藥食同源物協(xié)同血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽微膠囊的制備及其降壓作用

夏 宇，李曉東,*，劉 璐，周文利，賈志斌，焦 陽，解慶剛

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司，黑龍江 哈爾濱 150100）

高血壓是一種常見的慢性疾病，是導(dǎo)致心腦血管疾病和死亡最主要的危險因素，我國目前約有2億 人患高血壓疾病，《中國高血壓預(yù)防指南》指出，高血壓早期可通過食品進行干預(yù)[1]。藥食同源物是可以藥用的一類食物，具有針對性強、安全性高的特點，并能夠有效地減少和預(yù)防卡托普利等人工合成的西藥引起的如咳嗽、味覺喪失和腎功能損害等多種副作用[2-3]。然而藥食同源物在功能性食品中的應(yīng)用存在幾點問題。首先，藥食同源物具有苦味，且研究發(fā)現(xiàn)其活性成分需要在腸道內(nèi)釋放才能發(fā)揮其功效，在胃部的酸性環(huán)境中易分解，使得藥食同源物本身的作用效果受到影響。其次，藥食同源物自身降壓效果不顯著，但通過相互配伍可顯著提高血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性[4-5]，且藥食同源物中活性成分能夠提高蛋白的功能特性[6]，因此藥食同源物與ACE抑制肽協(xié)同可進一步提高降壓活性。

針對藥食同源物存在的問題，本實驗首先研究藥食同源復(fù)合物與ACE抑制肽的復(fù)配比例，其次優(yōu)化包埋工藝制備藥食同源物協(xié)同ACE抑制肽微膠囊，通過動物實驗驗證其降壓作用及對臟器的保護情況。為降壓、穩(wěn)壓食品的開發(fā)以及我國傳統(tǒng)飲食文化中具有降壓、穩(wěn)壓作用食品的挖掘提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）（雄性）及Wistar雄性大鼠（WKY），體質(zhì)量260 g左右，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號為：SCXK（京）2020-0001。所有涉及實驗動物使用的程序均符合倫理要求。

藥食同源物（枸杞、山楂、決明子）西安國豪生物有限公司；ACE抑制肽（序列：Glp-Gly-Leu-Pro-Pro-Arg-Pro-Lys-Ile-Pro-Pro；貨號：Apep#144357-25-5；純度：98%）上海楚肽生物科技有限公司；變性淀粉、麥芽糊精 廣州成碩生化試劑有限公司；ACE（CAS號：9015-82-1；比活力≥2.0 U/mg）上海鼓臣生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶（3000 U/mg）、胃蛋白酶（3000 U/mg）、脂肪酶（50 U/mg）北京索萊寶科技有限公司；黏蛋白（貨號：M885077）上海麥克林生化科技股份公司；大鼠ACE測定試劑盒、大鼠ACE2測定試劑盒、大鼠血管緊張素1-7（angiotensin 1-7，Ang(1-7)）測定試劑盒、大鼠血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）測定試劑盒 武漢伊萊瑞特生物技術(shù)有限公司；HCl、NaCl、無水乙醇等（均為分析級）上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；免疫組化法抗體：Anti-Angiotensin Converting Enzyme 1 antibody（貨號：ab254222）、Goat Anti-Rabbit IgG Antibody（貨號：Ap132p）、ACE抗體、ACE2抗體 艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL-104精密電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BL-6000Y噴霧干燥機 上海比朗儀器制造有限公司；S3400-N掃描電子顯微鏡 日本日立公司；真空離心濃縮機 美國SP Scientific公司；Hei-VAP型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；冷凍離心機湘儀H1750R；T6新世紀紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；小動物氣體麻醉機、RBP-1型大鼠血壓計 上海玉研科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藥食同源復(fù)合物制備及其與ACE抑制肽的復(fù)配

