解淀粉芽孢桿菌GSBa-1對(duì)佛手香櫞多酚合成和苯丙烷代謝的影響

張 敏，盧清琛,3，周新群，王立華,3，孫 靜，高海娜，劉幫迪,*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)劃設(shè)計(jì)研究院，北京 100125；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地初加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100121；3.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038；4.北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048）

佛手香櫞（Citrus medicaL.var.sarcodactylisSwingle）為蕓香科柑橘屬植物，俗稱(chēng)佛手、佛手柑，富含黃酮、酚酸、單萜、倍半萜、多糖等生物活性物質(zhì)[1]，是一種集藥用、食品加工和觀賞于一體的高價(jià)值柑橘類(lèi)果實(shí)，但該果實(shí)產(chǎn)業(yè)面臨著采收期過(guò)于集中、加工能力不能完全消化新鮮佛手導(dǎo)致衰老、腐爛、變質(zhì)和生物活性物質(zhì)損失的問(wèn)題，因此如何通過(guò)保鮮技術(shù)手段延長(zhǎng)佛手貯藏周期、有效保留果實(shí)內(nèi)部豐富的酚類(lèi)活性物質(zhì)、緩解加工壓力，是目前該產(chǎn)業(yè)亟待解決的問(wèn)題。佛手目前采用的低溫、被膜劑技術(shù)等貯藏保鮮技術(shù)，雖然可以一定程度上地延長(zhǎng)貯藏周期，但仍然不能無(wú)法有效增強(qiáng)果實(shí)的抗性物質(zhì)合成，有效減少果實(shí)表面被真菌侵染[2]。戈子龍[3]對(duì)佛手的保鮮研究指出，腐敗真菌的侵染是造成佛手損失的最主要原因，腐敗菌的生長(zhǎng)活動(dòng)會(huì)消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此如何有效抑制佛手表面微生物生長(zhǎng)是其保鮮研究的重點(diǎn)。

果實(shí)在貯藏過(guò)程中，抵御病原體入侵的防御系統(tǒng)強(qiáng)度與次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累高度相關(guān)[4]。其中，苯丙烷代謝途徑是佛手、蘋(píng)果、草莓等絕大多數(shù)果實(shí)酚類(lèi)物質(zhì)合成以及產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性的關(guān)鍵途徑[5]，其次級(jí)代謝產(chǎn)物如酚類(lèi)和類(lèi)黃酮參與果實(shí)對(duì)致病性或非致病性微生物的各種防御反應(yīng)，以降低果實(shí)發(fā)病率，延緩衰老，提高果實(shí)品質(zhì)[6]。因此，尋找出可有效提升佛手貯藏過(guò)程中抗性物質(zhì)合成的保鮮方法對(duì)抑菌防腐、延緩衰老腐爛均非常必要，但目前針對(duì)佛手的苯丙烷代謝的保鮮技術(shù)研究還十分欠缺。

生防菌（即拮抗菌）保鮮技術(shù)具有安全、環(huán)保和成本低等優(yōu)點(diǎn)，是維持果實(shí)品質(zhì)、延長(zhǎng)貯藏周期的一種有效技術(shù)手段，被認(rèn)為是最有前途的保鮮方法之一[7]。研究表明拮抗菌可作為一種環(huán)境友好型誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)果實(shí)持久抗病[8]，該技術(shù)成為了近年來(lái)保鮮領(lǐng)域最具有潛力的技術(shù)之一[9]。Chen Ou等[10]研究指出，Pichia galeiformis可上調(diào)柑橘中編碼苯丙烷代謝過(guò)程中生物合成相關(guān)的基因表達(dá)，誘導(dǎo)柑橘果皮中苯丙氨酸解氨酶、4-香豆酸輔酶A連接酶、肉桂酸-4-羥化酶、過(guò)氧化物酶、肉桂醇脫氫酶和多酚氧化酶的活性提升，增加果實(shí)抗性進(jìn)而提升柑橘的貯藏品質(zhì)。此外，Pichia guilliermondii處理還可通過(guò)激活蘋(píng)果果實(shí)采后傷口內(nèi)的活性氧和苯丙烷代謝，促進(jìn)蘋(píng)果果實(shí)的傷口愈合[11]。Zhang Yi等[12]的研究指出，Trichoderma asperellumM45a處理顯著提高了苯丙烷代謝途徑中防御基因的表達(dá)，增加了西瓜氧化物酶和過(guò)氧化物酶等抗性相關(guān)酶活性，進(jìn)而使其對(duì)枯萎鐮刀菌病的防治效果提升至40.61%。Jiang Zecheng等[13]探究Bacillus siamensis誘導(dǎo)芒果果實(shí)抗病性的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)B.siamensis可通過(guò)生物脅迫影響苯丙烷代謝等多種途徑，誘導(dǎo)酚類(lèi)抗性物質(zhì)合成，提高芒果果實(shí)抗病性，增強(qiáng)芒果對(duì)病原菌的抗病能力。解淀粉芽孢桿菌GSBa-1（Bacillus amyloliquefaciensGSBa-1）是在中國(guó)傳統(tǒng)白酒發(fā)酵酒曲分離出的具有高抗氧化活性、高產(chǎn)凝乳酶[14]和胞外多糖[15]特性的一種芽孢桿菌，在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該菌在體外條件下具有抑制霉菌等生長(zhǎng)的特性，但目前還鮮見(jiàn)有關(guān)解淀粉芽孢桿菌GSBa-1在佛手保鮮上的研究。

