釀酒酵母耐受機(jī)制研究進(jìn)展

張 樂，崔金娜，劉 偉，朱明達(dá)，劉占英,*

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)發(fā)酵產(chǎn)業(yè)節(jié)能減排工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051；2.生物發(fā)酵綠色制造內(nèi)蒙古自治區(qū)工程研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051；3.內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種芽殖酵母，也是人類了解最早、應(yīng)用最廣泛的一種酵母[1]，一般呈圓形、卵形或橢圓形，寬度為2.5～10 μm，長度為4.5～21 μm，細(xì)胞無真菌絲，通過重復(fù)出芽繁殖，有些細(xì)胞發(fā)育為子囊，是含1～4 個(gè)子囊孢子的子囊菌。釀酒酵母具有發(fā)酵能力強(qiáng)、生長周期短及易大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是重要的工業(yè)生產(chǎn)菌種。釀酒酵母在飲料和食品工業(yè)中被廣泛應(yīng)用，具有重要的商業(yè)意義。在飲料行業(yè)，釀酒酵母參與許多發(fā)酵飲料的生產(chǎn)，如葡萄酒、啤酒和蘋果酒等，酵母菌將糖分解產(chǎn)生乙醇和二氧化碳，賦予了這些產(chǎn)品特有的口味和醇性，其也被用來發(fā)酵果汁、茶等，提高了產(chǎn)品的營養(yǎng)和風(fēng)味，而且，釀酒酵母菌體富含高濃度蛋白質(zhì)和活性小肽，甘露糖和β-葡聚糖等活性多糖，以及維生素和礦物質(zhì)多種營養(yǎng)功能成分，在酸奶和面包的發(fā)酵中也發(fā)揮了關(guān)鍵作用[2]。此外，釀酒酵母作為最常用的真核基因工程表達(dá)系統(tǒng)和受體細(xì)胞，是基因工程藥物、酶制劑和化學(xué)品生產(chǎn)的主要菌種[3]，但在工業(yè)生產(chǎn)過程中，釀酒酵母會(huì)受到多種物理、化學(xué)和生物脅迫因素的影響，導(dǎo)致生產(chǎn)效率下降。這些脅迫主要包括啤酒、葡萄酒和白酒工業(yè)生產(chǎn)所帶來的滲透壓、乙醇毒性和氧化應(yīng)激，檸檬酸和乳酸工業(yè)生產(chǎn)中所帶來的有機(jī)酸毒性，食醋釀造生產(chǎn)中高溫糖化所帶來的溫度沖擊，以及發(fā)酵飼料工業(yè)生產(chǎn)中由微生物污染引起的生物脅迫[4]。作為重要的工業(yè)菌株和模式生物，釀酒酵母對環(huán)境脅迫的耐受機(jī)制以及如何提高其環(huán)境脅迫的耐受性一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)。近年來，許多研究專注于探究釀酒酵母耐受機(jī)制與相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并利用基因工程等技術(shù)開發(fā)出了耐受性更強(qiáng)的釀酒酵母工業(yè)菌株，為釀酒酵母在惡劣工業(yè)條件下的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本文就釀酒酵母六大主要耐受機(jī)制（滲透壓、乙醇、高溫、有機(jī)酸、氧化、SO2）進(jìn)行綜述，以期為提高其在生產(chǎn)中對環(huán)境脅迫的耐受性提供參考。

1 釀酒酵母滲透壓耐受性

濃醪發(fā)酵技術(shù)被廣泛應(yīng)用于我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品如豆腐乳的生產(chǎn)中，也適用于淀粉原料的深度發(fā)酵和乙醇生產(chǎn)，這種發(fā)酵方式不僅能提高生產(chǎn)能力，增加發(fā)酵強(qiáng)度，還可以提高設(shè)備利用率、減少能源消耗、勞動(dòng)力成本和工業(yè)廢水排放[5]，利用此技術(shù)生產(chǎn)的食品具有醇香型的風(fēng)味和較長的貨架期。然而，在發(fā)酵初始階段，高糖或高鹽對酵母細(xì)胞產(chǎn)生不可避免的滲透脅迫，該脅迫會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞縮水，抑制細(xì)胞活性，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)酵效率降低[6]。對于此種脅迫，釀酒酵母主要通過高滲透性甘油促分裂原活化蛋白激酶（high osmolarity glycerol mitogenactivated protein kinase，HOG-MAPK）途徑和離子泵等方式應(yīng)對[7]。闡明釀酒酵母耐高滲機(jī)制有利于利用現(xiàn)代微生物技術(shù)對釀酒酵母進(jìn)行選育，以獲得工業(yè)生產(chǎn)所需的高性能菌株。

