電化學(xué)技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用研究進(jìn)展

王 艷，包士雷，孫立瑞，竇博鑫，辛嘉英，張 娜

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150028）

食品檢測分析技術(shù)是保障食品質(zhì)量和安全、助力食品工業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵之一。目前，常用的方法如氣相及液相色譜法、分光光度法、固相萃取法、質(zhì)譜法等多是基于大型儀器，雖然具有靈敏度高、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)，但仍然存在一些現(xiàn)實(shí)問題，如專用儀器設(shè)備價(jià)格昂貴、操作技術(shù)要求較高、檢測耗時(shí)長、檢測成本高和分析過程繁復(fù)[1]，這使得其無法實(shí)現(xiàn)便捷式的快速檢測。開發(fā)精確便捷的檢測技術(shù)，在食品行業(yè)有著廣泛的需求。相較之下，電化學(xué)技術(shù)由于其操作要求較低、精密度及靈敏度較高且設(shè)備便宜等優(yōu)點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注和研究。本文從電化學(xué)檢測分析技術(shù)方法、基本原理和在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用現(xiàn)狀等方面進(jìn)行全面的綜述和分析，為電化學(xué)技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用與發(fā)展提供參考。

1 電化學(xué)檢測技術(shù)類型及原理

近年來，隨著電化學(xué)檢測技術(shù)不斷探究創(chuàng)新，其類型已發(fā)展出眾多檢測形式用以滿足多種環(huán)境下物質(zhì)的檢測需求，根據(jù)待測物質(zhì)的理化性質(zhì)及檢測機(jī)理的不同，將電化學(xué)檢測技術(shù)分為兩種，一種為直接電化學(xué)檢測技術(shù)，另一種為間接電化學(xué)檢測技術(shù)。

1.1 直接電化學(xué)檢測技術(shù)

原理：基于檢測物自身結(jié)構(gòu)的易氧化還原特性，比如一些含有電活性基團(tuán)的物質(zhì)如酚[2-3]、醇[4]、醛[5]及化合物，以及金屬離子[6]等具有優(yōu)良電活性的物質(zhì)，在一定的電位條件下容易在電極上得失電子，并發(fā)生氧化或還原反應(yīng)從而產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)電化學(xué)相關(guān)檢測。

由于檢測條件、物質(zhì)性狀的不同，使用裸電極進(jìn)行檢測產(chǎn)生的電信號(hào)可能較弱，對其痕量檢測需要進(jìn)行電信號(hào)的有效放大，通過研究發(fā)現(xiàn)，在裸電極上修飾不同類型的材料如納米材料[7]、金屬-有機(jī)框架材料[8]，以及一些生物材料[9]等，利用不同材料結(jié)構(gòu)特征可提高電極比表面積[10]，增加電子傳遞速率并提供更多活性位點(diǎn)以提升催化效率[11]，優(yōu)化檢測限、靈敏度及選擇性等，從而提高對物質(zhì)的直接電化學(xué)檢測性能。

1.2 間接電化學(xué)檢測技術(shù)

由于某些食品組分不具備明顯的電化學(xué)活性，導(dǎo)致電化學(xué)響應(yīng)較弱，研究發(fā)現(xiàn)在檢測系統(tǒng)中添加如二茂鐵、鐵氰化鉀及亞甲基藍(lán)等電活性物質(zhì)（即氧化還原介質(zhì)），將酶、抗體、適配體或DNA等特異性識(shí)別元件固定在電極表面，利用待測物質(zhì)與識(shí)別元件的特異性結(jié)合，其相互作用使電活性物質(zhì)產(chǎn)生的電信號(hào)發(fā)生變化，從而達(dá)到間接檢測的目的。此類技術(shù)目前主要通過構(gòu)建電化學(xué)傳感器實(shí)現(xiàn)應(yīng)用，根據(jù)識(shí)別元件的不同，可分為電化學(xué)酶傳感器[12]、電化學(xué)適配體傳感器[13]、電化學(xué)免疫傳感器[14]、分子印跡傳感器[15]等。各種傳感器在食品組分檢測中的應(yīng)用情況如表1所示。

表1 不同傳感器在食品電化學(xué)檢測中的應(yīng)用Table 1 Application of different sensors in food electrochemical detection