因此，本研究以佛手為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)浸泡處理研究解淀粉芽孢桿菌GSBa-1對(duì)佛手貯藏品質(zhì)和成熟衰老的影響，探討解淀粉芽孢桿菌GSBa-1處理對(duì)采后佛手果實(shí)苯丙烷代謝途徑的影響，以期為采后佛手果實(shí)貯藏保鮮研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

佛手（Citrus medicaL.var.sarcodactylisSwingle），采購(gòu)自浙江蘭溪市。果實(shí)從采收到運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室僅經(jīng)過(guò)24 h，且全程運(yùn)輸使用冷鏈運(yùn)輸。果實(shí)運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室后，靜置12 h。選取大小均一、表面無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)病蟲(chóng)害的果實(shí)。

解淀粉芽孢桿菌GSBa-1由北京工商大學(xué)提供，菌株使用前冷凍保存[15]，開(kāi)展浸泡處理前12 h進(jìn)行活化備用。

氫氧化鈉、酚酞指示劑、濃硫酸等試劑（均為分析純）上海麥克林生化科技有限公司；PDA液體培養(yǎng)基 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；沒(méi)食子酸、咖啡酸、綠原酸、甜橙黃酮、地奧司明等酚類(lèi)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（均為分析純）美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LQ＝C5002電子天平 深圳市飛亞衡器有限公司；TGL-16gR高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；GC7890F氣相色譜儀 上海天美科學(xué)儀器有限公司；液相色譜儀（LC-20AT泵、SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器）日本島津公司；UV-2100 UNICO 紫外分光光度計(jì)上?；茖?shí)驗(yàn)器材有限公司；PAL-1糖度儀 浙江托普儀器有限公司；DW-86L388J低溫保存箱 青島海爾醫(yī)療股份有限公司；A11 basic液氮研磨機(jī) 廣州IKA公司；Nikon D800相機(jī) 日本尼康公司；RE-52旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器 中國(guó)上海生物化學(xué)儀器廠

1.3 方法

1.3.1 處理方法

解淀粉芽孢桿菌GSBa-1培養(yǎng)液制備參考Wang Xiaoruan等[16]方法。挑取活化后的解淀粉芽孢桿菌GSBa-1于裝有PDA液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在30 ℃條件下150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，制備成濃度為1×108CFU/mL的培養(yǎng)液。

解淀粉芽孢桿菌GSBa-1處理（antagonistic bacteria treatment，ABT）組：將40 個(gè)新鮮的佛手用菌液浸泡15 s后撈出瀝干至沒(méi)有滴水后，平鋪置于果蔬貯藏箱內(nèi)（相對(duì)濕度（80.0±0.5）%、貯藏溫度（25±1）℃）。

對(duì)照組（CK）：將新鮮的佛手用清水浸泡15 s后撈出風(fēng)干后置于果蔬貯藏箱內(nèi)，貯藏條件同ABT組。

分別在0、5、10、15、20 d對(duì)佛手果實(shí)后熟品質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)3 次。

1.3.2 佛手貯藏理化指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 佛手成熟生理指標(biāo)的測(cè)定