1.1 HOG-MAPK途徑

發(fā)生高滲脅迫時(shí)，酵母細(xì)胞會(huì)在幾秒鐘內(nèi)收縮，在不到1 min的時(shí)間內(nèi)，甘油出口通道蛋白Fps1迅速關(guān)閉以防止甘油泄漏，從而使這種兼容滲透物質(zhì)得以積累[8]。為了恢復(fù)滲透平衡，HOG-MAPK途徑被激活，Hog1蛋白激酶的磷酸化反應(yīng)首先導(dǎo)致離子的釋放刺激[9]，阻斷細(xì)胞周期并降低翻譯能力[10]，此外，它還刺激了糖酵解以增加滲透壓產(chǎn)生甘油[11]，并通過快速調(diào)節(jié)通道蛋白Fsp1微調(diào)甘油含量[12]。酵母細(xì)胞的高滲脅迫適應(yīng)性依賴于甘油積累，一旦細(xì)胞內(nèi)甘油水平達(dá)到其最大值的三分之一左右，Hog1蛋白激酶就會(huì)去磷酸化，減弱基因表達(dá)反應(yīng)。在滲透性休克發(fā)生后，立即觀察到的甘油積累主要是由于刺激代謝通路并阻止甘油的外流，同時(shí)酵母細(xì)胞通過調(diào)控甘油通道蛋白的基因微調(diào)其甘油含量。

HOG-MAPK途徑上游的兩個(gè)信號(hào)感受分支分別為Sln1和Sho1，這兩個(gè)分支在不同的條件下有不同的作用與分工（圖1）。Sho1分支參與了很多其他的信號(hào)感應(yīng)傳導(dǎo)，比如氧化脅迫、熱脅迫等，Sln1分支則對滲透壓脅迫更敏感，其滲透壓感應(yīng)范圍更大，在一定的高滲壓和極高的鹽濃度下都能正常執(zhí)行功能。

圖1 釀酒酵母HOG-MAPK途徑信號(hào)系統(tǒng)和反應(yīng)機(jī)制Fig.1 The HOG-MAPK pathway signaling system and reaction mechanism in S.cerevisiae

Sho1 分支包括跨膜蛋白Sho1 和假定的滲透傳感器Hkr1和Msb2，它是一個(gè)MAPKKKSte11、支架MAPKK Pbs2p和Hog1組成的膜相關(guān)復(fù)合體，該分支還有其他蛋白組分（Cdc42、Ste50、Ste20和Opy2）共同參與運(yùn)轉(zhuǎn)[13]。在許多真菌中，Sho1模塊不與Pbs2連接，因此不參與滲透反應(yīng)，這表明Sho1模塊可能不具有滲透感應(yīng)的作用，而是根據(jù)細(xì)胞極性機(jī)制在激活中的作用感知與細(xì)胞形狀和/或細(xì)胞表面條件相關(guān)的信號(hào)[14]，信號(hào)特異性通過支架蛋白（Sho1、Opy2、Pbs2）和Hog1激酶保證[15]。Sho1的大小變化比一級(jí)序列小得多，表明其具有結(jié)構(gòu)而非酶功能。

Sln1分支由多個(gè)功能蛋白組成，其中處于最前端的滲透傳感器組氨酸激酶Sln1，是一個(gè)非常關(guān)鍵的感應(yīng)蛋白，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。Sln1分支還包括磷轉(zhuǎn)移蛋白Ypd1和響應(yīng)調(diào)節(jié)因子Ssk1，兩者共同組成一個(gè)雙組分磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。在釀酒酵母中，滲透傳感器組氨酸激酶Sln1通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)下游MAPK級(jí)聯(lián)，當(dāng)Sln1失活時(shí)，Hog1被過度激活，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[16]。以上研究表明，在高滲環(huán)境條件，Sln1組氨酸激酶在二聚體內(nèi)交叉磷酸化，磷酸基團(tuán)通過Sln1受體和應(yīng)答調(diào)節(jié)域以及Ypd1磷酸轉(zhuǎn)移蛋白轉(zhuǎn)移到Ssk1應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白，高滲休克導(dǎo)致Sln1激酶失去活性和Ssk1去磷酸化，突變分析支持了上述研究假設(shè)，涉及磷脂酶系統(tǒng)的所有步驟。而未磷酸化的Ssk1介導(dǎo)冗余MAPKKKs Ssk2和Ssk22的激活，后者反過來激活Pbs2。這兩個(gè)信號(hào)分支協(xié)同作用，使得酵母細(xì)胞能夠?qū)B透壓變化做出快速而靈活的反應(yīng)。

1.2 離子穩(wěn)態(tài)機(jī)制

在酵母細(xì)胞中，不同轉(zhuǎn)運(yùn)體存在于細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞器表面上，通過不同的機(jī)制介導(dǎo)離子流動(dòng)。質(zhì)膜上已知的6 個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體包括鉀離子吸收系統(tǒng)Trk1p和Trk2p、鉀離子通道蛋白Tok1p、鈣離子通道蛋白Cch1p-Mid1p、Ena1p和Na+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體Nha1p。細(xì)胞器表面的轉(zhuǎn)運(yùn)體包括液泡上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Vcx1p、Pmc1p、Nhx1p，鈣離子通道蛋白Yvc1p，細(xì)胞核上的Crz1p和高爾基體上的Kha1p。由圖2可知，釀酒酵母中K+和Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)是由ATP驅(qū)動(dòng)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)和H+反轉(zhuǎn)運(yùn)介導(dǎo)的。通常酵母細(xì)胞輸出Na+并積累K+。Ena1p是一種Na+輸出通道蛋白，屬于自磷酸化離子和脂質(zhì)泵的P型ATP酶家族。Ena1的轉(zhuǎn)錄是通過鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶依賴的機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，并在細(xì)胞外高濃度的Na+和Li+條件下誘導(dǎo)[17]。Nhx1p是一種Na+/K+交換劑，通過在液泡中隔離Na+，降低胞質(zhì)Na+濃度，從而適應(yīng)高鹽介質(zhì)[18]。