2 電化學(xué)技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用

2.1 直接電化學(xué)檢測技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用

直接電化學(xué)檢測技術(shù)是基于物質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有的電活性物質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生電信號(hào)的原理進(jìn)行檢測，對于檢測過程而言，由于電活性物質(zhì)的直接信號(hào)表達(dá)，省去了繁瑣的識(shí)別信號(hào)原件修飾、信號(hào)轉(zhuǎn)換及復(fù)雜的反應(yīng)過程，使整個(gè)檢測過程更加快速高效。但同時(shí)也存在因不同電極或物質(zhì)結(jié)構(gòu)等因素，導(dǎo)致在電極上反應(yīng)的電子轉(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)緩慢、電化學(xué)響應(yīng)較弱以及過電位高等問題。針對這些問題，近年來的研究擬通過使用各種類型材料，將裸電極進(jìn)行改性修飾以實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，可有效增強(qiáng)電活性物質(zhì)在電極反應(yīng)過程中的信號(hào)響應(yīng)。根據(jù)修飾材料以及增強(qiáng)機(jī)制的不同，直接電化學(xué)檢測技術(shù)可分為基于酶促反應(yīng)機(jī)制及非酶促反應(yīng)機(jī)制兩類。

2.1.1 基于酶促反應(yīng)機(jī)制的直接電化學(xué)檢測技術(shù)應(yīng)用

酶促反應(yīng)又稱酶催化或酵素催化作用，是以酶作為催化劑進(jìn)行催化的化學(xué)反應(yīng)。在直接電化學(xué)檢測技術(shù)中通過將酶修飾在電極上，催化待測物質(zhì)進(jìn)行氧化從而產(chǎn)生電信號(hào)實(shí)現(xiàn)檢測。近年來，基于酶促反應(yīng)的直接電化學(xué)檢測技術(shù)已實(shí)現(xiàn)于第三代生物傳感器的開發(fā)應(yīng)用當(dāng)中。三代生物傳感器的檢測機(jī)制如圖1所示。相較于前兩代生物傳感器[32-33]，可以看出第三代傳感器在電子傳遞過程中，無需通過間接檢測O2的消耗或酶反應(yīng)產(chǎn)物H2O2的生成，亦不需要使用電子媒介體進(jìn)行傳遞。反應(yīng)的信號(hào)全部來源于酶分子與被檢測物質(zhì)之間的氧化還原反應(yīng)[34]，因其電流密度大，使靈敏度升高確保電化學(xué)生物傳感器的高選擇性，提高檢測的精準(zhǔn)度，可應(yīng)用于食品中物質(zhì)的檢測。

圖1 三代生物傳感器電子轉(zhuǎn)移機(jī)制圖Fig.1 Schematic diagrams of electron transfer mechanism in three generations of biosensors

基于酶促反應(yīng)機(jī)制的直接電化學(xué)檢測技術(shù)應(yīng)用如表2所示，通過酶促反應(yīng)對食品進(jìn)行直接電化學(xué)檢測的應(yīng)用相對較少，現(xiàn)開發(fā)用于營養(yǎng)相關(guān)成分的檢測如葡萄糖[35-37]、果糖[38]、乳糖[39]、膽固醇[40]等，在真菌毒素[41]方面也有相關(guān)檢測。由于酶的活性中心普遍深埋于分子結(jié)構(gòu)內(nèi)部，電子轉(zhuǎn)移距離過遠(yuǎn)使得酶與電極間電子轉(zhuǎn)移的效率下降，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)金屬納米材料[37,39]的高導(dǎo)電性、高催化性可起到增大酶與電極間電子傳遞速率的作用。通過制備如金、銀等貴金屬納米顆粒修飾電極，可有效增加電活性表面積和電子轉(zhuǎn)移速率，結(jié)合天然酶類物質(zhì)進(jìn)行共同修飾，可用于對營養(yǎng)物質(zhì)如糖類、膽固醇等進(jìn)行基于酶促反應(yīng)的直接電化學(xué)檢測[37,39]，研究表明貴金屬納米材料的修飾能有效促進(jìn)電子傳遞，并協(xié)同催化酶促反應(yīng)使信號(hào)增強(qiáng)。酶生物傳感器的另一大問題在于將酶直接吸附在電極表面容易造成變性失活。有研究發(fā)現(xiàn)碳基材料[42]具有穩(wěn)定性高、比表面積大等優(yōu)點(diǎn)，將酶固定在上面可增加酶的穩(wěn)定性并保持原有催化活性，常用材料有碳納米管、石墨烯及其復(fù)合材料等[35,40,42]，研究表明，通過碳基材料復(fù)合制備生物傳感器可以有效提高組裝酶與電極表面之間的電子轉(zhuǎn)移能力[40]。此外，Wu Shuyao等[40]發(fā)現(xiàn)使用層層自組裝技術(shù)進(jìn)行電極制備，可以在溫和條件下固定更多的酶，有利于保持酶的生物活性，可提升其對膽固醇的親和力，進(jìn)一步增強(qiáng)傳感器檢測的穩(wěn)定性、抗干擾性。

表2 基于酶促反應(yīng)的直接電化學(xué)檢測技術(shù)在食品相關(guān)組分檢測中的應(yīng)用Table 2 Application of direct electrochemical detection technology based on enzymatic reaction in the detection of food components

