皖浙花豬干腌火腿源血糖調(diào)節(jié)肽的分離純化、鑒定及量子化學(xué)表征

黃晶晶，周迎芹，羅 章，劉振東，程秀峰，謝寧寧,*

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，安徽 合肥 230001；2.安徽省食品微生物發(fā)酵與功能應(yīng)用工程實驗室，安徽 合肥 230031；3.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000）

糖尿病是全球最嚴重的慢性疾病之一，2021年20～79 歲人群的患病率約10.5%（5.366億 人），支出約9660億 美元[1]。目前無法治愈糖尿病，常用治療手段有口服藥物、注射胰島素等，亟需通過飲食預(yù)防、干預(yù)、調(diào)控血糖代謝紊亂。某些食物源活性肽具有維持血糖生理穩(wěn)態(tài)的潛力，其結(jié)構(gòu)簡單、活性多樣，可持續(xù)性、安全性、生物利用度高，免疫原性和毒性低[2]。其中部分肽類可以抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶等消化酶活性，阻礙碳水化合物轉(zhuǎn)換化為葡萄糖進入體循環(huán)，幫助改善受損的胰島β細胞功能[3]。這類肽的活性與分子質(zhì)量、疏水性、氨基酸組成等密切相關(guān)，但不是氨基酸活性的簡單疊加。而肽分子內(nèi)的相互作用會影響立體效應(yīng)和結(jié)構(gòu)，很難獲得準確的活性作用位點和電子轉(zhuǎn)移路徑，仍未明晰其體內(nèi)降糖機制[4]。

分子對接、定量構(gòu)效關(guān)系、量子化學(xué)等多種生物信息學(xué)手段已被用于篩選、設(shè)計食源性降糖肽并預(yù)測其活性，推動了序列鑒定和產(chǎn)品研發(fā)。量子化學(xué)方法可以輸出非經(jīng)驗性的精確能量參數(shù)和幾何結(jié)構(gòu)，描述酶活性位點運動和電子轉(zhuǎn)移機制。已從藥物設(shè)計擴展應(yīng)用到了食品科學(xué)，但是尚不多見活性物質(zhì)的構(gòu)效關(guān)系研究。目前已通過前線分子軌道分析甲硫氨酸和酪氨酸的抗氧化機制[5]；定位多種肽的活性位點，包括水產(chǎn)源鮮味肽[6-7]，酪蛋白源睡眠增強肽YPVEPF[8]，桑黃抗癌肽[9]，抗氧化肽PMRGGGGYHY[10]，DDDY和DYDD[11]、EAAY[12]、FSEY等[13]；并通過密度泛函理論描述了豬肉源二肽基肽酶（dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV）抑制二肽的電子特性，發(fā)現(xiàn)疏水性氨基酸（尤其是苯丙氨酸和酪氨酸）的重要作用[14]。然而，尚鮮見α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制肽的量子化學(xué)研究。

干腌火腿等豬肉產(chǎn)品是降糖小肽的優(yōu)秀蛋白來源，其蛋白質(zhì)經(jīng)過內(nèi)源酶和微生物共同作用生成多種肽和游離氨基酸[15]。伊比利亞干腌火腿中具有α-葡萄糖苷酶抑制肽[16]和DPP-IV抑制肽[17]。皖浙花豬是制作火腿的優(yōu)質(zhì)品種，原產(chǎn)于安徽黃山地區(qū)和浙江淳安縣[18]。目前，相關(guān)研究集中在遺傳資源和養(yǎng)殖，營養(yǎng)價值未被開發(fā)。因此，本研究從皖浙花豬干腌火腿中制備降糖小肽，分離純化并鑒定、篩選序列后，計算量子化學(xué)結(jié)構(gòu)/能量參數(shù)，探究氨基酸組成、立體構(gòu)象、前線軌道分布、電荷、鍵長等對活性的影響，預(yù)測活性位點，揭示降糖機理，以期為進一步開發(fā)、改造、合成肽類產(chǎn)品，克服產(chǎn)業(yè)化挑戰(zhàn)奠定理論和科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皖浙花豬干腌火腿，購自安徽黃山市烏金園養(yǎng)豬專業(yè)合作社。隨機采樣多支后熟期火腿樣品，真空包裝后于（-18±2）℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

對硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷、碘、二甲基亞砜上海阿拉丁生化科技股份有限公司；阿卡波糖、α-淀粉酶（≥800 FAU/g）、α-葡萄糖苷酶（≥10 U/mg）美國Sigma-Aldrich公司；胃蛋白酶（≥2500 U/mg）、胰蛋白酶（＞3000 U/mg）上海麥克林生化科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、碳酸鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀（均為分析純）國藥集團化學(xué)試劑有限公司；馬鈴薯淀粉 晉城市古陵山食品有限公司；蛋白定量/濃度測定（二奎啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA））試劑盒 大連美侖生物技術(shù)有限公司；Sephadex G-25凝膠填料 美國GE Healthcare公司；ODS-AQ-HG填料 日本YMC公司；合成肽 合肥科生景肽生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Y55-40M高速分散乳化儀 上海約迪機械設(shè)備有限公司；H1750R離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；N1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機 上海繼譜電子科技有限公司；Infinite E PLEX酶標儀 瑞士Tecan公司；PHS-3CB型pH計 上海越平科學(xué)儀器有限公司；HL-2D恒流泵、HD-5電腦紫外檢測儀、BSZ-100自動部分收集器上海滬西分析儀器廠有限公司；HC-0210-10中壓層析柱15 mm×100 cm 上海華美實驗儀器廠；RP-C18柱（0.15 mm×150 mm）美國Column技術(shù)公司；Mastersizer 2000激光粒度儀 英國Malvern公司；Easy nLC耦合Q Exactive質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 多肽的提取

體外模擬胃腸消化：參考Wang Wenli等[19]的方法并修改。在均質(zhì)機中加入100 g攪碎的火腿肌肉和400 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.0）中，4 ℃、10000 r/min均質(zhì)30 s/次，共循環(huán)8 次。調(diào)節(jié)pH值至2.0，添加質(zhì)量分數(shù)2.5%的胃蛋白酶，37 ℃攪拌消化2 h后調(diào)節(jié)pH值至7.0滅酶。向胃產(chǎn)物中添加胰蛋白酶至最終質(zhì)量分數(shù)為4%，37 ℃攪拌消化2 h后在95 ℃加熱5 min滅酶。加入300 mL無水乙醇，4 ℃靜置12 h沉淀未消化蛋白質(zhì)。在4 ℃、10000×g離心20 min，取上清液進行旋蒸，凍干樣品并冷凍保存。

水溶提取法：參考Mora等[17]的方法并修改。在均質(zhì)機中加入100 g攪碎的火腿肌肉和400 mL 0.01 mol/L的HCl溶液，4 ℃、10000 r/min均質(zhì)8 min，所得勻漿4 ℃、12000×g離心20 min，玻璃棉過濾后取液體。添加3 倍體積無水乙醇，4 ℃靜置20 h沉淀蛋白質(zhì)。將樣品在上述條件下再次離心，取上清液進行旋蒸，凍干樣品并冷凍保存。

1.3.2 消化率、提取率和可溶性肽含量測定

消化率是被消化的蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的比例。用BCA蛋白定量試劑盒檢測樣品消化前后的蛋白質(zhì)含量[19]，按式（1）計算消化率：

式中：W0和WD分別為樣品消化前和消化后的蛋白質(zhì)含量。

肽提取率是提取產(chǎn)物中蛋白質(zhì)量與所用原料初始質(zhì)量的比值，按式（2）計算[20]：

可溶性肽含量用于衡量可溶解的蛋白質(zhì)占初始樣品的質(zhì)量百分比，是各組分溶液中的蛋白質(zhì)量濃度與配制時樣品質(zhì)量濃度的比值，可溶性肽質(zhì)量分數(shù)按式（3）計算：