圖2 釀酒酵母的離子穩(wěn)態(tài)機(jī)制Fig.2 Ion homeostasis mechanism of S.cerevisiae

胞質(zhì)鈣應(yīng)對離子應(yīng)激的反應(yīng)會(huì)短暫增加，達(dá)到更高的穩(wěn)態(tài)濃度。Yvc1p在胞質(zhì)溶膠中釋放空泡Ca2+，Cch1p-Mid1p介導(dǎo)細(xì)胞外環(huán)境中的Ca2+內(nèi)流，以維持胞質(zhì)Ca2+濃度。同時(shí)，作為液泡Na+/H+交換劑的Nhx1p將Na+隔離在液泡中[19]。Pmr1p有助于恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體分泌Ca2+。液泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pmc1p和Vcx1p響應(yīng)細(xì)胞外高離子濃度，將Ca2+導(dǎo)入液泡。然而，作為對細(xì)胞外高濃度Ca2+的反應(yīng)，Vcx1p活性以及可能的vcx1表達(dá)，以未知的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶依賴性方式下調(diào)[20]。當(dāng)胞質(zhì)溶膠中Na+/Li+過量時(shí)，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶還上調(diào)Ena1p（有助于Na+外排和K+內(nèi)流）和另一個(gè)Na+外流泵Nha1p的表達(dá)[21]。酵母中的K+通道是向外整流的Trk1p/Trk2p和Tok1p通道，其優(yōu)先導(dǎo)致K+流出。有研究表明，在Na+脅迫期間，Tok1p蛋白可能被Hog1p蛋白抑制，這導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化和Na+流入減少[22]（圖2）。

2 釀酒酵母乙醇耐受性

釀酒酵母在乙醇生產(chǎn)方面具有卓越的潛力，是釀造酒精飲料（如葡萄酒、啤酒和清酒）的優(yōu)勢發(fā)酵菌種[23]。與其他微生物相比，釀酒酵母具有更高的乙醇產(chǎn)量和耐受性，但發(fā)酵液中高濃度的乙醇是影響細(xì)胞生長和活力、抑制某些關(guān)鍵酶活性、干擾各種細(xì)胞代謝以及導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)量和乙醇產(chǎn)量下降的主要因素[24]。

目前已選育出可以耐受更高濃度乙醇的釀酒酵母菌株，其發(fā)酵極限可以達(dá)到20%（體積分?jǐn)?shù)，下同）以上的乙醇體積分?jǐn)?shù)，這些高產(chǎn)乙醇酵母菌株通過代謝途徑的改造和其他抗乙醇毒性機(jī)制的提高實(shí)現(xiàn)了較高的耐乙醇性。乙醇體積分?jǐn)?shù)超過20%會(huì)影響細(xì)胞膜完整性，降低質(zhì)膜流動(dòng)性和小分子離子的滲透性，導(dǎo)致跨膜電位耗散，并使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和液泡酸化。同時(shí)，在高濃度下，乙醇也會(huì)擾亂蛋白質(zhì)構(gòu)象，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和功能障礙，例如糖酵解途徑中的丙酮酸激酶和己糖激酶受高濃度乙醇影響，活性會(huì)顯著降低。高濃度乙醇還會(huì)影響細(xì)胞對葡萄糖、麥芽糖、銨和氨基酸的攝取，從而導(dǎo)致核苷酸、氨基酸和鉀的細(xì)胞滲漏。提高釀酒酵母的乙醇耐受性可以保證酵母菌在乙醇體積分?jǐn)?shù)超過20%的發(fā)酵醪液中具有較好的細(xì)胞活性和較高的發(fā)酵性能，因此酵母菌的乙醇耐受性成為世界范圍內(nèi)的研究熱點(diǎn)。乙醇對釀酒酵母細(xì)胞的影響主要體現(xiàn)在細(xì)胞膜損傷、蛋白質(zhì)變性、代謝紊亂和DNA破壞幾個(gè)方面，而酵母菌通過增加中性脂和甾醇穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)、表達(dá)熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）修復(fù)細(xì)胞損傷、激活抗氧化酶和DNA修復(fù)系統(tǒng)減輕氧化應(yīng)激、上調(diào)乙醇脫氫酶加速乙醇代謝以及調(diào)控細(xì)胞內(nèi)酸堿平衡等機(jī)制應(yīng)對乙醇脅迫，最終恢復(fù)正常的生長與發(fā)酵功能（圖3），這些機(jī)制的協(xié)同作用賦予了釀酒酵母較強(qiáng)的耐乙醇能力。目前，通過基因工程等手段對酵母菌乙醇耐受性的生物化學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步的研究，已鑒定出數(shù)百個(gè)與乙醇耐受相關(guān)的基因，涉及廣泛的功能類別，包括蛋白質(zhì)生物合成、氨基酸代謝、核苷酸代謝、脂質(zhì)代謝、脂肪酸和麥角甾醇代謝、膜和細(xì)胞壁組織合成、脯氨酸生物合成，以及色氨酸生物合成等過程。對乙醇耐受機(jī)制的全面解析可以為構(gòu)建人工設(shè)計(jì)高乙醇耐受性酵母菌株提供理論基礎(chǔ)，以下主要基于綜合基因表達(dá)分析、基因表達(dá)途徑和綜合抗性以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的乙醇耐受機(jī)制進(jìn)行闡述。

