葡萄糖對Starmerella bacillaris香草醛耐受能力的影響

張清燕，趙 君，張 哲，陳 雄，姚 蘭,

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與健康工程學(xué)院，湖北 武漢 430068；2.中國輕工武漢設(shè)計(jì)工程有限責(zé)任公司，湖北 武漢 430060）

木質(zhì)纖維素是一種價格低廉的可再生資源，利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇具有巨大的發(fā)展空間，但其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，必須經(jīng)過一系列預(yù)處理才能被微生物利用，在預(yù)處理時會產(chǎn)生對微生物具有毒害作用的副產(chǎn)物[1]，可分為3大類——呋喃類、弱酸類和酚類[2]。這些副產(chǎn)物存在于水解液中會阻礙酵母的生長，從而降低乙醇發(fā)酵效率[1-2]。在這些抑制劑中，酚類抑制劑的毒性最強(qiáng)，會對細(xì)胞膜產(chǎn)生損傷，增加細(xì)胞膜的通透性和流動性，導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)被破壞，無法正常發(fā)揮功能[3]。目前報道較多的是糠醛、5-羥甲基糠醛、乙酸和乙醇等抑制劑對酵母的影響，對酚類抑制劑的研究較少。由于在預(yù)處理過程中產(chǎn)生的酚類化合物種類繁多，缺乏有效的定量及定性分析方法，主要是以外源添加單一酚類抑制劑代替預(yù)處理產(chǎn)生的酚類化合物，以此對發(fā)酵的作用機(jī)理進(jìn)行研究[4]。

香草醛是水解液中主要的酚類抑制物，在較低質(zhì)量濃度下就可以對酵母生長產(chǎn)生抑制作用，一般作為酚類的代表抑制物被研究[3]，目前改善菌株對香草醛耐受的方法主要有基因工程改造和適應(yīng)性進(jìn)化[4]。前期研究表明通過過表達(dá)氧化還原酶的編碼基因（GCY1、YPR1、PEX5、MBF1、ADH7、ADH6）可以提高菌株的香草醛耐受性[5-8]。由代謝工程改造釀酒酵母獲得的一株可耐受多種脅迫因子的菌株XHR11，可將乙醇得率提高21.5%[9]。另外，過表達(dá)GSH1、CYS3、GLR1基因，可提高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的含量，明顯增強(qiáng)菌株對水解液的耐受性[10]。另一方面，通過實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化可提高菌株Zymomonas mobilis對香草醛的耐受性和乙醇發(fā)酵性能[11]以及酵母Kluyveromyces marxianus對多種抑制劑的耐受能力[12-14]。Almario等[15]得到馴化菌株的生長速率比原始菌株提高了24%。通過基因工程和適應(yīng)性進(jìn)化得到高耐受性菌株都需要較長的實(shí)驗(yàn)周期，且基因工程可能使酵母失去原有的優(yōu)良特性，而向培養(yǎng)基中添加保護(hù)劑的方法可以縮短實(shí)驗(yàn)周期，不會損害酵母原有特性，更利于生物乙醇生產(chǎn)[16]。已有研究表明，在同時含有呋喃類、弱酸和酚類抑制劑的培養(yǎng)基中添加1500 mg/L脯氨酸可將延滯期縮短10 h[17]。葡萄糖在酵母生長過程中為酵母提供生長所需的碳源，為酵母供能[18]。在秸稈預(yù)處理中產(chǎn)生的可溶性糖可在釀酒酵母發(fā)酵過程中減少酚酸對乙醇脫氫酶的抑制作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，從而提高乙醇的產(chǎn)量[19]。10%葡萄糖也可保護(hù)熱脅迫下的畢赤酵母[20]。目前關(guān)于增加培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)以提高酵母對香草醛耐受性的研究鮮見報道。

Starmerellabacillaris是一種非釀酒酵母菌，通常應(yīng)用在葡萄酒釀造中，可以耐受高濃度的乙醇[21]，在極端糖濃度下具有更強(qiáng)的適應(yīng)性[22]。目前關(guān)于抑制劑對酵母S.bacillaris的影響研究較少。本實(shí)驗(yàn)選取實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的一株S.bacillaris，研究香草醛作為單一抑制劑對其生長的影響，并研究提高培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)后香草醛對該酵母生長的影響作用。同時測定對數(shù)生長前期酵母細(xì)胞內(nèi)過氧化氫（H2O2）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、膜滲透率、抗氧化酶的活性，細(xì)胞內(nèi)外甘油的產(chǎn)量，糖代謝過程中與乙醇生成及抗氧化應(yīng)激相關(guān)的酶與輔酶因子水平，旨在奠定S.bacillaris在工業(yè)生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用基礎(chǔ)，降低乙醇的生產(chǎn)成本，提高發(fā)酵效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株S.bacillarisR5由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