式中：ρ1為各組分溶液中的蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρ0為配制時樣品質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.3 葡聚糖凝膠分離純化

將多肽樣品復(fù)溶于超純水中，制備成200 mg/mL溶液，通過0.45 μm水系膜過濾。取1.5 mL濾液上樣于Sephadex G-25凝膠的中壓層析柱（15 mm×100 cm）。以去離子水洗脫，流速1.0 mL/min，每管收集2.0 mL，檢測波長220 nm。采用HD-A色譜處理系統(tǒng)記錄圖譜，同時收集各組分[21]。

1.3.4α-淀粉酶抑制活性測定

參考H?asová等[22]的方法并修改。將100 mg馬鈴薯淀粉溶解于5 mL PBS（0.1 mol/L，pH 7.0）中煮沸5 min，冷卻至室溫作為底物。在96 微孔板中加入溶解于二甲基亞砜的2 μL質(zhì)量濃度5 mg/mL樣品、50 μL底物和30 μL上述PBS，37 ℃孵育5 min。添加20 μL、5 μg/mL的α-淀粉酶溶液，37 ℃孵育15 min。加入50 μL 1 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)。最后加入50 μL 0.01 mol/L碘溶液，測量650 nm波長處吸光度。以阿卡波糖作為陽性對照。α-淀粉酶抑制率計算公式如下：

式中：A1為含有樣品、底物、酶的溶液吸光度；A2為含有樣品和底物的溶液吸光度；A3為含有底物和酶的溶液吸光度；A4為僅含有底物的溶液吸光度。

1.3.5α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

參照Wang Rongchun等[23]的方法并修改。在96 微孔板中加入25 μL PBS（0.2 mol/L，pH 6.8）、25 μL質(zhì)量濃度1 mg/mL的對硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷溶液和25 μL、10 mg/mL樣品，混合后37 ℃孵育5 min。隨后添加緩沖液配制的5 μL濃度0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃孵育30 min。最后添加40 μL濃度1 mol/mL Na2CO3溶液終止反應(yīng)，立即測量405 nm波長處光密度。以阿卡波糖作為陽性對照。α-葡萄糖苷酶抑制率按式（5）計算：

式中：ODS為樣品和酶反應(yīng)后的光密度；ODA為樣品換為等量緩沖液的光密度；ODB為樣品和酶都換為等量緩沖液的光密度。

1.3.6 粒度測定

利用Mastersizer 2000激光粒度儀測量上清液粒度[24]。設(shè)置如下：非球形顆粒，相對折射率為1.54，吸收率為0.001，密度為1 g/cm3，水作為分散劑。采用濕法檢測，取0.1 g的樣品分散于2 mL去離子水中，超聲處理5 min使懸浮液均勻。隨后滴加到樣品池內(nèi)，調(diào)至合適的遮光度。分析其平均粒徑，測試3 次取平均值。

1.3.7 序列鑒定

參考鐘玉旺等[25]的方法。液相色譜條件：A液為0.1%甲酸-水溶液，B液為0.1%甲酸-乙腈水溶液（乙腈為84%）。色譜柱為RP-C18柱（0.15 mm×150 mm），以95%的A液進行平衡，洗脫時間60 min。質(zhì)譜鑒定：樣品經(jīng)毛細管高效液相色譜分離后進行質(zhì)譜分析，時長：60 min，掃描范圍：m/z300～1800，檢測方式：正離子。多肽和多肽碎片的質(zhì)荷比按照每次全掃描后采集10 個碎片圖譜。原始文件用軟件MaxQuant 1.5.5.1處理，根據(jù)UniProt_cameidae_89471_20201019（包含89471 個序列，于2020年10月19日下載）搜索，得到鑒定及定量分析結(jié)果。