圖3 釀酒酵母的乙醇耐受機(jī)制Fig.3 Ethanol tolerance mechanism of S.cerevisiae

2.1 細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)膜基因

釀酒酵母中乙醇耐受相關(guān)的膜和細(xì)胞壁基因較多，Auesukaree等[25]通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)與膜成分相關(guān)基因etr1、oar1、sur4、fen1和htd2等參與飽和脂肪酸的代謝，lip5、pdx3、ldb19和opi3等參與脂質(zhì)和磷脂代謝，這些基因在乙醇脅迫下上調(diào)，此外，分別編碼細(xì)胞壁完整性（cell wall integrity，CWI）途徑的MAPKKK和MAPK的bck1和slt2基因?qū)σ掖寄褪苄灾陵P(guān)重要，因此CWI途徑參與對乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)[26]。在乙醇脅迫后，CWI途徑誘導(dǎo)特定細(xì)胞壁重塑基因表達(dá)，包括fks2、crh1和pir3（分別編碼β-1,3-葡聚糖合酶、幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)糖基化酶和O-糖基化細(xì)胞壁蛋白），最終導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的重塑。研究表明，smi1基因調(diào)控細(xì)胞壁的合成，hoc1、ldb7和vma9基因參與甘露糖蛋白生物合成，wsc3、slg1和slt2基因編碼激活蛋白激酶C1-MAPK途徑的傳感器，在乙醇脅迫期間，CWI和HOG途徑協(xié)同調(diào)節(jié)特定細(xì)胞壁生物合成基因的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁的適應(yīng)性變化。Fujita等[27]通過已知的遺傳相互作用對已鑒定的乙醇抗性決定因素編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚類，突出了液泡蛋白分選機(jī)制、液泡H+-ATPase復(fù)合物和過氧化物酶體蛋白質(zhì)導(dǎo)入機(jī)制的重要性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)編碼質(zhì)膜水甘油通道蛋白的fps1基因在乙醇應(yīng)激抵抗力中的特殊作用，fps1表達(dá)的增加也證實(shí)了該基因在酵母體內(nèi)發(fā)揮重要作用，最終導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量增加。You等[28]發(fā)現(xiàn)在乙醇脅迫下多不飽和脂肪酸在細(xì)胞中被轉(zhuǎn)化為單不飽和脂肪酸。Stukey等[29]發(fā)現(xiàn)在乙醇脅迫下，棕櫚油酸和油酸都是由ole1編碼的脂肪酸去飽和酶分別通過棕櫚酸和硬脂酸的氧和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性去飽和形成，單不飽和脂肪酸、棕櫚油酸和油酸是釀酒酵母質(zhì)膜的關(guān)鍵組成成分，由此可以看出，釀酒酵母通過增加質(zhì)膜流動(dòng)性消除乙醇脅迫帶來的危害。麥角甾醇是影響細(xì)胞質(zhì)膜流動(dòng)性的另一關(guān)鍵組分，Teixeira等[30]通過基因缺失突變研究發(fā)現(xiàn)在乙醇脅迫過程中，麥角甾醇含量增加，erg2、erg3、erg5、erg6、erg24和erg28等參與麥角甾醇合成的基因全部上調(diào)。雖然在乙醇脅迫下，細(xì)胞壁和質(zhì)膜的相關(guān)基因已被解析，但其抵御乙醇脅迫的具體機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步研究闡明由細(xì)胞壁和質(zhì)膜介導(dǎo)的乙醇耐受精確機(jī)制。

2.2 氨基酸的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)