2.1.2 基于非酶促反應(yīng)機(jī)制的直接電化學(xué)檢測技術(shù)應(yīng)用

基于酶促反應(yīng)的直接電化學(xué)檢測技術(shù)通過天然酶對待測物進(jìn)行催化反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)有效的信號(hào)放大效果。其擁有良好的選擇性及高靈敏度、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。但天然酶存在易失活、固定化過程復(fù)雜費(fèi)時(shí)等問題。近年來，研究發(fā)現(xiàn)通過引入碳基納米材料如石墨烯[43]、碳納米管[44]等，以及納米金屬[45]、金屬氧化物納米材料[46]、復(fù)合納米材料[47]等修飾電極，利用納米材料比表面積高、導(dǎo)電性好、攜帶活性基團(tuán)多等特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)檢測性能的有效提升。納米材料的修飾及催化過程如圖2所示，修飾后能有效加快電流傳遞、增加電極表面積及反應(yīng)活性位點(diǎn)，對待測物起到良好的電催化作用[48]，催化過程產(chǎn)生電信號(hào)用于待測物的相關(guān)檢測。

圖2 納米材料修飾電極過程（A）和納米材料催化反應(yīng)機(jī)制（B）Fig.2 Electrode modification by nanomaterials (A) and catalytic mechanism of nanomaterials (B)

針對某些電活性物質(zhì)信號(hào)響應(yīng)差、氧化過電位較高等所導(dǎo)致的檢測靈敏度偏低、檢測結(jié)果不理想等問題，非酶促反應(yīng)機(jī)制的直接電化學(xué)檢測技術(shù)利用各種納米材料的高導(dǎo)電性、高催化性[11]實(shí)行有效的信號(hào)放大策略，對食品組分中電活性物質(zhì)的催化及檢測有著廣泛的應(yīng)用（表3）。檢測性能取決于修飾材料的響應(yīng)能力、催化活性以及穩(wěn)定性等，近年來，研究者致力于將多種納米材料復(fù)合制備，以彌補(bǔ)單一修飾材料在檢測性能方面的不足。

表3 不同修飾材料在食品電化學(xué)檢測中的應(yīng)用Table 3 Application of different modifying materials in food electrochemical detection

碳基材料的成本較低且具有良好的穩(wěn)定性，作為修飾材料廣泛應(yīng)用于電化學(xué)設(shè)備的制作及檢測過程中[49-51]，但由于其選擇性和催化活性較差，部分研究通過將碳基材料進(jìn)行表面改性和功能化以提升碳基材料的電活性[52]，也有研究選擇將碳基材料與其他活性材料進(jìn)行復(fù)合[53-56]，利用不同材料結(jié)構(gòu)的優(yōu)良性質(zhì)，形成協(xié)同作用以提升傳感器的檢測性能。碳基材料也可用于解決電極的生物污染問題[57]。研究人員利用快速泡沫印章輔助聚二甲基硅氧烷圖案，控制過濾過程中單壁碳納米管在聚偏二氟乙烯膜上的區(qū)域選擇性沉積，基于碳納米管的結(jié)構(gòu)特性制備了一次性防污傳感器。該傳感器可有效提高防污能力，并提升了檢測的重現(xiàn)性，可用于直接檢測咖啡、牛奶等復(fù)雜基質(zhì)中的嗎啡[57]。

金屬納米粒子的比表面積高，結(jié)合其自身結(jié)構(gòu)的小尺寸效應(yīng)使其具有良好的電催化活性[58]，可用于食品中亞硝酸鹽[59]、重金屬等痕量污染物檢測時(shí)的信號(hào)提升，增強(qiáng)檢測的精密度。但此結(jié)構(gòu)效應(yīng)也造成了顆粒聚集、反應(yīng)性差等缺點(diǎn)。金屬納米顆粒一般被分散或負(fù)載在載體上，因?yàn)榻饘俸洼d體之間的相互作用會(huì)影響電荷轉(zhuǎn)移、納米顆粒形貌等因素，通過選擇適當(dāng)?shù)妮d體如石墨烯、碳納米管等進(jìn)行復(fù)合制備[60-61]，利用碳基材料[62]的性質(zhì)可增強(qiáng)設(shè)備的穩(wěn)定性及活性表面積。研究人員通過復(fù)合制備使材料間形成協(xié)同催化效應(yīng)，有效地提高了電子傳遞速率，可進(jìn)一步提升檢測靈敏度，并將其成功應(yīng)用于多種醬料中偶氮染料的檢測[54]。