2%酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母粉。6% YEPD：6%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母粉。

H2O2含量檢測試劑盒 中國貝奧蒂姆生物技術(shù)研究所；甘油含量測定試劑盒 北京普利萊基因技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒 北京天根生物技術(shù)有限公司；過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismut，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、己糖激酶（hexokinase，HK）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）、6-磷酸葡萄糖脫氫酶（6-phosphate glucose dehydrogenase，6-PGDH）、還原型輔酶II（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）檢測試劑盒南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電子分析天平 北京賽多利斯天平有限公司；超凈工作臺 天津市泰斯特儀器有限公司；HNY-211B全溫?fù)u床天津歐諾儀器儀表有限公司；紫外-可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Accuri?C6流式細(xì)胞儀 美國BD公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；ProFlexTMBase聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Applied Biosystems公司；CFX-96熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 乙醇發(fā)酵與發(fā)酵產(chǎn)物測定

從斜面上挑取酵母菌落接種到5 mL 2% YEPD中，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)24 h，取1 m L 轉(zhuǎn)接到50 mL 2% YEPD中培養(yǎng)12 h作為種子液，隨后按OD600nm＝0.5分別接種到50 mL 2%和6% YEPD發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)，每隔幾小時進(jìn)行取樣。

通過測定OD600nm監(jiān)測菌體的生長狀況。用3,5-二硝基水楊酸法[23]測定葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，高效液相色譜測定乙醇轉(zhuǎn)化率和香草醛質(zhì)量濃度。乙醇測定液相色譜條件：高效液相色譜采用Shimadzu LC-10AD系統(tǒng)，色譜柱采用SUGAR SH1011色譜柱，柱溫50 ℃，示差折光檢測器，流動相為5.4 mmol/L硫酸，流速為1.0 mL/min。香草醛測定液相色譜條件：Inertsil ODS-SP色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃，檢測器溫度45 ℃，流動相：甲醇-0.01%乙酸溶液（65∶35，V/V），進(jìn)樣量10 μL，流速為1.0 mL/min，檢測波長為270 nm。

1.3.2 酵母細(xì)胞中ROS含量及細(xì)胞膜損傷測定

取對數(shù)生長期前期的酵母細(xì)胞，用2’,7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉染液和碘化吡啶進(jìn)行染色，用BD AccuriTM流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞膜的完整性和細(xì)胞內(nèi)ROS的積累量。

1.3.3 H2O2、甘油、SOD、CAT、HK、PK、6-GPDH、GSH-Px、NADPH水平的測定

將酵母培養(yǎng)至對數(shù)生長前期，發(fā)酵液12000 r/min離心5 min，棄上清液，按照相關(guān)試劑盒的說明書進(jìn)行各成分水平測定。

1.3.4 實(shí)時PCR（real-time PCR）檢測

將S.bacillarisR5在2% YEPD培養(yǎng)基中30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h轉(zhuǎn)接至新鮮的2% YEPD培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，并將其作為種子培養(yǎng)基，取對數(shù)生長期的酵母細(xì)胞按照OD600nm＝0.5分別接入不含抑制劑的2%和6% YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取樣監(jiān)測細(xì)胞密度，待OD600nm＝1.0時，將此時刻定為0 h，向培養(yǎng)基中加入無菌的香草醛至香草醛的終質(zhì)量濃度為3 g/L，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。取0 h和2 h的樣品，液氮淬滅10 s后放置于－80 ℃保存。使用RNA提取試劑盒提取總RNA，使用NanoDrop 2000測定RNA濃度，按照沈勇[24]描述的程序以及5×HisScript II QRT Super Mix II進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，用2×ChamQ Vmversal SYBR qPCR Master MIX進(jìn)行real-time PCR，用2－ΔΔCt法計(jì)算己糖激酶（hexokinase，HK）、6-磷酸果糖激酶（6-phosphate fructose kinase，PFK）、異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenas，IDH3）、6-磷酸葡萄糖脫氫酶（6-phosphate glucose dehydrogenase，PGD）、乙醇脫氫酶（ethanol dehydrogenase，ADH5）、丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylas，PDC）、編碼醛酮還原酶基因GCY1基因的相對表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0.1和FlowJo-V10軟件進(jìn)行圖表繪制，應(yīng)用Statistica 25.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖水平對S.bacillaris R5生長的影響