佛手成熟生理指標(biāo)包括總可溶性固形物（total soluble solids，TSS）質(zhì)量分?jǐn)?shù)、可滴定酸（titratable acid，TA）質(zhì)量分?jǐn)?shù)、乙烯釋放量和呼吸強(qiáng)度等。TSS和TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定參照Wu Shibo等[17]的方法進(jìn)行測(cè)定。

乙烯釋放量和呼吸強(qiáng)度均參照Liu Bangdi等[18]的方法進(jìn)行測(cè)定，取16 枚果實(shí)直接封閉在同一玻璃氣體收集容器中2 h。收集玻璃容器內(nèi)的1 mL頂空氣體，注入氣相色譜儀，以測(cè)定乙烯產(chǎn)量和呼吸速率。乙烯釋放量以μL/（kg·h）表示。呼吸強(qiáng)度用mg/（kg·h）表示。

1.3.2.2 佛手活性氧含量和自由基清除能力的測(cè)定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和過(guò)氧化氫（H2O2）含量均參照Liu Bangdi等[19]的方法，使用南京建成生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2.3 佛手多酚組分、總酚和總黃酮物質(zhì)含量的測(cè)定

各酚類(lèi)物質(zhì)含量、總酚含量和總黃酮含量均參照Liu Bangdi等[19]的方法進(jìn)行測(cè)定?？偡雍扛鶕?jù)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以每克干樣品中的沒(méi)食子酸質(zhì)量表示，單位為mg/g。總黃酮含量以每克干樣品中蘆丁的質(zhì)量表示，單位為mg/g。

酚類(lèi)化合物的提取及高效液相色譜分析：取10 g新鮮佛手用液氮均質(zhì)，與20 mL 70%乙醇溶液混合，在30 ℃超聲輔助處理0.5 h，12000×g離心10 min，收集上清液，用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器30 ℃濃縮。采用島津液相色譜儀（LC-20AT泵、SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)）和RP Venusil?ASB C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm；Agela技術(shù)有限公司，中國(guó)）。檢測(cè)條件如下：流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)5%乙酸溶液，流動(dòng)相B：V（甲醇）∶V（三氟乙酸）＝1∶19；梯度洗脫程序：0～15 min，88%～85% A、12%～15% B；15～25 min，75%～65% A、25%～35% B；25～50 min，65%～45% A、35%～55% B；50～60 min，45%～35% A、55%～65% B，60～70 min，35%～30% A、65%～70% B。流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；注入體積20 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

1.3.2.4 苯丙烷代謝途徑中相關(guān)酶活力的測(cè)定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（cinnamate-4-hydroxylase，C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumaric coenzyme A ligase，4CL）活力的測(cè)定參考Xin Qi等[20]的方法，采用北京索萊寶公司生產(chǎn)的PAL、C4H和4CL試劑盒使用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。酶提取方法為：將1.0 g液氮研磨的粉末在3 mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.8，含40 g/L聚乙烯砒硌烷酮、15 mmol/Lβ-巰基乙醇、10%亞甲基和2 g/100 mL聚乙二醇）冰浴中均質(zhì)。靜置30 min，12000×g離心30 min（4 ℃）后，上清液為粗酶溶液。反應(yīng)體系：0.2 mL粗酶溶液、0.8 mL反應(yīng)溶液（含10 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷和5 mmol/L反式肉桂酸），37 ℃水浴30 min，加入0.1 mL 1 mol/L鹽酸溶液終止反應(yīng)（如果存在沉淀，10000×g、4 ℃離心10 min后取上清液），在400 nm處測(cè)定吸光度，以0.2 mL磷酸鹽緩沖液和0.8 mL反應(yīng)溶液作為對(duì)照。酶活力單位為U/g，結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以上實(shí)驗(yàn)均做3 次重復(fù)，采用Microsoft Excel 2019軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差并繪圖，用SPSS 26.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析和相關(guān)性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌GSba-1處理處理對(duì)佛手成熟生理品質(zhì)的影響

隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，佛手表皮由綠色逐步轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色（圖1），ABT處理可以明顯地延緩佛手表面轉(zhuǎn)黃的進(jìn)程，貯藏第20天時(shí)CK組佛手外皮基本全部轉(zhuǎn)黃，而ABT處理佛手的轉(zhuǎn)黃率仍不足50%。這可能是因?yàn)榻獾矸垩挎邨U菌GSba-1可抑制佛手果皮葉綠素的降解及類(lèi)胡蘿卜素的合成。CK組佛手在自然后熟過(guò)程中在第15天出現(xiàn)TSS含量高峰，解淀粉芽孢桿菌GSba-1將高峰提前至第5天（圖2A），這可能由于解淀粉芽孢桿菌GSba-1對(duì)佛手產(chǎn)生了生物脅迫效應(yīng)，有效刺激了糖代謝，從而更好地為苯丙烷代謝合成酚類(lèi)物質(zhì)提供碳骨架[21]。貯藏第5～10天時(shí)，ABT組的TA出現(xiàn)明顯下降（圖2B）。雖然ABT處理能夠刺激佛手的糖合成與酸降解，但卻明顯降低了佛手乙烯釋放量和呼吸強(qiáng)度（圖2C、D）。

圖1 解淀粉樣芽孢桿菌GSBa-1處理對(duì)佛手外觀的影響Fig.1 Effect of B.amyllyticus GSBa-1 treatment on the appearance of C.medica L.var.sarcodactylis Swingle

圖2 解淀粉芽孢桿菌GSBa-1處理對(duì)佛手TSS含量（A）、TA含量（B）、乙烯釋放量（C）和呼吸強(qiáng)度（D）的影響Fig.2 Effect of B.amyloliquefaciens GSBa-1 treatment on TSS content (A),TA content (B),ethylene release (C) and respiratory intensity (D) of C.medica L.var.sarcodactylis Swingle

2.2 解淀粉芽孢桿菌GSba-1處理對(duì)佛手活性氧的產(chǎn)生與清除的影響

DPPH自由基清除率能力可反映果蔬的抗氧化能力[22]，植物細(xì)胞中的H2O2是活性氧代謝的重要中間產(chǎn)物，它既可以作為信號(hào)物質(zhì)提升抗氧化系統(tǒng)活性，也可能成為損傷植物體的有害物質(zhì)[23]。如圖3所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，佛手的DPPH自由基清除能力和H2O2含量均呈上升趨勢(shì)，且解淀粉芽孢桿菌GSba-1處理在第5天開(kāi)始就可以顯著地提升佛手的DPPH自由基清除能力和H2O2含量，說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌GSba-1處理能夠通過(guò)激活佛手活性氧快速產(chǎn)生和清除促進(jìn)其抗氧化能力，從而提升佛手自身抗性，有助于延緩衰老和抵御外源微生物侵染。

圖3 解淀粉芽孢桿菌GSBa-1處理對(duì)佛手DPPH自由基清除能力（A）和H2O2含量（B）的影響Fig.3 Effect of B.amyloliquefaciens GSBa-1 treatment on DPPH radical scavenging capacity (A) and H2O2 content (B) of C.medica L.var.sarcodactylis Swingle

2.3 解淀粉芽孢桿菌GSba-1處理對(duì)佛手多酚組分、總酚和總類(lèi)黃酮物質(zhì)含量的影響

酚類(lèi)物質(zhì)是衡量佛手抗性和生物活性的重要指標(biāo)。佛手作為一種典型的藥用作物，其采后貯藏過(guò)程中生物活性物質(zhì)的合成和累積十分明顯。在貯藏過(guò)程中，佛手的總酚（圖4A）和總黃酮（圖4B）含量呈上升趨勢(shì)。在貯藏第15天和第20天，ABT組佛手總酚含量顯著高于CK（P＜0.05），分別比CK高18.1%、15.1%。在貯藏10、15 d和20 d，ABT組佛手總黃酮含量均顯著高于CK（P＜0.05），分別比CK高6.7%、7.5%和6.1%。這說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌GSba-1處理可以提升佛手苯丙烷代謝產(chǎn)物合成與累積。

圖4 解淀粉芽孢桿菌GSBa-1處理對(duì)佛手總酚（A）、總黃酮（B）、沒(méi)食子酸（C）、咖啡酸（D）、橙皮苷（E）、圣草次苷（F）、地奧司明（G）和甜橙黃酮（H）含量的影響Fig.4 Effect of B.amyloliquefaciens GSBa-1 treatment on total phenol content (A),total flavone content (B),gallic acid content (C),caffeic acid content (D),hesperidin content (E),eriocitrin content (F),diosmin content (G)and sinesetin content (H) of C.medica L.var.sarcodactylis Swingle