金屬氧化物因其成本低、易于制備且電活性高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品相關(guān)組分中化學(xué)物質(zhì)的檢測[63-66]。有研究表明，使用如TiO2、Fe2O3、CuO等金屬氧化物材料修飾電極可在較寬線性范圍表現(xiàn)出優(yōu)良的催化活性[64,66]，有團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)過渡金屬氧化物不僅資源豐富，且具有多種氧化形態(tài)，能夠活化所吸附的物質(zhì)，具有良好的催化性能。通過其豐富的活性位點(diǎn)和尺寸可設(shè)計(jì)性，與金屬有機(jī)框架（metal organic frameworks，MOFs）材料共同制備修飾傳感器可顯著提高催化性能，可用于牛乳中雙氧水等物質(zhì)的檢測[65]。

與天然酶相比，MOFs具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、成本低、活性可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)，合成方法眾多，如機(jī)械法、水熱法、電化學(xué)法等，經(jīng)研究證明電化學(xué)原位合成法可在電極表面原位生成目標(biāo)物質(zhì)，可方便傳感器的構(gòu)建[67]。此法構(gòu)建的傳感器具有反應(yīng)速度快、條件溫和、化學(xué)試劑消耗少等優(yōu)勢，已成功用于食品中亞硝酸鹽的檢測，結(jié)果顯示可有效催化待測物質(zhì)氧化并增大電流響應(yīng)[67]。研究發(fā)現(xiàn)單一的MOFs催化活性相對不易顯現(xiàn)，可將MOF與其他納米材料制備成復(fù)合MOFs提高其催化活性[67-71]，如將MOF與貴金屬納米粒子進(jìn)行復(fù)合，并與羧基化的碳納米管共同修飾到電極表面，利用復(fù)合納米材料的高催化性能對物質(zhì)含量進(jìn)行檢測，相比于裸電極，復(fù)合材料可以擴(kuò)大電活性表面積并加速電子轉(zhuǎn)移，對待測物質(zhì)的氧化還原過程表現(xiàn)出良好的催化性能[71]。

2.2 間接電化學(xué)技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用

在食品相關(guān)組分檢測中，存在一些物質(zhì)由于自身性質(zhì)特點(diǎn)，無法使用直接電化學(xué)檢測技術(shù)進(jìn)行定性定量檢測，于是間接電化學(xué)檢測技術(shù)開始廣泛應(yīng)用。即通過檢測系統(tǒng)中其他電活性物質(zhì)的信號(hào)變化，與待測物質(zhì)建立聯(lián)系。一般表現(xiàn)為待測物質(zhì)與修飾物特異性結(jié)合后，其反應(yīng)可影響電活性物質(zhì)產(chǎn)生電信號(hào)的形式進(jìn)而實(shí)現(xiàn)檢測?；谔禺愋苑磻?yīng)及影響信號(hào)的方式不同，可將間接技術(shù)分為基于信號(hào)放大機(jī)制檢測技術(shù)和基于抑制信號(hào)機(jī)制檢測技術(shù)。

2.2.1 基于信號(hào)放大機(jī)制檢測技術(shù)

利用信號(hào)放大機(jī)制的食品間接電化學(xué)檢測技術(shù)在適配體傳感器中應(yīng)用相對較多。通過在電極上修飾適配體或適配體-介質(zhì)復(fù)合物，構(gòu)建適配體電化學(xué)傳感器實(shí)現(xiàn)檢測，構(gòu)建及檢測過程如圖3所示。以適配體與待測物質(zhì)的特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，檢測結(jié)果通常表現(xiàn)為使介質(zhì)的電氧化還原信號(hào)增大，并建立與待測物質(zhì)含量的線性關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)快速檢測。

圖3 適配體傳感器的構(gòu)建及信號(hào)放大機(jī)制檢測原理Fig.3 Construction of aptamer-based sensors and their detection principle based on signal up-regulation

適配體通常是由指數(shù)富集進(jìn)化技術(shù)篩選出的寡核苷酸序列，可以是DNA或RNA，具有特異性強(qiáng)、識(shí)別標(biāo)靶范圍廣等特點(diǎn)，可輕易識(shí)別標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)差異，可與蛋白、核酸及許多有機(jī)無機(jī)分子、標(biāo)靶復(fù)合物等結(jié)合并發(fā)生反應(yīng)，使基于信號(hào)上調(diào)機(jī)制的適配體傳感器擁有著高特異性和靈敏度。近年來，適配體傳感器在食品安全檢測中應(yīng)用廣泛，基于信號(hào)上調(diào)機(jī)制的適配體傳感器在食源性有害物質(zhì)檢測中的應(yīng)用如表4所示，主要集中于如抗生素[72-77]、真菌毒素[20,22,78-83]、重金屬殘留[84-88]以及食源性致病菌[89-92]等天然或人工制造的食源性有害物質(zhì)檢測，目前，根據(jù)檢測機(jī)制以及是否采用標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記等不同，可將電化學(xué)適配體傳感器分為標(biāo)記型和非標(biāo)記型。