分別稱取山楂、枸杞及決明子10.0 g凍干后冷凍研磨，經(jīng)過超微粉碎，過100 目篩，利用75%乙醇溶液浸提，料液比1∶10（g/mL），常溫下超聲（100 W、20 kHz）提取30 min，即可得到質(zhì)量濃度為0.1 g/mL藥食同源提取物，真空過濾后20 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)其中乙醇，過濾，進行冷凍干燥制備凍干粉[7]。凍干粉按枸杞∶山楂∶決明子＝4∶1∶1（質(zhì)量比，下同）制成藥食同源復(fù)合物。將藥食同源復(fù)合物與ACE抑制肽按照不同比例（ACE抑制肽∶復(fù)合物＝4∶0、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、0∶4）進行復(fù)配，根據(jù)ACE抑制率篩選復(fù)配比例。

1.3.2 ACE抑制率的測定

緩沖液的制備：稱取12.37 g的硼酸，定容至1 L；稱取19.07 g硼砂定容至1 L。取175 mL硼砂溶液和325 mL硼酸溶液混合，利用1 mol/L HCl溶液或1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.3，然后向其中加入17.532 g NaCl，定容至1 L，即可得到0.1 mol/L的緩沖液（pH 8.3，含0.3 mol/L NaCl）。

馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-His-Leu tetrahydrate，HHL）溶液的制備：取適量的HHL，以上述0.1 mol/L的緩沖液溶解，配制成5 mmol/L的HHL溶液，-20 ℃冷凍備用。

ACE粗酶溶液的制備：取0.1 U ACE粗酶，用1 mL 0.1 mol/L的緩沖液溶解，配制成0.1 U/mL的ACE粗酶溶液，-20 ℃冷凍備用。

參考王輝俊等[8]方法，按照表1順序，將振蕩后的混合液在4000 r/min離心15 min，吸取上層乙酸乙酯1 mL，放置在100 ℃的烘箱內(nèi)烘干30 min，冷卻至室溫，用3 mL的去離子水溶解，充分振蕩，利用紫外分光光度計測定其在228 nm波長條件下的吸光度，每組測定3 組平行，取平均值。ACE抑制率按式（1）計算：

式中：Aa為ACE及ACE抑制劑都存在的條件下（實驗組）的吸光度；Ab為ACE抑制劑不參與反應(yīng)條件下（對照組）的吸光度；Ac為ACE不參與反應(yīng)條件下（空白組）的吸光度。

1.3.3 藥食同源復(fù)合物協(xié)同ACE抑制肽微膠囊制備工藝的優(yōu)化

根據(jù)前期預(yù)實驗，以藥食同源復(fù)合物協(xié)同ACE抑制肽為芯材、變性淀粉與麥芽糊精為壁材，以芯壁比、進風(fēng)溫度、固含物（壁材芯材占混合液的比例）、壁材配比（變性淀粉∶麥芽糊精）為影響因素，設(shè)計4因素3水平L9（34）的正交試驗，如表2所示。以包埋率為評價指標，篩選最佳工藝，并與正交試驗中包埋率較高的3 組工藝進行進一步比較分析。

1.3.4 微膠囊包埋率測定方法的確定

1.3.4.1 微膠囊包埋率標準曲線的建立

采用紫外分光光度法[9-10]。分別配制0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 g/mL的藥食同源復(fù)合液，在200～400 nm波長處間隔0.5 nm進行紫外掃描，確定不同質(zhì)量濃度間吸光度差異較大的波長，以此波長條件下的紫外吸收對應(yīng)不同質(zhì)量濃度做標準曲線[11]。

1.3.4.2 微膠囊包埋率的測定

微膠囊表面芯材的測定。取1.000 g微膠囊置于布氏漏斗中抽濾，抽濾后，用去離子水洗滌漏斗，將兩次濾液混合并定容至10 mL，測定其吸光度，并根據(jù)標準曲線計算芯材質(zhì)量m1/g[12]。