在酵母細(xì)胞中，脯氨酸和色氨酸具有增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及在蛋白質(zhì)折疊過程中抑制蛋白質(zhì)聚集的功能，可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍、干燥和乙醇的傷害。Sekine等[31]發(fā)現(xiàn)編碼釀酒酵母γ-谷氨酰蛋白激酶的基因pro1的點(diǎn)突變（D154N）導(dǎo)致細(xì)胞對脯氨酸的反饋抑制減弱，脯氨酸過量積累，同時(shí)這種酵母突變體的乙醇耐性提高，表明胞內(nèi)較高的脯氨酸含量對提高酵母細(xì)胞乙醇耐受性起到了一定的作用。通過易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)得到了pro1的突變體文庫，得到了更多因pro1基因突變而導(dǎo)致對脯氨酸反饋抑制不敏感的突變體，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，敲除put1基因（與脯氨酸的分解利用有關(guān)），并替換野生型的pro1為突變型的pro1，所得到的突變體細(xì)胞內(nèi)脯氨酸含量比對照組高5 倍，同時(shí)乙醇耐性得到提高。Hirasawa等[32]的微陣列分析結(jié)果表明，在乙醇耐性高的Sake酵母中，色氨酸合成途徑相關(guān)的基因表達(dá)量較高，進(jìn)一步研究表明，色氨酸合成酶基因（trp2和trp5）和色氨酸透性酶基因（tat2）的過量表達(dá)可以賦予酵母細(xì)胞良好的乙醇耐性，向含有5%乙醇的培養(yǎng)基添加100 μg/mL色氨酸后，細(xì)胞的生長速率明顯提高，這說明色氨酸的添加是賦予酵母細(xì)胞乙醇耐性的有效途徑。

2.3 HSP及海藻糖的累積

Ogawa等[33]研究發(fā)現(xiàn)在乙醇脅迫下誘導(dǎo)的編碼HSP的基因表現(xiàn)出與熱應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因的廣泛重疊，這些誘導(dǎo)基因的表達(dá)由典型的上調(diào)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)表現(xiàn)出來。目前確定的顯著上調(diào)的HSP基因至少包括10 個(gè)：hsp12、hsp26、hsp30、hsp31、hsp32、hsp42、hsp78、hsp82、hsp104和hsp150。海藻糖的積累還可以更好地幫助釀酒酵母抵抗乙醇的脅迫。Chandler等[34]發(fā)現(xiàn)在乙醇脅迫下，參與海藻糖合成的基因tps1、tps2、tsl1、pgm2和ugp1都顯著上調(diào)。

3 釀酒酵母高溫耐受性

在白酒生產(chǎn)中，淀粉原料首先需要在65～95 ℃條件下糊化和液化，然后進(jìn)行酵母發(fā)酵和蒸餾，發(fā)酵溫度保持在28～35 ℃。這屬于典型的高溫糖化發(fā)酵過程，可以使原料中的淀粉充分轉(zhuǎn)化為葡萄糖，從而提高原料利用率。耐熱釀酒酵母在40 ℃進(jìn)行發(fā)酵，不但能降低冷卻成本，而且能減少能耗和二氧化碳排放量，促進(jìn)催化過程，防止污染[35]。

高溫（45～55 ℃）條件下線粒體功能的紊亂會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，進(jìn)而導(dǎo)致酵母細(xì)胞死亡和自溶，同時(shí)，高溫自溶還會(huì)破壞生物活性化合物，如β-葡聚糖和多肽，從而影響酵母自溶物的抗氧化活性，因此，比較和分析耐熱性酵母和傳統(tǒng)酵母在酶、核酸、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能以及生物合成系統(tǒng)方面的差異是早期酵母耐熱機(jī)制的研究重點(diǎn)。自從在原核生物和真核生物中發(fā)現(xiàn)熱休克現(xiàn)象以來，HSP和熱休克反應(yīng)（heat shock response，HSR）成為研究的熱點(diǎn)。HSR可加速活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，包括超氧陰離子自由基、過氧化氫和高活性羥自由基，從而導(dǎo)致氧化損傷，釀酒酵母則會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的抗氧化劑對抗熱誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[36]。最新研究表明，有幾種影響因子參與調(diào)控釀酒酵母耐熱性，包括HSP、海藻糖、ATP酶、泛素和抗氧化酶等[37]。

熱脅迫主要分為長期熱脅迫和短時(shí)熱脅迫，在長期熱脅迫中，HSP是大部分生物用來抵抗高溫的最有效手段，可以保護(hù)熱損傷蛋白不聚集，使受損蛋白重新折疊，清除不可逆聚集蛋白，提高應(yīng)激細(xì)胞中可溶性蛋白和質(zhì)子泵的熱穩(wěn)定性。而在短時(shí)熱脅迫中，主要由熱激轉(zhuǎn)錄因子（heat shock transcriptionfactor，HSF）調(diào)控。如圖4所示，在正常生理狀態(tài)下，HSF保持單體或二聚體狀態(tài)，酸性激活結(jié)構(gòu)隱藏，沒有活性，熱激后，無活性的HSF單體或二聚體之間結(jié)合形成多聚體，構(gòu)象發(fā)生改變，原來隱蔽的活性結(jié)構(gòu)域被釋放出來，與熱激元件（heat shock element，HSE）靶基因啟動(dòng)子上長度為5 bp的順式作用元件結(jié)合，其保守序列為nGAAn[38]，最后在其他因素（如轉(zhuǎn)錄酶、ATP等）的輔助下，轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因，進(jìn)而翻譯成HSP，這種現(xiàn)象被描述為HSR[39]。

圖4 釀酒酵母的短時(shí)熱應(yīng)激機(jī)理Fig.4 Short-term heat stress mechanism of S.cerevisiae