本研究在佛手中檢測(cè)出了6 種含量較高的酚類(lèi)物質(zhì)單體，分別是：沒(méi)食子酸（圖4 C）、咖啡酸（圖4D）、橙皮苷（圖4E）、圣草次苷（圖4F）、地奧司明（圖4G）和甜橙黃酮（圖4H）。解淀粉芽孢桿菌GSba-1處理后，沒(méi)食子酸含量在貯藏期間均顯著高于CK（P＜0.05）；橙皮苷含量在貯藏10 d后顯著高于CK（P＜0.05）；地奧司明和甜橙黃酮含量在貯藏15 d后顯著高于CK（P＜0.05）；在貯藏第10天和第15天，咖啡酸含量顯著高于CK（P＜0.05），比CK分別高47.8%、33.3%；在貯藏第20天，圣草次苷含量顯著高于CK（P＜0.05），比CK高17.6%。此外，對(duì)比ABT組和CK組6 種多酚類(lèi)物質(zhì)的變化差異，發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸從處理初期就與CK組表現(xiàn)出顯著的合成累積差異，而4 種黃烷醇、黃酮類(lèi)物質(zhì)（橙皮苷、圣草次苷、地奧司明、甜橙黃酮）在10 d后才響應(yīng)解淀粉芽孢桿菌GSba-1處理的刺激，出現(xiàn)合成累積差異。說(shuō)明ABT處理可以誘導(dǎo)貯藏期間佛手酚類(lèi)物質(zhì)的積累，并且解淀粉芽孢桿菌GSba-1處理對(duì)酚酸類(lèi)和黃烷醇類(lèi)物質(zhì)合成的誘導(dǎo)效應(yīng)不一樣。

2.4 解淀粉芽孢桿菌GSba-1處理對(duì)佛手苯丙烷代謝途徑中相關(guān)酶活力的影響

PAL、C4H和4CL是苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶類(lèi)，由圖5可知，這3 個(gè)酶活力變化與酚酸、黃酮含量的趨勢(shì)一致，均隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)。在貯藏第5天和第15天，ABT組佛手PAL活力顯著高于CK（P＜0.05），在第20天時(shí)，ABT和CK組的佛手PAL活力差異極顯著（P＜0.01），ABT組比CK高15.3%（圖5A）。在貯藏前15 d，ABT和CK的佛手C4H活力無(wú)顯著差異（P＞0.05），兩處理組的數(shù)值相接近。在第20天時(shí)，ABT組佛手C4H活力才與CK顯示出顯著差異（P＜0.05），且ABT組佛手C4H活力比CK高5.9%（圖5B）。在貯藏期間，ABT處理組佛手4CL活力與CK組無(wú)顯著差異（P＞0.05）（圖5C）。從苯丙烷代謝途徑中的3 個(gè)不同環(huán)節(jié)酶可以看出，佛手在受到解淀粉芽孢桿菌GSba-1處理刺激后，并不是苯丙烷代謝途徑上的每個(gè)酶都能明顯的響應(yīng)。因此，ABT處理可能是通過(guò)誘導(dǎo)苯丙烷代謝途徑上的特定的環(huán)節(jié)從而刺激酚類(lèi)物質(zhì)的合成與累積。

圖5 解淀粉芽孢桿菌GSBa-1處理對(duì)佛手PAL（A）、C4H（B）和4CL（C）活力的影響Fig.5 Effect of B.amyloliquefaciens GSBa-1 treatment on PAL activity (A),C4H activity (B) and 4CL activity (C) of C.medica L.var.sarcodactylis Swingle

2.5 佛手貯藏過(guò)程中各生理指標(biāo)相關(guān)性分析

從表1可以看出，H2O2含量與DPPH自由基清除能力呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），說(shuō)明當(dāng)果蔬受到外界刺激產(chǎn)生大量活性氧的同時(shí)會(huì)激活果蔬的清除活性氧系統(tǒng)，避免過(guò)量活性氧造成果蔬損傷[24]。與此同時(shí)，H2O2含量與佛手的咖啡酸含量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（P＜0.05），說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌GSBa-1處理處理刺激佛手產(chǎn)生大量活性氧激活防御機(jī)制時(shí)，也激活佛手合成累積酚酸類(lèi)物質(zhì)，避免膜脂氧化損傷?？偡雍涂傸S酮含量與沒(méi)食子酸含量、甜橙黃酮含量和地奧司明含量呈顯著正相關(guān)或極顯著正相關(guān)（P＜0.05、P＜0.01）。PAL活力與沒(méi)食子酸、4CL活力呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。由此推測(cè)，ABT處理通過(guò)激發(fā)佛手果實(shí)中苯丙烷途徑中酶活性的升高，來(lái)促進(jìn)酚類(lèi)物質(zhì)的合成和積累，提高抗氧化活性，延緩果實(shí)后熟衰老。