為了研究香草醛和葡萄糖含量對酵母生長的影響，在YEPD（分別含有2%和6%葡萄糖）培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的香草醛。如圖1A所示，在YEPD（含2%葡萄糖）培養(yǎng)基中添加1 g/L香草醛對酵母生長無明顯影響，當(dāng)香草醛質(zhì)量濃度增加到3 g/L時，滯后期從6 h（1 g/L香草醛）延長到54 h（3 g/L香草醛）。同樣地，在YEPD（含6%葡萄糖）培養(yǎng)基中添加1 g/L香草醛對酵母生長無明顯影響，當(dāng)香草醛質(zhì)量濃度增加到3 g/L時，滯后期分別從6 h（1 g/L香草醛）延長到40 h（3 g/L香草醛），說明提高培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)至6%可以使酵母在高質(zhì)量濃度香草醛（3 g/L）條件下的延滯期縮短14 h。如表1顯示，在兩種葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，隨著香草醛脅迫的增加，菌株的比生長速率與對照組相比都顯著下降。如圖1B顯示，兩種葡萄糖水平下，加入低質(zhì)量濃度香草醛（1 g/L），前10 h內(nèi)香草醛的降解速率很快，加入高質(zhì)量濃度香草醛（3 g/L）后，香草醛的降解速率很慢，酵母在培養(yǎng)基中的香草醛質(zhì)量濃度降到很低時才開始生長，說明菌株本身對低質(zhì)量濃度香草醛（1 g/L）具有抗性。

表1 香草醛和葡萄糖添加對酵母S.bacillaris在YEPD培養(yǎng)基中的動力學(xué)參數(shù)的影響Table 1 Effect of vanillin and glucose supplementation on kinetic parameters for the growth and ethanol production of S.bacillaris in YEPD medium

圖1 香草醛和葡萄糖添加對酵母S.bacillaris生長的影響Fig.1 Effect of glucose supplementation on the growth of S.bacillaris under vanillin stress

圖1C、D顯示了發(fā)酵過程中的葡萄糖消耗以及乙醇生成情況。當(dāng)S.bacillarisR5酵母開始生長時，葡萄糖質(zhì)量濃度急劇下降，乙醇質(zhì)量濃度開始增加。在兩種葡萄糖水平下，低質(zhì)量濃度香草醛（1 g/L）和高質(zhì)量濃度香草醛（3 g/L）對酵母的葡萄糖消耗和乙醇生成量無顯著影響。2%葡萄糖水平下，最大乙醇質(zhì)量濃度分別為6.06（對照）、6.23（1 g/L香草醛）、6.54 g/L（3 g/L香草醛），最大乙醇質(zhì)量濃度對應(yīng)的時間從8 h（對照）分別延遲到14（1 g/L香草醛）、60 h（3 g/L香草醛）；6%葡萄糖水平下，最大乙醇質(zhì)量濃度分別為19.84（對照）、20.82（1 g/L香草醛）、21.49 g/L（3 g/L香草醛），最大乙醇質(zhì)量濃度對應(yīng)的時間從14 h（對照）分別延遲到16 h（1 g/L香草醛）和52 h（3 g/L香草醛）。3 g/L香草醛質(zhì)量濃度對酵母的延滯期和乙醇轉(zhuǎn)化率有明顯影響，2%葡萄糖水平的延滯期為54 h，比生長速率為0.046 h－1，乙醇轉(zhuǎn)化率為（0.302±0.013）g/g，6%葡萄糖水平的延滯期為40 h，比生長速率為0.080 h－1，乙醇轉(zhuǎn)化率為（0.356±0.017）g/g，相較于2%葡萄糖水平延滯期縮短了25.92%，比生長速率提高了82.1%，乙醇轉(zhuǎn)化率提高了17.88%，可見，將培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高至6%可緩解3 g/L香草醛對酵母生長及產(chǎn)乙醇的抑制作用。

2.2 葡萄糖水平對S.bacillaris R5在香草醛脅迫下細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