微膠囊總含量的測定。取0.020 g微膠囊置于5 mL生理鹽水中，待其充分溶解后加入0.2 mol/L磷酸緩沖液5 mL，攪拌30 min使其充分溶解，用20 μm的濾膜過濾，測定其吸光度，并根據(jù)標準曲線計算芯材質(zhì)量m0/g。包埋率按式（2）計算：

1.3.5 微膠囊的微觀形態(tài)

在掃描電子顯微鏡樣品臺上貼雙面膠，取少量樣品粘上，吹去多余粉末，噴金，在加速電壓20 kV時觀察微觀結(jié)構(gòu)[13]。

1.3.6 微膠囊的苦味測定

利用風(fēng)味稀釋分析法[14]。將各微膠囊配成質(zhì)量濃度為5 g/mL的溶液，未經(jīng)包埋的藥食同源復(fù)合物為空白組，以去離子水∶溶液＝1∶1進行梯度稀釋，然后隨機編號進行盲評。一共20 位感官評價員（男性10 人，女性10 人）參與評分。各組微膠囊樣品分別按照5、10、20、30、40 倍進行梯度稀釋，以分辨出樣品與空白組間明顯苦味差異時的最大稀釋倍數(shù)即為滋味稀釋（taste dilution，TD）值，滿分為40，分值越高則證明苦味越重。

1.3.7 微膠囊體外釋放實驗

消化液的制備：按表3順序加入各項物質(zhì)后，利用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)胃液的pH值至1.2，利用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)腸液pH值至8.1[15-16]。

表3 胃腸消化液的制備Table 3 Preparation of simulated gastrointestinal fluids

胃消化：向60 mL胃模擬液中加入15 mg的微膠囊，37 ℃水浴消化2 h，分別在消化時間為0、30、60、90、120 min時收集10 mL消化液，3000 r/min離心10 min，取上清液于-20 ℃冰箱中保存。

腸消化：取上述離心后留下的微膠囊，加入60 mL腸模擬液，37 ℃水浴條件下緩慢攪拌，消化4 h，當(dāng)消化時間為0、10、20、30、60、90、120、180、240 min時收集10 mL消化液，3000 r/min離心10 min，吸取上清液，儲藏于-20 ℃冰箱中。

將凍存的消化液緩慢解凍后，取5 mL消化液與10 mL體積分數(shù)75%的乙醇溶液混合，3000 r/min離心10 min，取上清液，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后加入10 mL去離子水溶解，以胃模擬液和腸模擬液為空白對照，在233 nm波長條件下測定其吸光度，利用標準曲線測定活性物質(zhì)的質(zhì)量濃度，進而根據(jù)式（3）計算釋放率：

式中：ρ0為微膠囊總復(fù)合物質(zhì)量濃度/（g/mL）；ρt為某消化時間復(fù)合物質(zhì)量濃度/（g/mL）。

1.3.8 大鼠血壓的測定

選用最佳包埋工藝制備的微膠囊，微膠囊與藥食同源復(fù)合物的劑量根據(jù)《中國藥典》中決明子臨床用量（2～15 g）及決明子中蒽醌類的得率計算，再依據(jù)人和大鼠的體表面積折算法確定[17]，對大鼠的處理及分組如表4所示。

表4 大鼠分組及給藥量Table 4 Grouping and administration dosages of rats

利用RBP-1型大鼠血壓計測量清醒安靜狀態(tài)下各組大鼠尾動脈的收縮壓。測量之前加熱大鼠10 min使其達到37 ℃，使動脈充盈以便測量[18]。在規(guī)定時間由專人測量各組大鼠的血壓值，多次測量取平均值，為該鼠所在周的血壓值。

1.3.9 實驗大鼠的解剖與樣本收集

灌胃8 周后禁食不禁水12 h稱量體質(zhì)量后，麻醉取材，如下：

1）血漿：每組3 只大鼠麻醉后仰臥固定于鼠臺上，0.5%碘伏消毒，沿腹正中線剪開腹腔，采集的血液4 ℃、3000 r/min 離心20 min，離心后上層淡黃色透明液體即為血漿上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆肹19]。