表1 ABT處理組佛手各生理指標(biāo)變化的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis among physiological indexes of C.medica L.var.sarcodactylis Swingle

3 討論

佛手香櫞是一種典型的具有功能性應(yīng)用價(jià)值的果實(shí)，在貯藏過(guò)程中刺激次級(jí)代謝、保留其生物活性物質(zhì)是最重要的目的。探討解淀粉芽孢桿菌GSBa-1處理對(duì)佛手貯藏保鮮品質(zhì)的影響及其對(duì)苯丙烷代謝途徑的誘導(dǎo)作用具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌GSBa-1處理可以比CK更有效地加速佛手中TSS合成累積和TA含量的下降。這主要可能與果實(shí)苯丙烷代謝的碳骨架供應(yīng)有關(guān)，果實(shí)中的可溶性糖酸均是采后果蔬次級(jí)代謝的必要碳骨架來(lái)源，加速糖酸降解能為果實(shí)所有次級(jí)代謝提供更多的碳骨架來(lái)源[25]，有助于佛手苯丙烷代謝的進(jìn)行。ABT處理卻能夠有效抑制佛手在貯藏過(guò)程中的乙烯釋放和呼吸作用，推遲果實(shí)后熟的進(jìn)程，因而可以有效抑制佛手硬度下降和色澤轉(zhuǎn)變。

酚類(lèi)化合物是果實(shí)中主要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，也是佛手中的主要生物活性物質(zhì)和功能性物質(zhì)[1]。此外，酚類(lèi)物質(zhì)還在采后果蔬中平衡活性氧、延緩后熟衰老和抵御病原菌等方面起著關(guān)鍵作用[26]。芽孢桿菌GSBa-1處理在20 d的貯藏期內(nèi)顯著增加了佛手總酚、總黃酮和6 種鑒定出的酚類(lèi)物質(zhì)含量。這可能是由于外源解淀粉芽孢桿菌GSBa-1處理在佛手表面形成了一種生物脅迫的效應(yīng)，有效啟動(dòng)了以苯丙烷代謝為主的次級(jí)代謝途徑，激活了果實(shí)的防御體系。芽孢桿菌GSBa-1處理后第5天，佛手的沒(méi)食子酸和含量顯著高于CK組，但ABT組的橙皮苷、圣草次苷、地奧司明和甜橙黃酮的含量在10 d后才高于CK，說(shuō)明ABT處理在接菌初期能夠更快速啟動(dòng)苯丙烷代謝中酚酸類(lèi)物質(zhì)合成的途徑，誘導(dǎo)酚酸類(lèi)物質(zhì)的合成累積，在接菌中后可以顯著提升黃酮類(lèi)物質(zhì)的累積。這可能是因?yàn)辄S酮類(lèi)物質(zhì)作為植保素，需要植物體受一定程度外源微生物侵染后，才會(huì)通過(guò)苯丙烷代謝途徑合成，成為植物主要的抗病原化合物[27]。