表4 基于信號(hào)放大機(jī)制的適配體傳感器在食源性有害物質(zhì)檢測中的應(yīng)用Table 4 Application of aptamer-based sensors based on signal upregulation in the detection of harmful foodborne substances

標(biāo)記型適配體傳感器通過將電活性物質(zhì)如氧化還原活性分子、酶類物質(zhì)以及納米材料與適配體結(jié)合，在檢測過程中引起適體數(shù)量或空間構(gòu)型改變，或利用自身結(jié)構(gòu)、催化性等引起的電信號(hào)變化進(jìn)行定量檢測。根據(jù)此性質(zhì)有研究發(fā)現(xiàn)，在金電極表面修飾含有電活性物質(zhì)的單鏈DNA，待測物存在時(shí)會(huì)與適配體形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而導(dǎo)致適配體無法與單鏈DNA形成互補(bǔ)雙鏈DNA，使電極表面的單鏈DNA被體系中的核酸酶P1消化水解，抗雙鏈DNA抗體無法修飾到電極上，使空間位阻減小，電活性物質(zhì)的電信號(hào)增大。結(jié)果證明，該方法可在0.1～500.0 nmol/L濃度范圍檢測抗生素，具有較低的檢測限[72]。重金屬的痕量檢測對于食品安全具有重要意義，研究發(fā)現(xiàn)利用亞甲基藍(lán)（methylene blue，MB）標(biāo)記的適配體及其部分互補(bǔ)DNA共同修飾電化學(xué)適配體傳感器，電極表面的cDNA-適配體通過cDNA的釋放，能夠發(fā)生較大構(gòu)象變化并促進(jìn)MB的電子傳遞效率，從而顯著提高電化學(xué)信號(hào)，檢測限低至0.65 fmol/L[88]，相較于同類型傳感器[85,87]，檢測性能更為優(yōu)異。

對于非標(biāo)記型適體傳感器，其檢測機(jī)制是通過目標(biāo)物質(zhì)與適體進(jìn)行識(shí)別反應(yīng)，導(dǎo)致構(gòu)象或空間位阻變化，電子傳輸過程的改變使電信號(hào)變化進(jìn)而實(shí)施檢測。基于此類機(jī)制的適體傳感器已成功應(yīng)用于食品中抗生素[74,77]、真菌毒素[79]及致病菌[90-91]的檢測中。有研究發(fā)現(xiàn)利用重金屬與胸腺嘧啶的特異性識(shí)別反應(yīng)，通過修飾含有T-T堿基錯(cuò)配的雙鏈互補(bǔ)DNA可實(shí)現(xiàn)對汞的特異性檢測[84,86]，T-T錯(cuò)配會(huì)阻斷DNA雙鏈內(nèi)部電荷轉(zhuǎn)移，而Hg2+通過與雙鏈DNA特異性結(jié)合會(huì)形成T-Hg2+-T配位物，能夠恢復(fù)DNA完全互補(bǔ)雙鏈的堿基堆積狀態(tài)，引起電極表面計(jì)時(shí)電量的變化，成功應(yīng)用于魚類樣品的檢測。

電化學(xué)適配體傳感器由于兼具電化學(xué)的簡便性、適配體的準(zhǔn)確性而得到廣泛應(yīng)用，但同時(shí)也存在著以下問題：首先由于食品成分的復(fù)雜性，過多的干擾物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致預(yù)處理過程更加繁瑣，影響檢測的選擇性和靈敏度；在食品樣品中，許多待測物質(zhì)往往以痕量形式存在，過多其他成分也會(huì)干擾檢測的準(zhǔn)確性。近年來多數(shù)研究利用DNA[93]、酶[94]的特異性，或引入功能化納米材料[89,95]修飾電極進(jìn)行信號(hào)增強(qiáng)，盡管生物識(shí)別原件可能存在如體系繁雜、反應(yīng)條件苛刻等缺點(diǎn)，納米材料也相對缺乏特異性，但為解決上述問題提供了不錯(cuò)的方向。對于適配體傳感器未來的發(fā)展，應(yīng)更多集中于解決如檢測過程中，樣品前處理的簡化、適配體等識(shí)別原件的開發(fā)篩選、運(yùn)輸保存等問題，以及深入對多種物質(zhì)實(shí)現(xiàn)快速、同時(shí)檢測等，對傳感器的小型化、集成化也應(yīng)是重點(diǎn)研究的方向之一。

2.2.2 基于抑制信號(hào)機(jī)制檢測技術(shù)