1.3.8 序列篩選

利用PeptideRanker程序（http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）對序列評分，評分高于0.7為備選序列[26]；利用Expasy-PeptideCutter（https://web.expasy.org/peptide_cutter/）對序列進行虛擬水解；在BIOPEP-UWM數(shù)據(jù)庫（https://biochemia.uwm.edu.pl/）中檢索可能存在的降糖序列[27]；利用PepDraw（http://www2.tulane.edu/～biochem/WW/PepDraw/）在線預(yù)測序列的等電點、凈電荷和疏水性[28]；采用ToxinPred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/design.php）和Pepcalc程序（https://pepcalc.com/）分析毒性和水溶性[29]。

1.3.9 量子化學(xué)計算

參考Wen Chaoting等[30]的方法，使用Gaussview 5.0軟件構(gòu)建分子結(jié)構(gòu)，在Gaussian 09軟件中選擇B3LYP/6-31G（d）基組進行全分子幾何構(gòu)型優(yōu)化，直到振動頻率無負值，虛頻為零。計算肽分子的能量參數(shù)（分子總能量、分子前線軌道分布與能級）和結(jié)構(gòu)參數(shù)（原子Mulliken電荷分布、鍵長）等。

1.3.10 肽的固相合成

采用體外固相法合成篩選出的肽序列，并利用液相色譜和質(zhì)譜分析其純度和分子質(zhì)量，得到純度＞95.00%、分子質(zhì)量準確的肽組分。

1.4 統(tǒng)計分析

使用Microsoft Excel、SPSS Statistics 26.0和Origin 2018進行數(shù)據(jù)處理與分析；所有實驗重復(fù)3 次，結(jié)果表示為。

2 結(jié)果與分析

2.1 多肽消化率、提取率和可溶性肽含量

牛血清白蛋白標準曲線方程為y＝0.2478x+0.0095（R2＝0.9981），線性良好。根據(jù)樣品的吸光度，換算得到樣品的蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。計算出胃蛋白酶對多肽的消化率為（46.41±1.23）%，再經(jīng)胰蛋白酶消化后顯著增加至（79.11±1.85）%（P＜0.05），類似1～3 a成熟期中國干腌火腿（金華、如高和宣威）的體外消化率[19]。如表1所示，水溶法對肽的提取率為（3.81±0.07）%，符合已有研究[20]。而胃胰酶消化法的肽提取率是水溶法的10 倍以上，其產(chǎn)物的可溶性肽含量也顯著較高（P＜0.05）。可見胃胰酶消化法的提取效率更高。

表1 兩種方法的肽提取率及產(chǎn)物的可溶性肽含量Table 1 Extraction rates of peptides and soluble peptide contents of the water extract and the gastropancreatic digest of dry-cured ham

2.2 葡聚糖凝膠分離純化結(jié)果

葡聚糖凝膠常用于對干腌火腿中不同分子質(zhì)量的肽進行分級。圖1a是胃胰酶消化產(chǎn)物的葡聚糖凝膠Sephadex G-25分離圖譜，總洗脫時間為170 min，主要分為WY-I（40～90 min）、WY-II（95～125 min）和WY-III（125～160 min）3 個組分。圖1b是水提物的分離圖譜，總洗脫時間為220 min，主要分為S-I（50～140 min）和S-II（140～220 min）2 個組分。根據(jù)分離原理，出峰越晚，分子質(zhì)量越小，各組分的分子質(zhì)量依次為：WY-I＞W(wǎng)Y-II＞W(wǎng)Y-III和S-1＞S-II。西式干腌火腿小肽有類似的分離圖譜，活性最高組分中所含肽的分子質(zhì)量為400～2500 Da[17]。

圖1 胃胰酶消化產(chǎn)物（a）和水提物（b）的Sephadex G-25分離圖譜Fig.1 Sephadex G-25 gel filtration chromatograms of the gastropancreatic digest (a) and the aqueous extract (b)