酵母細(xì)胞中ROS含量過高會影響酵母細(xì)胞的活性[25]，在高滲、高溫、低溫等高壓條件下，細(xì)胞壽命會由于ROS的積累而減少[26]。如圖2所示，在同一葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，香草醛質(zhì)量濃度越高，含有ROS的細(xì)胞比例越高，說明香草醛會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的積累；在同一香草醛質(zhì)量濃度下，含有ROS的細(xì)胞比例也隨著葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而升高，說明高糖環(huán)境也會增加細(xì)胞內(nèi)的ROS含量。2%葡萄糖水平時，含有ROS的細(xì)胞比例分別為1.53%（對照）、2.31%（1 g/L香草醛）、3.42%（3 g/L香草醛）；6%葡萄糖水平時，含有ROS的細(xì)胞比例分別為2.37%（對照）、2.90%（1 g/L香草醛）、4.51%（3 g/L香草醛）。在2%葡萄糖水平下，添加1 g/L和3 g/L香草醛后含有ROS的細(xì)胞比例分別增加了50.9%和123.5%，在6%葡萄糖水平下，添加1 g/L和3 g/L香草醛后含有ROS的細(xì)胞比例分別增加了22.3%和90.2%，可見即使6%葡萄糖水平下含有ROS的細(xì)胞比例較高，但在加入香草醛后，含有ROS的細(xì)胞增加比例均小于2%葡萄糖水平。為了減弱ROS對酵母產(chǎn)生的損傷，需要更高活性的SOD和CAT。

圖2 流式細(xì)胞儀分析不同葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在香草醛脅迫下菌株S.bacillaris產(chǎn)生的ROS含量Fig.2 Flow cytometry analysis of the ROS of content S.bacillaris produced under vanillin stress at different glucose concentrations

2.3 葡萄糖水平對S.bacillaris R5在香草醛脅迫下細(xì)胞膜的影響

細(xì)胞膜作為酵母與外界環(huán)境接觸的屏障，具有維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、確保物質(zhì)正常運(yùn)輸?shù)墓δ躘27]，外界環(huán)境脅迫會改變細(xì)胞膜脂質(zhì)組成，影響膜ATP酶的活性，使膜通透性、完整性等生理特性發(fā)生變化[28]。由圖3可知，在2%葡萄糖水平下，1 g/L和3 g/L香草醛組與對照組相比，膜滲透率分別提高了30%和62.8%；而在6%葡萄糖水平下，膜滲透率分別提高了1.7%和52.5%。說明將培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由2%提高至6%可以降低香草醛脅迫下的膜滲透率，使細(xì)胞膜能更好地行使功能。這與通過外源添加麥角固醇的方式使釀酒酵母細(xì)胞在4 g/L糠醛脅迫下的膜滲透性降低了29.79%，延滯期縮短了25%的結(jié)果相似[29]，可見膜滲透性的降低有助于縮短酵母在逆境中的延滯期。

圖3 流式細(xì)胞儀分析不同葡萄糖濃度在香草醛脅迫下菌株S.bacillaris的細(xì)胞膜完整性Fig.3 Flow cytometry analysis of cell membrane integrity of S.bacillaris under vanillin stress at different glucose concentrations

2.4 葡萄糖水平對S.bacillaris R5在香草醛脅迫下細(xì)胞內(nèi)H2O2濃度的影響

H2O2是一種強(qiáng)氧化劑，可以跨膜擴(kuò)散到細(xì)胞中，形成跨膜梯度，一方面，H2O2可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，并破壞細(xì)胞膜，從而加速細(xì)胞的衰老和解體；另一方面H2O2也是許多氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[30]。如圖4所示，在2%葡萄糖水平下，H2O2的濃度分別為0.52（對照）、1.3（1 g/L香草醛）、2.7 μmol/L（3 g/L香草醛）；6%葡萄糖水平下，H2O2的濃度分別為0.78（對照）、2.0（1 g/L香草醛）、3.1 μmol/L（3 g/L香草醛）。加入香草醛后，2%葡萄糖水平下的H2O2濃度分別提高了150%（1 g/L香草醛）和419%（3 g/L香草醛），6%葡萄糖水平下的H2O2濃度分別提高了156%（1 g/L香草醛）和297%（3 g/L香草醛）。在高質(zhì)量濃度香草醛（3 g/L）下，6%葡萄糖水平下H2O2濃度的增加量明顯低于2%葡萄糖水平。在應(yīng)激條件下，酵母為了更好地生長會相應(yīng)提高CAT和GSH-Px的活性分解H2O2[31]。

圖4 S.bacillaris細(xì)胞內(nèi)H2O2濃度Fig.4 Intracellular H2O2 contents in S.bacillaris

2.5 葡萄糖水平對S.bacillaris R5在香草醛脅迫下細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性及NADPH含量的影響

如圖5A所示，同一葡萄糖水平下，CAT的活性隨著香草醛質(zhì)量濃度的升高而增加，2%葡萄糖水平下分別為1.33（對照）、3.29（1 g/L香草醛）、5.68 U/mg（3 g/L香草醛），6%葡萄糖水平下分別為2.02（對照）、5.26（1 g/L香草醛）、13.6 U/mg（3 g/L香草醛）。在同一香草醛水平下，6%葡萄糖水平比2%葡萄糖水平的CAT活力分別提高了34%、37%、58%，這與細(xì)胞內(nèi)H2O2濃度的分析結(jié)果相印證（圖4），當(dāng)酵母受到氧化應(yīng)激時，通過提高抗氧化酶CAT的活性減輕ROS對細(xì)胞的損傷[32]。