4 釀酒酵母有機(jī)酸耐受性

木質(zhì)纖維素是自然界中最豐富的可再生資源之一，其水解產(chǎn)物可用于釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，能有效緩解緊迫的能源危機(jī)和化石燃料燃燒帶來的環(huán)境污染問題[40]。木質(zhì)纖維素在水解過程中會(huì)產(chǎn)生抑制物，從而導(dǎo)致發(fā)酵效率降低[41]，這些抑制物主要為有機(jī)酸、糠醛、5-羥甲基糠醛等[42]，其中，有機(jī)酸如檸檬酸、蘋果酸、乳酸和乙酸會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)酸堿平衡，影響細(xì)胞壁和質(zhì)膜的功能，從而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和程序性細(xì)胞死亡，對發(fā)酵菌株具有很高的毒性[43]。因此，闡明釀酒酵母耐酸機(jī)理，利用基因工程等技術(shù)獲得耐酸菌株，對高效木質(zhì)纖維素生物資源的煉制具有重要意義。

在低pH值條件下（＜4.76），有機(jī)酸處于未解離（質(zhì)子化）狀態(tài)，可以通過Fps1p通道蛋白或簡單擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞[44]，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，酸就會(huì)分解成酸根陰離子和質(zhì)子，如圖5所示，當(dāng)葡萄糖不存在時(shí)，酸根離子通過Jen1p或Ady2p通道蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在通過過氧化物體或胞質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，之后進(jìn)入到三羧酸循環(huán)；當(dāng)葡萄糖存在時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中酸的游離以及酸誘導(dǎo)的細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致H+內(nèi)流速率增加，細(xì)胞內(nèi)酸化，從而導(dǎo)致DNA和RNA合成速率降低，代謝活性受到抑制，并破壞維持在細(xì)胞膜上的質(zhì)子梯度，最終導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)酸化并抑制一些重要的代謝過程[45]。為了避免質(zhì)膜電位的耗散并且維持內(nèi)部pH值在正常生理值內(nèi)，酵母細(xì)胞依賴于刺激質(zhì)膜P型H+-ATPase的活性，ATP水解并泵出質(zhì)子。對辛酸、山梨酸、十二酸、乙酸、甲酸和琥珀酸的反應(yīng)可以提高質(zhì)膜P型H+-ATPase活性，這可能是為了抵消親脂性酸引起的細(xì)胞內(nèi)酸化和質(zhì)膜電位耗散[46]。同時(shí)，存在于液泡膜上的V型H+-ATPase通將質(zhì)子隔離到液泡腔內(nèi)，有助于恢復(fù)胞質(zhì)pH值，并抵消酸誘導(dǎo)的跨膜電位在液泡膜上的耗散。Geng Peng等[47]通過蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在酸性除草劑2,4-D脅迫下，細(xì)胞內(nèi)氨基酸的液泡區(qū)隔化依賴于功能性V型H+-ATPase，研究表明在弱酸脅迫下，該質(zhì)子泵有可能起到代謝產(chǎn)物的區(qū)隔化作用。

圖5 釀酒酵母的耐酸機(jī)制Fig.5 Acid tolerance mechanism of S.cerevisiae

5 釀酒酵母抗氧化應(yīng)激

氧是一種高活性分子，可以形成許多活性自由基，因此又被稱為ROS，其在細(xì)胞中由呼吸作用、類固醇生長和長鏈脂肪酸的β-氧化等代謝過程產(chǎn)生[48]，此外，ROS還可由電離輻射或環(huán)境中存在的氧化還原循環(huán)化合物形成。在生物乙醇生產(chǎn)中，高濃度的糖會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS，如超氧陰離子自由基和H2O2等，這會(huì)損傷細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和DNA，抑制酵母菌的生長和乙醇發(fā)酵[49]，當(dāng)氧化劑濃度超過細(xì)胞抗氧化能力時(shí)，就會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激。釀酒酵母具有酶和非酶兩種防御系統(tǒng)保護(hù)細(xì)胞成分，維持細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，闡明釀酒酵母氧化應(yīng)激機(jī)制有利于利用基因工程改造技術(shù)提高釀酒酵母的抗氧化能力。非酶防御系統(tǒng)中最典型的物質(zhì)是L-谷胱甘肽（L-glutathione，GSH），GSH是一種自由基清除劑，其具有氧化還原活性的巰基與氧化劑反應(yīng)能生成氧化型谷胱甘肽（glutathione disulfide，GSSG）。GSH作為細(xì)胞中最豐富的氧化還原清除分子，在維持細(xì)胞氧化還原狀態(tài)中具有非常重要的作用，在釀酒酵母中已經(jīng)鑒定出與GSH生物合成相關(guān)的基因gsh1（編碼谷氨酰半胱氨酸合成酶）和gsh2（編碼GSH合成酶），并從酵母中分離出了gsh1和gsh2突變體[50]。此外，研究發(fā)現(xiàn)野生型gsh1基因是編碼線粒體蛋白（Pet5155）基因突變的質(zhì)量作用抑制劑，這表明GSH在保護(hù)細(xì)胞，尤其是保護(hù)線粒體免受呼吸作用產(chǎn)生的氧化劑的影響方面發(fā)揮著重要作用[51]。另一類具有抗氧化性質(zhì)的物質(zhì)是金屬硫蛋白，其富含半胱氨酸，并可以結(jié)合多種不同金屬離子，在釀酒酵母中已發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白由gup1基因編碼，并證明其在保護(hù)酵母細(xì)胞避免受氧化侵害方面發(fā)揮重要作用[52]。