如圖2所示，各組分均對兩種酶表現(xiàn)了一定的抑制活性，而胃胰酶消化產(chǎn)物及組分的活性遠高于水溶提取肽及組分?？赡苁怯捎诿笇Φ鞍椎那懈钭饔?。α-淀粉酶抑制率排序為：WY-I＞W(wǎng)Y-II＞W(wǎng)Y＞W(wǎng)Y-III＞S-II＞S-I＞S，而α-葡萄糖苷酶抑制率為：WY-II＞W(wǎng)Y＞W(wǎng)Y-I＞S-II＞W(wǎng)Y-III＞S＞S-I。降糖活性肽大多為小分子[31]，且只有WY-II組分的兩種抑制率均高于60%，分別為（66.66±1.2）%和（68.28±2.73）%，因此選擇它進行后續(xù)研究。

圖2 胃胰酶消化產(chǎn)物和水提物及其分離組分的α-淀粉酶抑制率和α-葡萄糖苷酶抑制率Fig.2 α-Amylase and α-glucosidase inhibitory activities of the gastropancreatic digest and the aqueous extract as well as their separated fractions

2.3 粒徑分析

顆粒大小反映了蛋白質(zhì)經(jīng)過消化或均質(zhì)后的降解程度，影響其體內(nèi)吸收能力。表2為火腿肌肉粗蛋白、兩種提取物及其分離組分上清液的粒徑。分離前，粗蛋白的D4,3和D3,2均最大。分離后不同組分的粒徑存在顯著差異（P＜0.05）。消化肽的3 個組分中WY-I的粒徑最大，而WY-II和WY-III的D4,3和D3,2無顯著差異，說明二者的粒徑分布相對相似。水溶物兩個組分S-I和S-II的粒徑均顯著大于消化肽組分。說明火腿肌肉經(jīng)過蛋白酶降解，顆粒尺寸顯著減小，符合現(xiàn)有研究[19,24]。

表2 胃胰酶消化產(chǎn)物和水提物及其分離組分的粒徑Table 2 Particle sizes of the gastropancreatic digest and the aqueous extract as well as their separated fractions μm

2.4 序列鑒定和篩選

鑒定高活性組分WY-II中的小肽，獲得了104 條長度8～24 個氨基酸的序列。主要蛋白來源有平滑肌肌動蛋白α2、肌球蛋白-4、I型膠原蛋白α1鏈、肌酸激酶、肌球蛋白輕鏈1等。利用多種生物信息學(xué)工具進行篩選，獲得了5 條PeptideRanker評分高于0.7的備選序列，長度9～14 肽，分子質(zhì)量854～1252 Da。小分子肽活性高可能是與酶活性中心殘基形成了氫鍵。而氨基酸性質(zhì)和排列也有重要影響，尤其是疏水性。表3中序列含有大量疏水性脯氨酸（N端第二位及中間），N端存在甘氨酸，C端含有堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸）。序列包含支鏈氨基酸[32]，N端的甘氨酸[33]和亮氨酸[34]，或PP、GP等特定二肽[33]更易結(jié)合α-淀粉酶。此外，含有疏水性亮氨酸、脯氨酸[23]，以及胰蛋白酶水解后末端具有精氨酸或賴氨酸的肽都會抑制α-葡萄糖苷酶[35]。肽的等電點和靜電荷與活性之間具有強相關(guān)性[14]，5 條序列的理論等電點為9.80～11.13，凈電荷為1，疏水性為13.37～16.00 kcal/mol，均無毒性，其中4 條水溶性良好。因此，篩選這5 條序列進行量子化學(xué)計算。

表3 組分WY-II中的肽序列及其理化性質(zhì)Table 3 Physicochemical properties of peptide sequences in WY-II