圖5 S.bacillaris細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性及NADPH濃度Fig.5 Antioxidant enzyme activities and NADPH contents in S.bacillaris cells at different glucose levels under vanillin stress

SOD能夠保護(hù)酵母不受培養(yǎng)環(huán)境條件的變化而產(chǎn)生的氧化物傷害[32-33]。兩種葡萄糖水平下的SOD活性呈現(xiàn)相同的趨勢（圖5B），均與香草醛的質(zhì)量濃度呈線性相關(guān)。同一香草醛質(zhì)量濃度下，高葡萄糖水平的SOD活性均高于低水平葡萄糖，其中在3 g/L香草醛中，2%葡萄糖水平的SOD活性為138 U/mL，6%葡萄糖水平的SOD活性為214 U/mL，提高了35.5%。在兩個對照組之間，2%和6%葡萄糖水平的SOD活性分別為83 U/mL和137 U/mL，這與不加抑制劑時高葡萄糖水平的H2O2濃度高于低水平葡萄糖的結(jié)果表現(xiàn)一致，可能與酵母在高糖環(huán)境下的滲透脅迫有關(guān)[18]。

酵母在氧化應(yīng)激下通過增強(qiáng)酵母中SOD和CAT的活性，可以很好地調(diào)節(jié)異常的ROS含量，保證酵母細(xì)胞的活性和正常的生殖代謝[33]，高糖水平增加了與抗氧化機(jī)制相關(guān)的酶活性。酵母在高糖環(huán)境下的氧化損傷比低糖水平下強(qiáng)，但同時酵母細(xì)胞中SOD和CAT抗氧化酶活性增加。SOD在酵母中將超氧陰離子自由基（O2－·）轉(zhuǎn)化為H2O2，而CAT則進(jìn)一步將H2O2轉(zhuǎn)化為水和氧[34]。

GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化H2O2分解的酶，能特異性地催化還原型GSH對H2O2的還原反應(yīng)，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[28]。如圖5C所示，2%葡萄糖水平中的GSH-PX活力分別為3.36、12.6、20.8 個酶活力單位；6%葡萄糖水平中的GSH-PX活力分別為11.8、20.6、48.3 個酶活力單位。在6%葡萄糖水平下，GSH-Px活力分別是2%葡萄糖水平的3.5（對照）、1.6 倍（1 g/L香草醛）和2.3 倍（3 g/L香草醛），因此，在對數(shù)生長期前期，在高質(zhì)量濃度抑制劑下，S.bacillarisR5會應(yīng)激出現(xiàn)更高的酶活抵御損傷。

NADPH是酵母中應(yīng)對氧化應(yīng)激的重要物質(zhì)，它作用于GSH，消除酵母細(xì)胞內(nèi)ROS[35]。磷酸戊糖途徑和三羧酸循環(huán)的代謝過程中會產(chǎn)生和利用NADPH。NADPH的濃度可以反映酵母的抗氧化狀態(tài)，也可以間接反映不同葡萄糖水平下酵母的應(yīng)激強(qiáng)度[36]。如圖5D所示，兩個葡萄糖水平的對照組和加入1 g/L香草醛實(shí)驗(yàn)組的NADPH水平并沒有明顯區(qū)別，但在加入3 g/L香草醛后，6%葡萄糖水平的NADPH濃度比2%葡萄糖水平提高了19.4%。根據(jù)ROS變化的結(jié)果可知，在酵母細(xì)胞中，高水平的NADPH用于響應(yīng)氧化應(yīng)激。在高糖水平下，磷酸戊糖途徑的代謝增強(qiáng)，產(chǎn)生更多的NADPH。

