銅藻多酚的體外抗炎和降血糖活性

何裊裊，李孟昱，蔡樹蕓，施麗君，陳偉珠，陳 暉，洪 專，張 怡，張怡評(píng),*

（1.自然資源部第三海洋研究所，海洋生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)創(chuàng)新中心，福建 廈門 361005；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350001；3.福建省海島資源生態(tài)監(jiān)測與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361005）

銅藻別名柱囊馬尾藻、海柳麥、玉海藻，屬于暖溫帶性海藻，每年4—5月大量繁殖會(huì)造成金潮等環(huán)境問題[1]。研究發(fā)現(xiàn)，銅藻中含有褐藻多酚、褐藻膠、褐藻多糖、巖藻黃質(zhì)等活性成分[2-5]，具有較高的營養(yǎng)和藥用價(jià)值，可以作為化工、食品、醫(yī)藥等行業(yè)的優(yōu)質(zhì)原料。目前關(guān)于銅藻中的褐藻多糖、褐藻膠等活性成分的研究較多，而對(duì)銅藻多酚的報(bào)道較少。褐藻多酚是銅藻中一類重要的活性成分，不僅含量高，而且具有抗氧化[6-8]、抗腫瘤[9]、降血糖[10-11]、降血脂[12]等生物活性，在食品、保健品及化妝品等領(lǐng)域有較高的應(yīng)用前景。

根據(jù)炎癥發(fā)生的過程和機(jī)制，可分為急性和慢性炎癥[13]，長期的炎癥會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷，甚至?xí)?dǎo)致死亡[14]，如潰瘍性結(jié)腸炎、糖尿病并發(fā)癥等。研究發(fā)現(xiàn)，植物多酚能夠通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)和炎癥因子的分泌量，減輕炎癥作用[15]。本研究的主要內(nèi)容是通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)確定銅藻多酚的毒性，然后用銅藻多酚處理經(jīng)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞，檢測炎癥介質(zhì)NO和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）的分泌量和蛋白含量變化，從而確定銅藻多酚的抗炎活性。

糖尿病是一種常見的代謝紊亂疾病，會(huì)引發(fā)高血糖以及糖尿病相關(guān)的心臟疾病和神經(jīng)病變[16]。糖尿病主要是由胰島素分泌量減少或者胰島素抵抗引起的[17]，但是糖尿病會(huì)有多種并發(fā)癥，常見的有糖尿病腎病[18]、視網(wǎng)膜病變[19]以及糖尿病引起的血管老化[20]?，F(xiàn)在用于治療糖尿病的藥物主要有二甲雙胍、阿卡波糖等，長期服用對(duì)身體副作用較大。研究發(fā)現(xiàn)植物多酚等天然產(chǎn)物對(duì)協(xié)助降血糖存在一定效果，并且對(duì)身體沒有副作用，所以通過體外降血糖活性實(shí)驗(yàn)，可以確定銅藻多酚是否具有協(xié)助降血糖功效。α-葡萄糖苷酶是調(diào)節(jié)血糖的關(guān)鍵性酶，可以將多糖非還原端的α-葡萄糖苷鍵和低聚糖的α-1,4-糖苷鍵轉(zhuǎn)化成α-D-葡萄糖和α-1,6-糖苷鍵，從而生成異麥芽糖等[21]，所以α-葡萄糖苷酶可以有效調(diào)節(jié)餐后血糖，對(duì)預(yù)防和治療糖尿病有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以α-葡萄糖苷酶活性為指標(biāo)，研究銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，再通過動(dòng)力學(xué)分析銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制類型，以期為銅藻多酚的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮銅藻采自福建泉州海域，經(jīng)自然資源部第三海洋研究所王初生研究員鑒定為銅藻（依據(jù)《中華海洋本草》和《中華海洋本草圖鑒》）。