2）器官：取左心室、胸主動脈、左腎置于10%甲醛溶液中固定備用，剩余的心臟、右腎、胸主動脈于液氮中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.10 大鼠血漿ACE、ACE2、Ang(1-7)、AngII質(zhì)量濃度的測定

根據(jù)試劑盒中說明書上的方法進行測定。

1.3.11 大鼠心臟、腎臟、胸主動脈中AngII蛋白表達的測定

對心臟、右腎、胸主動脈進行脫蠟、抗原修復(fù)、加抗體孵育、洗片、封片，顯微鏡觀察并拍照[20]。利用Image pro plus軟件分析，定量結(jié)果用密度平均值表示，密度平均值＝密度總和/面積總和，將對照組中蛋白質(zhì)進行標準化處理，從而對其他實驗組蛋白進行定量分析[21]。

1.3.12 大鼠胸主動脈、心臟纖維化程度測定

參考胡歡的方法進行Masson染色實驗[22]，并利用IHCToolbox軟件分析纖維化程度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 藥食同源物與ACE抑制肽復(fù)配后的ACE抑制率

如圖1 所示，藥食同源復(fù)合物的ACE 抑制率為69.46%。此外，測定了單個藥食同源物的ACE抑制率，分別為山楂43.32%、決明子45.82%、枸杞37.71%，表明藥食同源復(fù)合物的ACE抑制率明顯高于單個藥食同源物。同時可以看出，ACE抑制肽本身的抑制活性為71.48%，隨著藥食同源復(fù)合物的加入，ACE抑制效果逐漸增加，在ACE抑制肽∶復(fù)合物＝1∶2時，ACE抑制率最大，達78.19%，此時ACE抑制效果顯著優(yōu)于單一藥食同源物和ACE抑制肽（P＜0.05），說明藥食同源物與ACE抑制肽協(xié)同可提高抑制活性。趙敏等[23]同樣發(fā)現(xiàn)乳酶解液和中草藥復(fù)配復(fù)合物（山楂∶決明子＝1∶1）的混合液具有較高ACE抑制率，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是藥食同源物中的活性成分（如槲皮素、茶多酚等）能夠通過影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)從而增強蛋白質(zhì)的功能特性[6]。綜上，藥食同源物與ACE抑制肽復(fù)配可進一步提高抑制效果。

圖1 ACE抑制肽與復(fù)合物不同比例復(fù)配后ACE抑制率結(jié)果Fig.1 ACE inhibition rates of blends of ACE inhibitory peptide with the mixture at different proportions

2.2 藥食同源物協(xié)同ACE抑制肽微膠囊制備工藝的優(yōu)化

2.2.1 微膠囊包埋率標準曲線的建立

如圖2所示，可以發(fā)現(xiàn)在波長為233 nm時，不同質(zhì)量濃度間吸光度差異最大，為1.511。根據(jù)233 nm波長處0～0.80 g/mL藥食同源復(fù)合液的吸光度建立標準曲線，得到R2＝0.9902，大于0.9000，線性相關(guān)性良好，以此為標準曲線測定微膠囊的包埋率。

圖2 紫外分光光度計全波長掃描Fig.2 UV absorption spectra of the microcapsules

2.2.2 正交試驗結(jié)果分析

正交試驗結(jié)果分析見表5，方差分析見表6。正交試驗所得微膠囊制備的最佳參數(shù)為：固含物為10%、進風(fēng)溫度為160 ℃、芯壁比為1∶15、變性淀粉∶麥芽糊精＝1∶4，此時微膠囊的包埋率為85.44%。從R值的大小可以看出，影響微膠囊包埋率的主要因素先后順序為芯壁比＞壁材配比＞固含物＞進風(fēng)溫度。從表6可以發(fā)現(xiàn)，固含物、進風(fēng)溫度、芯壁比及壁材配比這4 種因素對活性成分微膠囊包埋率的影響均顯著。