2.2.2.1 基于酶抑制作用的抑制信號(hào)機(jī)制

此類機(jī)制以酶作為識(shí)別原件修飾在電極上，通過對待測物進(jìn)行特異性識(shí)別為基礎(chǔ)。如圖4所示，通過與待測物或耦合其他修飾物發(fā)生反應(yīng)抑制酶的活性，降低酶對底物的催化能力，進(jìn)而使酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的電信號(hào)降低，以達(dá)到對待測物的間接定量檢測。

圖4 酶抑制機(jī)制檢測原理Fig.4 Detection principle of sensors based on enzyme inhibition

近年來基于此類機(jī)制開發(fā)的傳感器如表5所示，主要在檢測食品中農(nóng)藥殘留、重金屬污染方面有所應(yīng)用。測定農(nóng)藥殘留方面，在傳感元件的選擇上以乙酰膽堿脂酶和丁酰膽堿酯酶等應(yīng)用居多。以乙酰膽堿作為底物，當(dāng)有機(jī)磷農(nóng)藥存在時(shí)，農(nóng)藥中的磷酸基團(tuán)會(huì)將酶的活性基團(tuán)磷脂化，從而抑制酶的活性，使電信號(hào)降低。利用有機(jī)磷農(nóng)藥對酶催化活性的抑制作用，實(shí)現(xiàn)對各類農(nóng)作物中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留高靈敏度、高特異性的檢測[96-102]。有研究稱乙酰膽堿酯酶對農(nóng)藥殘留檢測的靈敏度較高，但易受到重金屬影響[93]。通過對酶傳感器進(jìn)行設(shè)計(jì)修飾可相應(yīng)提升檢測性能，如通過修飾納米金屬氧化物[95]、碳納米管和導(dǎo)電聚合物等[96]，利用自身的結(jié)構(gòu)特性增大電機(jī)的比表面積，使酶的固定化更加穩(wěn)定并提升催化性能及導(dǎo)電性，進(jìn)而增加傳感器的檢測性能。

表5 基于酶抑制機(jī)制的傳感器在食品電化學(xué)檢測中的應(yīng)用Table 5 Application of sensors based on enzyme inhibition in food electrochemical detection

基于酶抑制機(jī)制的電化學(xué)技術(shù)在食品中重金屬檢測相對較少，主要應(yīng)用于水中的有毒金屬殘留如鉛、汞等[103-106]，本課題組也基于此類機(jī)制開發(fā)了一種甲烷氧化菌素（methanobactin，Mb）耦合脂肪酶生物傳感器用于Cu2+的痕量檢測，利用Mb可特異性捕獲Cu2+的特點(diǎn)，在電極上固定化脂肪酶，檢測脂肪酶水解底物三油酸甘油酯時(shí)電信號(hào)的響應(yīng)情況。Cu2+與Mb特異性結(jié)合并在脂肪酶周圍產(chǎn)生富集現(xiàn)象，抑制脂肪酶的催化活性使反應(yīng)產(chǎn)物電信號(hào)降低，實(shí)現(xiàn)對Cu2+的快速定性檢測，獲得了較低的檢測限，為食品中重金屬的痕量檢測提供了研究基礎(chǔ)[103]。酶抑制型傳感器盡管優(yōu)點(diǎn)頗多，但其不足之處也顯而易見。除了作為酶傳感器的通病如穩(wěn)定性較差、活性易受環(huán)境干擾等之外，其獨(dú)特的傳感機(jī)制也在一定程度上限制了傳感器的構(gòu)建及檢測應(yīng)用[96,105]。探究有效酶抑制劑以拓寬檢測范圍，研制新型材料以實(shí)現(xiàn)酶的高負(fù)載、高活性固定也逐漸成為此類機(jī)制技術(shù)的研究方向[102]。

2.2.2.2 基于門控制效應(yīng)的抑制信號(hào)機(jī)制

通過利用待測物與電極修飾物的特異性結(jié)合反應(yīng)，控制探針分子到達(dá)電極表面的數(shù)量，進(jìn)而間接測定待測物濃度稱作門控制效應(yīng)[109]。如圖5所示，該效應(yīng)常用于利用分子印跡聚合物作為識(shí)別單元開發(fā)的電化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[110]、制備分子印跡電化學(xué)傳感器，以及利用特異性反應(yīng)如抗原抗體間的識(shí)別反應(yīng)，控制電活性物質(zhì)電信號(hào)大小的免疫傳感器[111]的開發(fā)制備等。其檢測過程如圖5所示，待測物與電極表面修飾物質(zhì)特異性結(jié)合，使得體系中的氧化還原探針與電極接觸受阻，抑制其發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致電信號(hào)下降，信號(hào)的下降與待測物含量呈線性關(guān)系，目前基于門控制技術(shù)開發(fā)的傳感器由于其識(shí)別元件具有特異性、高選擇性等，在食品安全相關(guān)檢測方面也得到了廣泛的應(yīng)用。