釀酒酵母抗氧化防御還包括幾種能夠清除氧自由基及其產(chǎn)物的酶。過氧化氫酶能夠催化H2O2分解為O2和H2O，釀酒酵母中具有兩種過氧化氫酶——過氧化氫酶A和過氧化氫酶T，分別由cta1和ctt1編碼[53]。過氧化氫酶A位于過氧化物酶體中，其主要生理作用是清除脂肪酸產(chǎn)生的H2O2，過氧化氫酶T位于胞質(zhì)中，然而，ctt1基因的表達(dá)受氧化脅迫、滲透脅迫和饑餓的調(diào)控，同時(shí)缺乏cta1和ctt1的酵母菌株對H2O2在固定相高度敏感，單過氧化氫酶和雙過氧化氫酶突變體都無法對H2O2產(chǎn)生適應(yīng)性脅迫反應(yīng)[54]。因此，雖然過氧化氫酶基因僅能被H2O2中度誘導(dǎo)，但這兩種過氧化氫酶顯然對H2O2都具有防御作用。釀酒酵母還具有兩種超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），分別是位于線粒體的Mn SOD（由sod2基因編碼）和位于細(xì)胞質(zhì)的Cu/Zn SOD（由sod1基因編碼）中，Mn SOD的生理作用是保護(hù)線粒體免受呼吸過程中產(chǎn)生的超氧化物的傷害，而在對抗發(fā)酵生長過程中外源添加氧化還原循環(huán)化合物產(chǎn)生的超氧化物陰離子的毒性方面作用不大，相比之下，Cu/Zn SOD是參與從細(xì)胞質(zhì)中清除超氧陰離子自由基的主要酶，也是過氧化物酶體[55]（圖6）。

圖6 釀酒酵母的氧化應(yīng)激機(jī)理Fig.6 Oxidative stress mechanism of S.cerevisiae

6 釀酒酵母SO2耐受性

SO2具有防腐和抗氧化性能，在釀酒過程中通常作為添加劑加入抑制腐敗生物的生長，其通常以偏亞硫酸氫鉀或偏亞硫酸鈉的形式添加到發(fā)酵液中。根據(jù)溶液pH值的不同，SO2具有多種存在形式[56]，在pH＜3時(shí)，主要以SO2（pKa1.8）分子的形式存在，在葡萄酒中（3＜pH＜3.8）主要以亞硫酸氫鹽（HS，pKa6.9）的形式存在[57]，亞硫酸鹽（S）以配體缺失的游離態(tài)存在于中性至微堿性條件下（pH 6.5～8.0），這種狀態(tài)下的可與蛋白質(zhì)和核酸中的氨基、羰基、巰基等親核基團(tuán)發(fā)生親電子加成反應(yīng)，導(dǎo)致這些生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的損傷，從而引起細(xì)胞死亡。因此，闡明釀酒酵母耐硫機(jī)制有利于利用遺傳改造技術(shù)提高釀酒酵母耐硫性。

據(jù)報(bào)道，SO2通過被動(dòng)擴(kuò)散滲透微生物質(zhì)膜，進(jìn)入微生物細(xì)胞后，由于細(xì)胞內(nèi)pH值超過pKa值，SO2分子分解成H，在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)會(huì)抑制甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性，從而導(dǎo)致ATP消耗、質(zhì)膜結(jié)構(gòu)擾動(dòng)以及二硫鍵斷裂導(dǎo)致的蛋白質(zhì)、維生素或輔酶損傷[58]。釀酒酵母存在多條硫代謝途徑，包括硫酸鹽還原途徑、亞硫酸鹽氧化途徑、硒代硫代謝途徑、同分異構(gòu)酶途徑、谷胱甘肽合成途徑、甲硫氨酸合成途徑和半胱氨酸合成途徑。其中，同分異構(gòu)酶途徑將硫酸鹽還原為硫化物，通過硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸；谷胱甘肽合成途徑將硫酸鹽合成為GSH，GSH是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化劑和硫源。這些途徑相互配合，保證了細(xì)胞硫平衡和多種硫代產(chǎn)物的合成，這也與酵母菌能量代謝、氧化還原狀態(tài)和抗氧化防御等密切相關(guān)。釀酒酵母通過不同的機(jī)制應(yīng)對SO2進(jìn)入細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞損傷，García-Ríos等[59]發(fā)現(xiàn)ssu1基因編碼的質(zhì)膜可以通過泵排出，因此通過過表達(dá)ssu1基因可以提高菌株對的耐受性。