表5 正交試驗結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal array design

表6 方差分析表Table 6 Analysis of variance

表7為正交試驗所得最佳工藝及包埋率較高的3 種制備工藝，為了確定最佳包埋工藝，研究這4 種工藝方法制備的微膠囊的微觀結(jié)構(gòu)、苦味以及體外釋放率進一步驗證最佳工藝參數(shù)[24]。

表7 不同噴霧干燥工藝參數(shù)Table 7 Validation of optimized encapsulation parameters

2.2.3 不同微膠囊微觀結(jié)構(gòu)分析

如圖3所示，不同工藝參數(shù)制備的微膠囊微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)有所不同，在2000 倍條件下觀察的工藝參數(shù)1制備的微膠囊結(jié)構(gòu)呈光滑球型，存在少數(shù)微膠囊表面凹陷（圖3A），可能是噴霧干燥儀器進風(fēng)溫度變化引起的，也可能是在儲存過程中發(fā)生的氧化反應(yīng)所引起的[25]，從400 倍掃描電子顯微鏡圖可以看出微膠囊沒有明顯的破裂現(xiàn)象，包埋效果較好；而圖3B～D中微膠囊均存在破裂情況，總體形態(tài)結(jié)構(gòu)不如圖3A。綜合比較，可以得出根據(jù)工藝參數(shù)1制備的微膠囊的微觀結(jié)構(gòu)、破裂情況都相對較好。

圖3 不同微膠囊掃描電子顯微鏡圖Fig.3 Scanning electron micrographs of microcapsules prepared under different conditions

2.2.4 不同微膠囊的苦味分析

如圖4所示，未經(jīng)包埋的藥食同源復(fù)合物（空白組）TD值達34，而經(jīng)過包埋后微膠囊的TD值均在10左右，其中工藝參數(shù)1制備的微膠囊TD值最低，僅為4，與空白組相比苦味顯著降低（P＜0.05），說明包埋處理可有效解決活性成分的苦味問題，且工藝參數(shù)1制備的微膠囊苦味降低程度最明顯。

圖4 不同微膠囊苦味分析Fig.4 Bitterness analysis of microcapsules prepared under different conditions

2.2.5 不同微膠囊體外釋放率

如圖5A所示，隨著消化時間的延長，4 種微膠囊在胃液中的釋放率均逐漸增長，在胃消化120 min時，工藝參數(shù)1制備的微膠囊釋放率最低，為23.6%，而工藝參數(shù)3制備的微膠囊釋放率最高，達25.2%，說明工藝參數(shù)1制備的微膠囊在胃液中更為穩(wěn)定，對芯材的保護作用最好，可以實現(xiàn)將大多數(shù)活性物質(zhì)穩(wěn)定地輸送到腸道中。經(jīng)過胃消化的微膠囊在腸道中進一步被破壞，隨著消化時間的延長，活性物質(zhì)的釋放率逐漸增加，在240 min時，4 種工藝制備的微膠囊在腸消化釋放率均達到了80%以上，其中工藝參數(shù)1制備的微膠囊活性物質(zhì)釋放率為81.4%（圖5B）。

圖5 不同微膠囊在模擬胃液（A）和模擬腸液（B）中的釋放率Fig.5 Release rates of microcapsules prepared under different conditions in simulated gastric (A) and intestinal (B) juices

綜上，工藝參數(shù)1制備的微膠囊結(jié)構(gòu)完整，在胃中釋放率最低，在腸道中釋放率較高。相較于其他工藝制備的微膠囊釋放效果更好，可實現(xiàn)活性物質(zhì)腸道內(nèi)定點釋放[26]?？傻贸龉に噮?shù)1（固含物為10%、進風(fēng)溫度為160 ℃、芯壁比為1∶15、壁材為變性淀粉∶麥芽糊精＝1∶4）為制備藥食同源協(xié)同ACE抑制肽微膠囊的最佳制備工藝。