果蔬在采后貯藏過(guò)程中受到環(huán)境脅迫時(shí)，如病原微生物侵染，通常會(huì)誘導(dǎo)苯丙烷代謝途徑中關(guān)鍵酶活性的提高[28]。PAL作為苯丙烷途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，它是莽草酸途徑與黃酮類(lèi)化合物等產(chǎn)物之間的橋梁，可將L-苯丙氨酸催化成反式肉桂酸，為合成抗毒素、酚酸、類(lèi)黃酮和木質(zhì)素等代謝產(chǎn)物提供前體物質(zhì)[29]。在本研究當(dāng)中，在貯藏期間，ABT組佛手PAL的活性高于CK，說(shuō)明ABT處理可以提高貯藏期間佛手PAL的活性。在Zhang Xiaoyun等[30]的研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，Pichia caribbica處理櫻桃番茄后，果實(shí)PAL活性增強(qiáng)，激活了苯丙烷代謝途徑，從而增強(qiáng)果實(shí)抗性，延長(zhǎng)貨架期。C4H可將反式肉桂酸催化成羥基肉桂酸，進(jìn)而合成香豆酸、阿魏酸、咖啡酸和芥子酸[31]。ABT組和CK組在貯藏20 d內(nèi)的C4H活力差異不大。4CL是苯丙烷代謝中各個(gè)分支途徑的紐帶，其在抗菌物質(zhì)的合成過(guò)程中有著至關(guān)重要的作用。羥基肉桂酸和反式肉桂酸在4CL的催化下合成相應(yīng)的硫酯，這些硫酯經(jīng)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化可合成木質(zhì)素、酚、類(lèi)黃酮等代謝產(chǎn)物，其可直接或間接地抵御病原菌的入侵[32]，但本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ABT處理并不能在貯藏過(guò)程中直接刺激4CL活性，這可能說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌GSBa-1處理主要刺激苯丙烷代謝的上中游階段，對(duì)下游的影響不明顯。綜上通過(guò)多酚合成和苯丙烷代謝途徑三個(gè)關(guān)鍵酶活力結(jié)果，解淀粉芽孢桿菌GSBa-1作為誘導(dǎo)因子，能夠激發(fā)佛手苯丙烷代謝途徑中PAL、C4H的活性增加，以促進(jìn)果實(shí)中酚類(lèi)物質(zhì)的合成累積。

此外，植物遇到環(huán)境脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量超氧陰離子、羥自由基、過(guò)氧化氫等活性氧提升自我防御能力，當(dāng)活性氧產(chǎn)生水平超過(guò)植物體能夠清除的水平時(shí)，會(huì)造成過(guò)量的活性氧累積，對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，破壞果實(shí)正常的抗逆功能[33]。DPPH自由基清除能力和H2O2含量均是表征果蔬活性氧產(chǎn)生與清除能力的重要指標(biāo)。ABT組佛手的H2O2含量在接菌初期就顯著高于CK，并持續(xù)保持較高水平（P＜0.05）。這說(shuō)明接菌后在佛手表皮能夠快速形成較強(qiáng)的逆境脅迫，從而激活佛手的活性氧代謝提升防御能力。從活性氧和酚類(lèi)物質(zhì)的結(jié)果可以看出，解淀粉芽孢桿菌GSBa-1激活活性氧代謝和苯丙烷代謝途徑上存在著關(guān)聯(lián)關(guān)系。當(dāng)果蔬受到外界刺激產(chǎn)生大量活性氧時(shí)，同時(shí)會(huì)激活非酶和酶清除活性氧系統(tǒng)，使果蔬體內(nèi)保持并達(dá)到活性氧產(chǎn)生與清除的平衡狀態(tài)，避免過(guò)量活性氧累積損傷[24]。因此可以推論，由于解淀粉芽孢桿菌GSBa-1處理佛手后，激活活性氧產(chǎn)生與累積，從而誘導(dǎo)佛手產(chǎn)生大量黃酮類(lèi)物質(zhì)清除果實(shí)中因受脅迫而產(chǎn)生的大量活性氧，利用酚化合物的抗氧化活性及氧化還原特性，抑制自由基損傷，從而維持佛手中活性氧代謝平衡，從而延緩佛手衰老，提高佛手貯藏品質(zhì)。

4 結(jié)論

濃度為1×108CFU/mL的解淀粉芽孢桿菌GSBa-1處理顯著降低了佛手乙烯釋放量和呼吸強(qiáng)度，抑制佛手果皮轉(zhuǎn)色和軟化，有效誘導(dǎo)了苯丙烷代謝途徑PAL和4CL活性提高，在貯藏第5天快速促進(jìn)以沒(méi)食子酸為代表的酚酸類(lèi)物質(zhì)的積累，并繼續(xù)促進(jìn)橙皮苷、圣草次苷、地奧司明等黃酮類(lèi)物質(zhì)的累積，有效提升佛手總酚和總黃酮的含量，提高果實(shí)抗性。綜上，1×108CFU/mL的解淀粉芽孢桿菌GSBa-1處理能夠通過(guò)激活佛手苯丙烷代謝途徑并延緩佛手的后熟衰老。隨著我國(guó)高值化生鮮果蔬消費(fèi)的升級(jí)，解淀粉芽孢桿菌GSBa-1作為一種天然生物防治益生菌有望能夠成為化學(xué)保鮮劑的綠色安全替代物，但其在果蔬保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用潛力還有待挖掘，以期為果蔬保鮮和冷鏈貯運(yùn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。