7 釀酒酵母其他耐受性

除了上面介紹的幾種脅迫應(yīng)激外，釀酒酵母還存在冷凍脅迫應(yīng)激、有毒有機(jī)溶劑脅迫應(yīng)激和微生物污染引起的生物脅迫應(yīng)激。在工業(yè)生產(chǎn)過程中，低溫和工業(yè)副產(chǎn)物等因素會(huì)使酵母產(chǎn)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的單萜類化合物、糠醛等代謝產(chǎn)物也會(huì)引起菌株脅迫反應(yīng)。研究釀酒酵母對這些脅迫因子的耐受機(jī)制非常重要，因?yàn)獒劸平湍傅男阅苤苯佑绊懙桨l(fā)酵進(jìn)程和產(chǎn)品的質(zhì)量。

Kim[60]通過篩選轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的突變文庫分離出一株耐受凍融脅迫的菌株，經(jīng)鑒定，ycp4基因發(fā)生失活，此外，該相應(yīng)基因的缺失和過度表達(dá)證實(shí)了其與凍融耐受表型有關(guān)，能通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，激活Msn2,4和Stre介導(dǎo)的基因（如ctt1和hsp12），表現(xiàn)出抗凍融能力。Mertens等[61]通過過表達(dá)yap1p基因改善了實(shí)驗(yàn)室菌株對木質(zhì)纖維素水解物或糠醛和5-羥甲基糠醛的耐受。Su Yide等[62]利用甲磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）誘變技術(shù)篩選得到對異丁醇具有較高耐受性的釀酒酵母EMS39，對EMS39菌株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母對異丁醇耐受性的提高來源于cwp2和srp4039的過表達(dá)。He Xianlin等[63]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌的存在可以提高釀酒酵母的乙醇耐受性，其機(jī)制包括促進(jìn)海藻糖、麥角甾醇、某些氨基酸、質(zhì)子泵、應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄激活劑和熱HSP的代謝，抑制細(xì)胞內(nèi)單不飽和脂肪酸的量和ROS的積累。Zhu Liying等[64]采用了一種名為RAndom插入-缺失鏈交換誘變的新型隨機(jī)誘變技術(shù)操縱釀酒酵母的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑spt3，以提高菌株對鉛的耐受性，并發(fā)現(xiàn)在某些脅迫條件下，釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)海藻糖的積累對鉛抵抗很重要。以上研究為釀酒酵母冷凍的反應(yīng)機(jī)制和改造工業(yè)菌種提供了新的啟發(fā)和思路。

8 結(jié)語

釀酒酵母作為工業(yè)生產(chǎn)中最常用的菌種，其發(fā)酵生產(chǎn)的乙醇、食品和藥品在經(jīng)濟(jì)社會(huì)中發(fā)揮著重要作用。然而，在工業(yè)生產(chǎn)過程中，釀酒酵母會(huì)受到一些環(huán)境和代謝壓力的限制，導(dǎo)致發(fā)酵能力降低，從而影響產(chǎn)品產(chǎn)率。本文重點(diǎn)從滲透壓、乙醇、高溫、有機(jī)酸、氧化和SO26 個(gè)方面闡述釀酒酵母的耐受機(jī)制，總結(jié)了與脅迫因素相關(guān)的耐受機(jī)制中的關(guān)鍵基因，從研究機(jī)制的關(guān)聯(lián)性來看，釀酒酵母對于多種環(huán)境脅迫耐受機(jī)制具有一定的內(nèi)在聯(lián)系，如海藻糖的積累與滲透脅迫、乙醇脅迫和氧化脅迫等多種脅迫因素都有關(guān)；從研究的熱點(diǎn)來看，研究釀酒酵母一種耐受機(jī)制的同時(shí)，也應(yīng)該關(guān)注其他耐受機(jī)制。通過基因工程等手段獲得高耐性菌株的同時(shí)，對細(xì)胞發(fā)酵性能的影響是多方面的，應(yīng)從不同角度分析以獲得更為深刻的認(rèn)識(shí)。

隨著現(xiàn)代微生物技術(shù)的發(fā)展，對釀酒酵母環(huán)境脅迫耐受機(jī)制的探究已開展多年，研究人員不斷發(fā)現(xiàn)與脅迫因素相關(guān)的新基因，一方面這些結(jié)果顯示出酵母細(xì)胞代謝途徑之間的相關(guān)性；另一方面也代表了不同的培養(yǎng)條件及遺傳背景下釀酒酵母環(huán)境脅迫耐受機(jī)制的多樣性。在基因組學(xué)和蛋白組學(xué)等分析方法及細(xì)胞代謝工程操作手段進(jìn)一步發(fā)展的背景下，對釀酒酵母環(huán)境脅迫耐受機(jī)制的研究將得到進(jìn)一步深入和提高，將更有效地控制酵母菌對于多種環(huán)境脅迫的耐受性，從而提高細(xì)胞的發(fā)酵能力和生物轉(zhuǎn)化效率，將釀酒酵母更好地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，提高產(chǎn)品產(chǎn)率。