2.3 藥食同源協(xié)同ACE抑制肽微膠囊對SHR血壓的影響

如圖6 所示，灌胃前，模型組收縮壓為（175.00±5.58）mmHg，舒張壓為（145.00±6.48）mmHg，符合SHR模型的要求；對照組收縮壓為（123.00±7.25）mmHg，舒張壓為（80.00±9.10）mmHg，符合實驗要求[27]。圖6A、C中藥物組大鼠血壓下降較快，且可使血壓降低至正常狀態(tài)，各實驗組降壓趨勢相同，均逐漸下降且在2 周左右趨于穩(wěn)定，圖6B、D中實驗組收縮壓和舒張壓均與模型組存在顯著差異（P＜0.05），說明藥食同源物協(xié)同ACE抑制肽可有效低SHR的血壓值，且相較于卡托普利降壓過程更溫和。李曉南等[28]同樣發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方配伍酪蛋白水解物對SHR具有降壓作用。

圖6 各組大鼠血壓值Fig.6 Blood pressure in rats in each group

2.4 大鼠血漿中ACE、ACE2、Ang(1-7)、AngII含量

如圖7所示，灌胃8 周后，藥物組、實驗組大鼠的血漿中Ang(1-7)、ACE2含量較模型組均顯著增加（P＜0.05），ACE及AngII含量顯著降低（P＜0.05），腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）兩個通路的拮抗作用可以解釋這一現(xiàn)象：活性成分抑制了ACE的活性從而抑制了ACE及AngII的生成，系統(tǒng)另一條通路中Ang(1-7)和ACE2因負調(diào)節(jié)而生成，從而使Ang(1-7)和ACE2含量增加[29]。圖7A中，藥物組、實驗組與模型組相比ACE含量均顯著下降（P＜0.05），但與對照組相比仍存在差異。3 組實驗組相比，實驗2組大鼠血漿中ACE含量最低。圖7B中，實驗組與模型組、對照組相比ACE2含量均有顯著差異（P＜0.05），3 組實驗組相比，實驗2組大鼠血漿中ACE2含量顯著高于實驗1、3組。圖7C中各組大鼠血漿Ang(1-7)含量與圖7B情況相似，藥物組、實驗組與模型組相比均可顯著提高Ang(1-7)含量（P＜0.05），且實驗2組中Ang(1-7)含量顯著高于實驗1、3組。圖7D中各組大鼠的AngII含量與圖7A情況相似。

圖7 各組大鼠血漿中ACE（A）、ACE2（B）、Ang(1-7)（C）和AngII（D）的含量Fig.7 Contents of ACE (A),ACE2 (B),Ang(1-7) (C) and AngII (D) in the plasma of rats from each group

綜上，藥食同源物協(xié)同ACE抑制肽能夠抑制ACE，影響RAS中其他活性因子含量從而達到降低血壓的效果，并且協(xié)同后對ACE的抑制效果較單一藥食同源復(fù)合物、ACE抑制肽更顯著。

2.5 大鼠心臟、腎臟、胸主動脈中AngII蛋白表達

RAS既存在于循環(huán)系統(tǒng)中，也存在于血管、心臟、中樞、腎臟和腎上腺等組織器官中，共同參與調(diào)節(jié)血壓的平衡[30]，AngII位于細胞間隙，為棕色或棕褐色[31]，如圖8所示，與對照組相比，模型組中大鼠胸主動脈、心臟及腎臟組織切片上AngII的陽性表達增多。如圖9所示，與模型組相比，藥物組及實驗組中大鼠AngII在胸主動脈、心臟和腎臟中的表達明顯減少（P＜0.05），說明藥食同源復(fù)合物及其協(xié)同ACE抑制肽均能減少AngII在靶器官中的表達。同時，實驗2組中大鼠心臟、腎臟及胸主動脈的AngII含量均顯著低于實驗1、3組（P＜0.05），且在腎臟中，實驗2組比藥物組中大鼠的腎臟中AngII蛋白表達抑制效果更明顯。綜上，藥食同源物協(xié)同ACE抑制肽能夠影響大鼠心臟、腎臟、胸主動脈中的RAS，達到降壓的效果。

