的吸收率均大于30%，表現(xiàn)出出色的人體腸道吸收性。藥物穿過血腦屏障的能力是提高藥物利用效力、減少人體副作用的重要指標。通常情況下，logBB<-1表示該化合物穿透血腦屏障的能力較差。由表4 可知，7 個新分子均不易透過血腦屏障，所以具有很低的神經毒性。細胞色素P450 是存在于人體肝臟內的一種重要解毒酶，能影響藥物的代謝，所以評估化合物抑制細胞色素P450 的能力至關重要。參與藥物代謝的兩個主要異構體是 CYP2D6 和CYP3A4，由表4 可知，7 個新分子均不是CYP2D6的底物和抑制劑，但屬于CYP3A4的底物和抑制劑，所以可以被CYP3A4 正常代謝。藥物清除率和肝臟清除率和腎臟清除率兩者有關，表中的所有新分子均不容易被肝臟和腎臟聯(lián)合清除。預測藥物對人體的毒性也是提高藥物成藥性的重要步驟。所有新設計分子均不會導致皮膚敏感現(xiàn)場產生，除了D07，其他新設計化合物均沒有AMES 毒性。總之，以上預測結果表明7 個新分子具有較為良好的藥代動力學特性。

表5 的類藥性預測結果表明，7 個新分子均符合Lipinski、Veber 和Muegge 規(guī)則，部分化合物也滿足Egan 規(guī)則，但所有化合物均不滿足Ghose 規(guī)則，說明所有新設計化合物具有理想的類藥性。此外，所有化合物的可合成性均在3 左右，表現(xiàn)出易于人工合成的特點。以上研究結果，為縮小藥物篩選范圍提供有利幫助。

3 結論

本研究采用CoMFA 和CoMSIA 方法對一系列BRD4 抑制劑進行3D-QSAR 研究。通過內外部驗證，CoMFA 模型（q2=0.926，r2=0.997，r2pred=0.744）和CoMSIA 模型（q2=0.939，r2=0.991，r2pred=0.786）均表現(xiàn)出優(yōu)異的統(tǒng)計結果。進一步對模型的等勢圖進行分析，為設計活性更強的新BRD4 抑制劑提供理論指導。此外，對新設計的7 個BRD4 抑制劑進行ADMET 和類藥性預測，證明了7 個新設計化合物具有良好的藥代動力學特性。該研究結果為開發(fā)更高效喹啉酮類BRD4 抑制劑提供理論參考。