2.6 葡萄糖水平對S.bacillaris R5在香草醛脅迫下細(xì)胞內(nèi)外甘油變化量的影響

甘油是酵母細(xì)胞的正常代謝物，是酵母保護(hù)劑之一[37]。在應(yīng)激條件下，酵母一般會通過高滲透壓甘油途徑增加細(xì)胞中甘油的代謝產(chǎn)量，維持酵母細(xì)胞滲透壓與外界環(huán)境的平衡[38]。如表2所示，添加1 g/L和3 g/L香草醛時，6%葡萄糖水平下的酵母胞內(nèi)甘油質(zhì)量濃度分別為38.94 mg/L和39.66 mg/L，分別是2%葡萄糖水平下胞內(nèi)甘油質(zhì)量濃度的1.51 倍和1.83 倍，這可能是充分的碳源代謝和應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)果，說明高葡萄糖水平能夠刺激酵母產(chǎn)生更多的甘油[39]。6%葡萄糖水平下的細(xì)胞內(nèi)含有更高的甘油質(zhì)量濃度，對酵母的保護(hù)作用大于2%葡萄糖水平，從而使酵母能夠在3 g/L香草醛的抑制下縮短延滯期。在含有180 g/L NaCl溶液的YEPD培養(yǎng)基中添加5 g/L硫胺素，促進(jìn)了甘油的有效合成，使酵母細(xì)胞更快適應(yīng)高鹽脅迫環(huán)境，將延滯期縮短了12 h[40]。釀酒酵母在4 g/L糠醛脅迫下，外源添加50 mg/L麥角固醇可使細(xì)胞內(nèi)的甘油質(zhì)量濃度提高4.89 倍[29]，可見甘油的增加可以維持膜的穩(wěn)定性，使膜更好的行使功能，與2.3節(jié)所得膜損傷率降低的結(jié)果對應(yīng)（圖3）。

表2 不同葡萄糖水平下S.bacillaris細(xì)胞內(nèi)外甘油變化量Table 2 Intracellular and extracellular glycerol contents in S.bacillaris at different glucose levels under vanillin stress mg/L

2.7 葡萄糖水平對S.bacillaris R5在香草醛脅迫下與碳代謝相關(guān)酶的影響

HK是葡萄糖分解過程中的第一個關(guān)鍵酶，它控制了整個酵母的碳通量代謝系統(tǒng)，催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，是酵母代謝的關(guān)鍵酶[41]。如圖6A所示，6%葡萄糖水平下細(xì)胞初始HK活力為2%葡萄糖水平的1.55 倍；在添加3 g/L香草醛后，6%葡萄糖水平實(shí)驗(yàn)組的HK活力顯著高于2%葡萄糖水平實(shí)驗(yàn)組，是后者的4.16 倍，這與曾令杰等[41]的研究中在經(jīng)過甲酸處理后增加了酵母細(xì)胞內(nèi)的HK活力、促進(jìn)了葡萄糖的分解代謝，為酵母抵抗甲酸損傷提供了能量的結(jié)論相似。

圖6 S.bacillaris 細(xì)胞內(nèi)與糖代謝相關(guān)酶的活性Fig.6 Activity of S.bacillaris intracellular enzymes related to glucose metabolism

PK是糖酵解過程中不可缺少的酶，其活力水平可以反映糖酵解過程中的通量[42-44]。加入香草醛后，兩個葡萄糖水平實(shí)驗(yàn)組中的丙酮酸激酶的活力均呈下降趨勢（圖6B），2%葡萄糖水平的對照組PK活力為52.8 U/L，3 g/L香草醛實(shí)驗(yàn)組PK活力為22.7 U/L，PK活力下降了57%；6%葡萄糖水平的對照組的PK活力為76.4 U/L，3 g/L香草醛實(shí)驗(yàn)組PK活力為34.7 U/L，PK活力下降了54.5%。在3 g/L香草醛抑制下，6%葡萄糖水平下細(xì)胞PK活力的下降速率比2%葡萄糖水平降低了4.3%，說明6%葡萄糖水平產(chǎn)生更多的丙酮酸，由此產(chǎn)生更多的乙醇，低PK活力引起磷酸烯醇式丙酮酸及其底物的積累，磷酸烯醇式丙酮酸會抑制磷酸丙糖異構(gòu)酶，增強(qiáng)了磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP），使細(xì)胞對氧化劑的抗性增強(qiáng)[44]。

6-PGDH是己糖代謝和戊糖代謝的關(guān)鍵酶[45]，該酶可以穩(wěn)定酵母細(xì)胞中NADPH的濃度、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、保護(hù)線粒體[46]。在低糖和高糖水平下，實(shí)驗(yàn)組6-PGDH的活力均比對照組高（圖6C），添加 3 g/L香草醛時，6%葡萄糖中的6-PGDH活力高達(dá)10.1 nmol/（min·mL），顯著高于2%葡萄糖，說明對于S.bacillarisR5，6%葡萄糖水平下的酵母代謝在對數(shù)生長前期細(xì)胞中產(chǎn)生了足夠的戊糖，使酵母具有更強(qiáng)的抗逆能力[47]，且在高糖環(huán)境下高表達(dá)了PGD基因，生成了更多的NADPH，這與酵母上調(diào)磷酸戊糖代謝基因以應(yīng)對高糖環(huán)境的策略一致[48]。在6%和15%葡萄糖水平下，酵母細(xì)胞中的6-PGDH的活力顯著高于3%葡萄糖水平，使酵母能夠更好地應(yīng)對氧化應(yīng)激反應(yīng)[18]。