圖5 門控制效應(yīng)檢測原理Fig.5 Detection principle of sensors based on gate control effect

基于門控制效應(yīng)的傳感器在食品組分中的檢測應(yīng)用如表6所示。電化學(xué)免疫傳感器通過將抗原/抗體修飾在電極上作為識(shí)別原件，通過抗原抗體與待測物質(zhì)的特異性結(jié)合反應(yīng)，使電信號(hào)發(fā)生相應(yīng)變化實(shí)現(xiàn)檢測。由于識(shí)別原件的免疫反應(yīng)具有特異性，使其在檢測過程中具有較高的專一性和靈敏度。與適體傳感器類似，免疫傳感器可以根據(jù)分析時(shí)標(biāo)記物質(zhì)的有無分為標(biāo)記型和非標(biāo)記型，其中標(biāo)記型[112-115]通過將酶、納米材料、電活性物質(zhì)等修飾在二抗上，將標(biāo)記物作為傳感器的檢測信號(hào)，標(biāo)記物能影響檢測靈敏度及檢測限的高低。而非標(biāo)記型[116-121]則在電極上修飾抗原或抗體，并通過免疫識(shí)別前后的信號(hào)變化達(dá)到檢測的目的。相較之下，非標(biāo)記型由于避免了復(fù)雜的標(biāo)記過程，操作更為簡便，使得檢測性能相對更優(yōu)。由于免疫傳感器的抗體一般為活體制備，且需要與載體蛋白進(jìn)行結(jié)合以解決免疫原性低等問題，這使得檢測元件的活性易受環(huán)境影響，制作成本提高且降低檢測的準(zhǔn)確性。且由于待測物質(zhì)如真菌毒素[118]、抗生素殘留等的痕量存在，導(dǎo)致產(chǎn)生的信號(hào)微弱難以有效檢測。為優(yōu)化檢測性能，近年來研究者致力于開發(fā)功能化的復(fù)合材料，如將金屬納米材料與石墨烯進(jìn)行結(jié)合制備，這是由于石墨烯具有較大的比表面積，可更好地固定金屬納米材料及免疫識(shí)別元件。復(fù)合材料在增大檢測設(shè)備反應(yīng)面積的同時(shí)，其協(xié)同作用使信號(hào)高效傳遞，在肉類痕量抗生素殘留檢測中應(yīng)用廣泛[117,120]。目前，通過高效的制備方式及開發(fā)新型的基質(zhì)電極，可實(shí)現(xiàn)免疫反應(yīng)的放大[122]，使傳感器的性能得到進(jìn)一步提升。

表6 基于門控制效應(yīng)的傳感器在食品電化學(xué)檢測中的應(yīng)用Table 6 Application of sensors based on gate control effect in food electrochemical detection

分子印跡聚合物是以待測物質(zhì)作為模板材料，通過交聯(lián)劑與功能單體完成聚合，再經(jīng)過處理洗脫模板分子后，形成與待測物質(zhì)互補(bǔ)的聚合物，其內(nèi)部孔穴在形狀、大小等空間構(gòu)型以及官能團(tuán)上都與待測物質(zhì)互補(bǔ)，對待測物質(zhì)具有極高的特異性識(shí)別能力。分子印跡傳感器通過利用分子印跡聚合物與待測物質(zhì)的特異性結(jié)合反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為電化學(xué)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對食品中組分的檢測。分子印跡傳感器的適用對象往往是小分子物質(zhì)，憑借其極高的特異性，對食品中的色素[123-124]、農(nóng)藥殘留[125-127]、抗生素[128-129]及其他食源性有害物質(zhì)[130-131]的痕量檢測有著深入應(yīng)用。目前提升檢測靈敏度、制備更多合適的功能單體以及對大分子[132]組分進(jìn)行研究檢測等是分子印跡聚合物的研究重點(diǎn)。

2.3 電化學(xué)-光學(xué)聯(lián)用在食品檢測中的應(yīng)用

隨著電化學(xué)檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)光化學(xué)檢測具有較高的特異性、靈敏度[133]，且制備方便。與現(xiàn)有的電化學(xué)技術(shù)結(jié)合應(yīng)用，可有效提升檢測性能，并擴(kuò)大電化學(xué)傳感器的應(yīng)用范圍。目前在食品檢測領(lǐng)域，利用電化學(xué)-光學(xué)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行檢測，可根據(jù)信號(hào)及傳感原理的不同，分為光電化學(xué)傳感器[134]和電化學(xué)發(fā)光法[135]兩類。