2.5 分子構(gòu)型優(yōu)化

圖3為量子化學(xué)優(yōu)化后5 條備選序列的分子構(gòu)型。序列的長度較長，增加了形成分子內(nèi)氫鍵的可能性，也有利于形成在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中占主導(dǎo)的α-螺旋。螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是多種綜合性質(zhì)（構(gòu)象熵、空間位阻、疏水性和靜電性等）平衡的結(jié)果，其中氫鍵網(wǎng)絡(luò)具有重要作用[36]。5 條序列均具有脯氨酸，其側(cè)鏈的吡咯環(huán)結(jié)構(gòu)具有特殊構(gòu)象剛性，分子結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)角。P2、P3的空間結(jié)構(gòu)較為收縮，P3分子形狀卷曲復(fù)雜，可能是脯氨酸出現(xiàn)次數(shù)多，分子內(nèi)相互作用力較大。除P3外均含有精氨酸，其中P2精氨酸側(cè)鏈胍基與N2位脯氨酸吡咯環(huán)相互作用，促使結(jié)構(gòu)更為緊湊。P4和P5空間結(jié)構(gòu)較為伸展，可能因為分子內(nèi)相互作用力較小。

圖3 5 條血糖調(diào)節(jié)肽的最優(yōu)空間構(gòu)象Fig.3 Optimal spatial conformations of five blood glucose-regulating peptides

2.6 前線分子軌道分布

分子前線軌道理論認為分子軌道是分子體系的波函數(shù)，分子里也存在活躍的“前線分子軌道”，即能量最高的電子占有軌道（highest occupied molecular orbital，HOMO）和能量最低的電子未占軌道（lowest unoccupied molecular orbital，LUMO），分別表示供電子和接收電子區(qū)域?；瘜W(xué)反應(yīng)只和前線分子軌道有關(guān)，且HOMO軌道具有特殊地位[37]。

圖4是5 條序列的前線分子軌道分布，這些位點與酶的反應(yīng)活性可能有顯著差異。P1～P5分別有687、651、1119、914、834 條分子軌道及能級。其中，P1、P2和P5的HOMO軌道都主要分布在精氨酸的胍基上。胍基釋放出活潑氫后，存在超共軛及共軛現(xiàn)象，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。P3的HOMO軌道主要分布在C端賴氨酸的側(cè)鏈，P4的HOMO軌道主要分布在N端亮氨酸。而P1的LUMO軌道主要分布在C4位甘氨酸殘基、C3位脯氨酸、C2位精氨酸的肽鍵，P2～P5的LUMO軌道都分布在C端氨基酸的羧基。可見，氨基酸和種類和不同排列都會影響HOMO的分布[11]，HOMO軌道多分布在精氨酸的胍基及靠近氨基端的活性基團，而LUMO軌道則主要分布在末端羧基及靠近羧基端的基團。

圖4 5 條血糖調(diào)節(jié)肽的前線分子軌道分布Fig.4 HOMO and LUMO orbit distribution of five blood glucoseregulating peptides

分子總能量越小，結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定[38]。表4中5 條序列的總能量排序：P1＞P2＞P5＞P4＞P3。最高占有軌道能級值（EHOMO）和最低未占有軌道能級（ELUMO）分別反應(yīng)分子的供電子和接受電子能力。EHOMO越大供電子能力越強，易發(fā)生親核反應(yīng)[39]。表4中EHOMO排序：P3＞P2＞P5＞P4＞P1，說明P3和P2供電子能力較強。而ELUMO越低接受電子能力越強，ELUMO排序為：P2＜P4＜P1＜P5＜P3。ELUMO與EHOMO的差值ΔEL-H表示電子從基礎(chǔ)態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)所需的能量。能級差越小，π-電子從低能區(qū)到高能區(qū)的激發(fā)增加，分子反應(yīng)活性越強；而能級差越大則分子剛性更強、更穩(wěn)定，電子跌遷能力越弱[40]。由表4可見，ΔEL-H值隨著EHOMO的增加有下降的趨勢，與K?ska等[14]研究相似。其排序是：P2＜P4＜P3＜P5＜P1，故P2、P4、P3的活性可能相對較高。