2.8 與糖代謝及酵母香草醛耐受相關(guān)基因的表達(dá)水平

前期研究結(jié)果表明，提高培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度可以使酵母更好地抵御香草醛造成的抑制作用，且提高了乙醇轉(zhuǎn)化率，為揭示其機(jī)理，通過real-time PCR測定了與糖代謝相關(guān)酶（HK、PFK、IDH3、PGD、ADH5、PDC）以及文獻(xiàn)報道酵母中與香草醛耐受相關(guān)酶（醛酮還原酶）GCY1基因的表達(dá)水平（圖7）。糖酵解和三羧酸循環(huán)可為細(xì)胞提供能量，HK和PFK是糖酵解的兩個限速酶，IDH3在三羧酸循環(huán)中將NAD＋或NADP＋還原成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide，NADH）或NADPH，NADPH可催化氧化GSH生成還原GSH，還原GSH是常見的抗氧化物質(zhì)[49]。酵母在無氧環(huán)境下，PDC催化丙酮酸生成乙醛和二氧化碳，從而進(jìn)行乙醇發(fā)酵。PGD是PPP的第一個限速酶，其在還原6-磷酸葡萄糖時產(chǎn)生的NADPH是胞質(zhì)內(nèi)還原力的重要來源，研究表明細(xì)胞在經(jīng)歷氧化應(yīng)激時的第一反應(yīng)是上調(diào)PPP以促進(jìn)NADPH的產(chǎn)生[50]。在生物合成乙醇的過程中，乙醛在乙醇脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化成乙醇是一個關(guān)鍵步驟。研究表明，在產(chǎn)乙醇的微生物中過表達(dá)醇脫氫酶基因可提高乙醇產(chǎn)量[51]，如在Dekkera bruxellensis酵母中過表達(dá)ADH3基因可將乙醇產(chǎn)量提高1.2 倍[52]。醛酮還原酶可以催化醛和酮化合物的還原反應(yīng)，這些催化反應(yīng)可以利用NADH或NADPH等輔因子作為電子供體，生成相應(yīng)的醇類物質(zhì)，如醇、二醇等。編碼醛酮還原酶的基因GCY1過表達(dá)可以使釀酒酵母在含有6 mmol/L香草醛的培養(yǎng)基中的比生長速率提高49%[53]，并過表達(dá)GCY1基因可提高菌株香草醛的還原速率，可作為還原酶將香草醛直接還原為毒性較低的香草醇[6]。

圖7 與糖代謝和香草醛耐受相關(guān)基因在酵母S.bacillaris中的表達(dá)水平Fig.7 Expression levels of genes related to glucose metabolism and vanillin tolerance in S.bacillaris

在3 g/L香草醛脅迫下，2%葡萄糖水平下僅有PDC和GCY1基因表達(dá)水平上調(diào)，6%葡萄糖水平下HK、PFK、IDH3、PGD、ADH5、gabD、PDC及GCY1基因均呈現(xiàn)上調(diào)，分別上調(diào)4.6、2.5、13.9、12.2、17.5、34.8 倍和34.9 倍，其中與乙醇生成最相關(guān)的基因ADH5在2%葡萄糖水平下并沒有上調(diào)，在6%葡萄糖水平下表達(dá)上調(diào)17.5 倍。與香草醛耐受相關(guān)基因GCY1在2%葡萄糖水平下僅上調(diào)3 倍，在6%葡萄糖水平下上調(diào)高達(dá)34.9 倍。

將培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)提升至6%促進(jìn)了碳代謝過程中一些酶相關(guān)基因的表達(dá)水平，PGD的高表達(dá)可得到高活性的6-PGDH，可見在脅迫環(huán)境下高葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)促進(jìn)碳源流向PPP，生成了更多的NADPH，從而提供更多的還原力，這也與前期所得高濃度的NADPH結(jié)果相印證。ADH5的高表達(dá)促進(jìn)了乙醛向乙醇的轉(zhuǎn)化，提高了乙醇的轉(zhuǎn)化率，GCY1的高表達(dá)促進(jìn)了香草醛向香草醇的轉(zhuǎn)化（圖8），使得在3 g/L香草醛抑制下的酵母延滯期從54 h縮短至40 h，說明了6%葡萄糖水平可提高S.bacillarisR5酵母菌株對香草醛的耐受程度。

圖8 6%葡萄糖水平下與糖代謝相關(guān)酶的基因表達(dá)變化Fig.8 Changes in gene expression of enzymes related to glucose metabolism at glucose level of 6%