光電化學(xué)傳感器通過將光敏材料和識(shí)別原件共同修飾制備而成[134]，通過電極信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)檢測。在光照條件下，光敏材料表面會(huì)產(chǎn)生電子空穴對，通過待測物與識(shí)別原件的結(jié)合使材料本身發(fā)生變化，從而改變信號(hào)值達(dá)到檢測目的。其產(chǎn)生的電流根據(jù)傳遞位置及發(fā)生反應(yīng)的不同，還可分為陰極、陽極兩種光電流。近年來在食品檢測領(lǐng)域，光電化學(xué)傳感器已被開發(fā)用于抗生素[136]、生物毒素[137-138]、小分子物質(zhì)[139]等，并在農(nóng)藥檢測方面得到了廣泛應(yīng)用[134,140]。由于傳感器的特殊傳感機(jī)制及構(gòu)建材料的生物親和性，使檢測具有更高靈敏度及更低的背景干擾[131,134]。檢測過程中，構(gòu)建傳感器的光敏材料會(huì)改變光電效應(yīng)，進(jìn)而影響檢測效果。研究發(fā)現(xiàn)，利用無機(jī)半導(dǎo)體材料如金屬氧化物、量子點(diǎn)等進(jìn)行修飾，并結(jié)合生物識(shí)別原件共同制備傳感器，在重金屬、真菌毒素[141]及農(nóng)藥檢測[142]中，可使傳感器具有較高光催化活性及穩(wěn)定性，改善因材料氧化性過高導(dǎo)致的選擇性差等問題。

電化學(xué)發(fā)光法基于化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)傳感器相結(jié)合，通過待測物質(zhì)在電致發(fā)光體系中所發(fā)生的電化學(xué)反應(yīng)，并檢測其生成產(chǎn)物的發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行檢驗(yàn)分析。在食品檢測領(lǐng)域，相較于光電化學(xué)傳感器，電化學(xué)發(fā)光法擁有更廣泛的檢測品類。在食品營養(yǎng)物質(zhì)[143-145]、食品污染物[146-148]等食品相關(guān)組分的檢測中發(fā)揮著重要作用。電化學(xué)發(fā)光技術(shù)由于發(fā)展時(shí)間較短，自身也存在如所使用的金屬電極可吸附其他物質(zhì)導(dǎo)致檢測的準(zhǔn)確性下降，以及光活性材料固定化不足等問題。近年來研究人員通過結(jié)合新型納米材料、開發(fā)組裝新方式等以解決傳感器的不足[149-150]，結(jié)果表明，功能化納米材料的表面催化活性高，在晶體中的擴(kuò)散通道短，利用修飾材料的結(jié)構(gòu)增加固定化效率的同時(shí)，可提升生物識(shí)別能力，實(shí)現(xiàn)高效的信號(hào)傳輸，使檢測效率大幅提升[150-151]。

3 結(jié)語

目前，相較于傳統(tǒng)檢測方法而言，電化學(xué)檢測方法由于操作簡單、分析速度快、較為經(jīng)濟(jì)環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)在食品相關(guān)成分檢測方面越來越受到關(guān)注。但由于食品成分的復(fù)雜性、所含外源物質(zhì)的未知性以及檢測設(shè)備的材質(zhì)適用性等，電化學(xué)技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用仍存在以下問題：一是由于食品中所含組分復(fù)雜，對待測組分的電化學(xué)反應(yīng)造成干擾。特別是有的組分具有與待測物相似的氧化還原性能，會(huì)直接產(chǎn)生與待測物重疊的信號(hào)；二是現(xiàn)今的電化學(xué)檢測方法多是針對單一物質(zhì)的檢測，對多組分同時(shí)檢測研究相對較少；三是電極反應(yīng)對環(huán)境條件敏感，電極表面易受檢測液中雜質(zhì)的污染，以及其他一些不確定因素的干擾，這使得要保證檢測信號(hào)的重現(xiàn)性，對測試操作的要求很高；四是對于電化學(xué)傳感器的構(gòu)建，仍需尋找低成本、環(huán)境友好且能有效提高靈敏度的修飾材料，以及開發(fā)傳感器活性組分的新型固定化、提高活性的新技術(shù)。

鑒于上述多種因素，電化學(xué)檢測技術(shù)迄今仍多數(shù)局限于實(shí)驗(yàn)室研究，能夠商品化應(yīng)用的實(shí)例尚少。采取以下措施可以促進(jìn)電化學(xué)檢測技術(shù)走向?qū)嶋H應(yīng)用：1）對食品進(jìn)行復(fù)雜和高效的預(yù)處理，減少多組分間的干擾；2）將色譜分離方法與電化學(xué)檢測技術(shù)相結(jié)合；3）開發(fā)一次性使用的檢測電極。此外，電化學(xué)檢測設(shè)備和方式的系統(tǒng)化、便攜化、智能化，也是一個(gè)重要的發(fā)展方向。