表4 5 條血糖調(diào)節(jié)肽的偶極矩、總能量和前線分子軌道能量Fig.4 Dipole moment,total energy,and molecular orbital energy of five blood glucose-regulating peptides

2.7 電荷分布、鍵長與活性位點

降糖肽分子的電荷分布和鍵長對活性有重要影響，主要在前線分子軌道中能級相近的位置上與受體分子發(fā)生相互作用?；钚圆课蛔钣锌赡苁菍η熬€軌道貢獻較大的原子，如HOMO軌道。由庫侖公式可知：兩原子之間的靜電荷差值越小，或距離越遠（鍵長越長），則庫倫作用力越小，鍵越弱，越易斷裂，血糖調(diào)節(jié)能力越強。

5 條序列的電荷分布規(guī)律相似，負電荷主要分布在N和O原子上，正電荷主要分布在與H及與O相連的C原子上（數(shù)值未列出）。由圖4和表5可知，P1的HOMO主要分布在精氨酸的胍基，是反應(yīng)活性部位所在。在97～114號原子之間，靜電荷差值最小的兩原子是C100（-0.2443 e）與H103（0.1431 e）、C104（-0.1015 e）與H105（0.1285 e），對應(yīng)鍵長為C100H103（1.5384 ?）和C104H105（1.3609 ?），根據(jù)庫侖定律計算得C104H105兩原子間的庫侖作用力最小，因此，P1活性位點位于精氨酸的C104H105。同理可證，P2～P5的活性位點分別位于精氨酸的C106H108、賴氨酸的C176H177、亮氨酸的C10H12、精氨酸胍基的C35H37。可見，5 條序列的活性位點都位于C—H鍵。這與抗氧化肽的結(jié)果有所不同。四肽DYDD和DDDY的活性位點都位于O58-H59和N10-H12[11]，且肽的活性也可能來自多種不同活性位點[10]。

表5 P1序列GPAGPQGPRG的Mulliken電荷分布及鍵長Table 5 Mulliken charge distribution and bond length of sequence P1-GPAGPQGPRG

2.8 活性驗證

為驗證推斷的準確性，采用固相法合成上述5 條肽序列，再實測其體外α-淀粉酶抑制率和α-葡萄糖苷酶抑制率。如表6所示，兩種降糖活性的排序依次為：P2＞P4＞P3＞P5＞P1和P2＞P3＞P4＞P5＞P1。綜合分析量子化學(xué)參數(shù)及體外活性，發(fā)現(xiàn)活性與前線軌道能級差ΔEL-H有較明顯的相關(guān)性，可能因為ΔEL-H越小，電子的躍遷能力越強，分子在化學(xué)反應(yīng)中的活性越強。針對抗氧化肽的研究也有類似結(jié)論[41]。

表6 5 條肽序列的α-淀粉酶抑制率和α-葡萄糖苷酶抑制率Table 6 α-Amylase and α-glucosidase inhibition rates of five synthetic peptides

3 結(jié)論

從皖浙花豬干腌火腿胃胰酶消化產(chǎn)物的高降糖活性組分中鑒定出104 條肽，篩選出5 條備選序列，量子化學(xué)計算發(fā)現(xiàn)HOMO軌道多分布在精氨酸的胍基及靠近氨基端的活性集團上，而LUMO軌道則多分布在末端羧基及靠近羧基端的基團上；能級差較小、活性可能較高的序列為GPMGPSGPR、LGFGGPSGPNAGR、APAPAPAPAPAPPK；根據(jù)電荷分布和鍵長推測5 條序列的活性位點都位于C—H鍵；體外活性驗證了降糖活性可能與能級差有關(guān)。下一步考慮利用體外模型驗證序列的活性與位點。