3 討論

香草醛是木質(zhì)纖維素原料水解產(chǎn)生的有毒副產(chǎn)物之一，在纖維素乙醇發(fā)酵過程中會抑制酵母細(xì)胞的生長和代謝[3]。已有研究表明4 mmol/L香草醛會對酵母的生長產(chǎn)生抑制作用[8]，在抑制劑存在的條件下酵母的細(xì)胞膜會由于氧化應(yīng)激的影響使得孔隙變大[54-55]，甘油產(chǎn)量降低會導(dǎo)致ROS的積累[54]。本研究發(fā)現(xiàn)，3 g/L香草醛可明顯抑制酵母的生長和乙醇發(fā)酵，經(jīng)香草醛處理的酵母細(xì)胞內(nèi)H2O2、ROS的含量及膜滲透率均提高，說明香草醛破壞了細(xì)胞膜，使膜通透性增大，脂質(zhì)過氧化程度加劇，引起酵母細(xì)胞氧化損傷，使細(xì)胞的衰老和解體加速。

葡萄糖為酵母提供生長和發(fā)酵所需的能量[18,54]，在高溫環(huán)境下葡萄糖可作為一種保護(hù)劑減輕酵母由熱應(yīng)激而產(chǎn)生的氧化損傷，降低ROS含量[20]。葡萄糖還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)GSH的水平，在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用[54-55]。在秸稈預(yù)處理中產(chǎn)生的可溶性糖可以加速細(xì)胞外基質(zhì)的合成，使得在酚酸脅迫下酵母細(xì)胞膜的損傷降低[19]。在酵母的對數(shù)生長期，大部分碳源主要流向PPP、甘油代謝和乙醇代謝，而ROS含量和膜滲透率增加需要通過調(diào)節(jié)SOD和CAT等抗氧化酶來應(yīng)對[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，將葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從2%提高至6%后，酵母在3 g/L香草醛抑制作用下的延滯期縮短了14 h，比生長速率提高了82.1%，乙醇轉(zhuǎn)化率提高了17.88%。在6%葡萄糖水平下，CAT活性提高58%，SOD活性提高35.5%，GSH-Px活性提高2.3 倍，甘油質(zhì)量濃度提高1.82 倍，這些變化可以保證細(xì)胞在脅迫環(huán)境下的活性從而進(jìn)行正常的生殖代謝；HK和6-PGDH的活力分別提高了4.16、11.8 倍，PK活力下降了54.5%，其中HK是糖代謝的第一個關(guān)鍵酶，低HK活性可增強(qiáng)PPP[40]，PK可以平衡糖酵解和呼吸作用[43]，6-PGDH可以穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)NADPH的濃度，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[18,46]；NADPH的濃度提高了19.4%，NADPH主要由PPP產(chǎn)生，說明PPP被增強(qiáng)，此途徑在脅迫環(huán)境下被增強(qiáng)可提高酵母對應(yīng)激條件的耐受能力[18]；與糖代謝相關(guān)的酶基因如PGD、HK等的高表達(dá)一方面與高酶活性相呼應(yīng)，另一方面也進(jìn)一步說明在3 g/L香草醛脅迫下添加6%葡萄糖可以促進(jìn)PPP。乙醇脫氫酶基因ADH5的表達(dá)水平提高了17.5 倍，使乙醛向乙醇的轉(zhuǎn)化加速。可見，提高培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以提高抗氧化酶的活性，更好地分解應(yīng)激產(chǎn)物，并且促進(jìn)了PPP，從而生成更多的還原酶使酵母更好的應(yīng)對高脅迫的生長環(huán)境。醛酮還原酶基因GCY1的高表達(dá)提高了香草醛向無毒的香草醇的轉(zhuǎn)化速率，為酵母的生長和發(fā)酵提供更有利的條件。

4 結(jié)論

3 g/L香草醛可明顯抑制酵母的生長，延長酵母乙醇發(fā)酵的周期，香草醛的脅迫可使酵母細(xì)胞的膜通透性增加，細(xì)胞內(nèi)容物外泄，氧化還原失衡。為了減弱抑制作用，將培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由2%提高至6%，縮短了延滯期及乙醇發(fā)酵周期，提高了細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性，調(diào)節(jié)了細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，減弱了脂質(zhì)氧化損傷，為酵母提供了更多的ATP以及還原力以應(yīng)對脅迫環(huán)境，從而提高乙醇的轉(zhuǎn)化速率。本研究可為S.bacillarisR5酵母提高酚類抑制物的耐受能力提供一種解決方案。