圖8 各組大鼠心臟、腎臟、胸主動脈中AngII蛋白表達圖Fig.8 AngII protein expression patterns in the heart,kidney and thoracic aorta of rats from each group

圖9 各組大鼠心臟、腎臟、胸主動脈中AngII相對蛋白表達量Fig.9 Relative expression levels of AngII protein in the heart,kidney,and thoracic aorta of rats from each group

2.6 大鼠心臟纖維化程度

Masson染色法是用于顯示組織中纖維的染色方法之一，經(jīng)過染色處理不同組織呈現(xiàn)出不同的顏色，其中膠原纖維、黏液、軟骨呈藍色；肌纖維、纖維素和紅細胞呈紅色；細胞核呈藍黑色[32-33]。如圖10所示，相較對照組，模型組中大鼠心臟間質(zhì)周圍藍色區(qū)域明顯，說明纖維化程度明顯增加。對膠原陽性面積統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)與模型組相比，3 個實驗組SHR心臟間質(zhì)膠原的形成均顯著減少（P＜0.05），其中實驗1組大鼠心臟間質(zhì)的膠原形成情況與藥物組無顯著差別（P＞0.05），實驗3組中大鼠改善情況最明顯。綜上，藥食同源物協(xié)同ACE抑制肽可明顯改善SHR因血壓引起的心臟纖維化現(xiàn)象（P＜0.05）。

圖10 各組大鼠心臟間質(zhì)Masson染色圖（A）及心臟纖維化程度（B）Fig.10 Masson staining images of the cardiac interstitium (A) and degree of cardiac fibrosis (B) in rats from each group

2.7 大鼠胸主動脈纖維化程度

如圖11所示，與對照組比較，模型組膠原纖維明顯增加，同時有膠原浸潤的現(xiàn)象，膠原纖維分散且不穩(wěn)定。實驗組中大鼠胸主動脈形態(tài)均勻，外膜的膠原纖維沉積減少，彈性肌纖維順序齊整，分布較為均勻，中膜細胞相互間的膠原現(xiàn)象明顯減少。且實驗組胸主動脈纖維化程度與模型組相比顯著下降（P＜0.05），其中實驗3組胸主動脈纖維化程度最低。說明藥食同源物協(xié)同ACE抑制肽能夠有效改善SHR胸主動脈的纖維化情況，可通過影響血管的重構(gòu)和重塑、生成從而對血管起到修復(fù)的作用，緩解和保護因高血壓疾病對血管的損害。

圖11 各組大鼠胸主動脈Masson染色圖（A）及胸主動脈纖維化程度（B）Fig.11 Masson staining images of thoracic aorta (A) and degree of thoracic aorta fibrosis (B) of rats from each group

3 結(jié)論

本實驗首先研究藥食同源復(fù)合物（枸杞∶山楂∶決明子＝4∶1∶1）與ACE抑制肽的協(xié)同效果，當(dāng)兩者質(zhì)量比為2∶1時的ACE抑制率達到最高，利用混合壁材（變性淀粉∶麥芽糊精＝1∶4）進行包埋，當(dāng)進風(fēng)溫度160 ℃、芯壁比1∶15、固含物10%時，微膠囊的包埋率最高且結(jié)構(gòu)形態(tài)飽滿，使活性物質(zhì)在胃液中得到有效保護并在腸道中充分釋放，且苦味顯著降低。其次，動物實驗說明藥食同源物協(xié)同ACE抑制肽能夠通過抑制ACE的活性影響RAS，從而顯著降低SHR的血壓（P＜0.05），其對ACE、AngII等關(guān)鍵酶的作用效果優(yōu)于單一藥食同源復(fù)合物及ACE抑制肽，并且能夠顯著降低SHR心臟及主動脈的纖維化程度（P＜0.05），改善因高血壓疾病引起的臟器損傷，對心臟和血管重構(gòu)起到積極作用。