95%食用酒精 安徽安特食品股份有限公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、RPMI細(xì)胞培養(yǎng)基 美國Hyclone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）美國Gibco公司；胰蛋白酶（trypsin/EDTA）蘭杰柯科技有限公司；青霉素-鏈霉素溶液 蘭博利德生物技術(shù)有限公司；蛋白Marker 美國Thermo公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、BCA蛋白濃度檢測試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；NO（一氧化氮）檢測試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司；噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、LPS、地塞米松美國Sigma公司；小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 美國ATCC公司；α-葡萄糖苷酶、對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，PNPG）上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-500E超聲清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；UH5300紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；ABI5500-Q-TRAP質(zhì)譜儀 美國AB公司；Hei-VAP Value G3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；HH-ZK水浴鍋鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；H1650離心機(jī) 湖南湘儀試驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；CLM-170B-8-NF細(xì)胞培養(yǎng)箱 新加坡Esco生物公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)江蘇蘇凈集團(tuán)；M1650-W常溫離心機(jī) 湘儀試驗(yàn)室儀器有限公司；PTY-B1200電子天平 華志科學(xué)儀器有限公司；Model 3555酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；AXIO OBSERVER A1倒置熒光顯微鏡 德國ZEISS公司；AriaMx實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀 美國安捷倫公司；PowerPacTW Basic電泳儀 美國Bio-Rad公司；infinite F50酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司。

1.3 方法

1.3.1 銅藻多酚粗提液制備

銅藻洗凈除鹽，瀝干水分后切碎備用。稱取適量銅藻（鮮質(zhì)量），在乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、超聲時(shí)間53 min、液料比60∶1的條件下制備銅藻多酚粗提液，收集粗提液濃縮冷藏備用。利用大孔吸附樹脂LX-158對(duì)銅藻多酚進(jìn)行純化，條件：上樣流速3 mL/min，上樣體積10 mL，洗脫劑40%乙醇溶液，洗脫劑流速3 mL/min，洗脫劑體積120 mL，在此條件下純化銅藻多酚，其純度從7.52%提高到40.31%，最后收集洗脫劑，濃縮后冷凍干燥備用。通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，初步推測多酚中含有Triphlorethol A（三聚體），結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 Triphloretol A的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of triphloretol A

1.3.2 銅藻多酚抗炎活性檢測

1.3.2.1 細(xì)胞存活率（MTT檢測）

將狀態(tài)良好的細(xì)胞接種至96 孔板中，4000～5500 個(gè)/孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁后加入銅藻多酚溶液（0（陰性對(duì)照）、1.25、2.5、5、10、25、50、75、100、150 μg/mL），每孔100 μL，作用時(shí)間為24 h，每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。藥物作用24 h后，加入母液（質(zhì)量濃度為5 mg/mL MTT），每孔10 μL MTT，作用4 h，吸出上清液，同時(shí)盡量不吸出孔板底部的甲瓚（生成物），最后每孔加入150 μL DMSO溶解甲瓚，利用酶標(biāo)儀在492 nm波長處測量光密度（OD）值。利用OD值計(jì)算細(xì)胞存活率：

1.3.2.2 細(xì)胞NO分泌量

將巨噬細(xì)胞接種于24 孔板中，1.5萬 個(gè)/孔，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁后預(yù)先加入質(zhì)量濃度為20、30、40 μg/mL的銅藻多酚處理2 h，再每孔加入0.5 μL的LPS，最終LPS質(zhì)量濃度為1 μg/mL，LPS誘導(dǎo)24 h。收集細(xì)胞上清液，將細(xì)胞上清液的培養(yǎng)基作為檢測樣本。使用NO檢測試劑盒檢測細(xì)胞分泌的NO含量。具體操作規(guī)范按照試劑盒使用說明書。

1.3.2.3 細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)量

將狀態(tài)良好的巨噬細(xì)胞接種在6 孔板中，接種密度為4.5×105個(gè)/孔，細(xì)胞培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后加入銅藻多酚（質(zhì)量濃度分別為10、20、30 μg/mL）預(yù)處理1 h。之后再加入LPS使其終質(zhì)量濃度為1 μg/mL，LPS誘導(dǎo)24 h。去除細(xì)胞培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗一遍，提取RNA。

用Hieff UNICON Qpcr SYBR Green Master Mix（Low Rox）試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，以GAPDH管家基因作為內(nèi)參，通過real-time PCR對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定量。實(shí)驗(yàn)所用的引物序列如下：

TNF-α的正向引物為5’-GAACTGGCAGAAGAGGCACT-3’，反向引物為5’-AGGGTCTGGGCCATAGAACT-3’；

IL-1β的正向引物為5’-AGAGCATCCAGCTTCAAAT-3’，反向引物為5’-CATCTCGGAGCCTGTAGTG-3’；

IL-6的正向引物為5’-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3’，反向引物為5’-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3’；

GAPDH的正向引物為5’-CCTTCCGTGTTCCTACCC-3’，反向引物為5’-CAACCTGGTCCTCAGTGTAG-3’。

1.3.2.4 炎癥因子蛋白表達(dá)水平（蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)）

蛋白樣品在預(yù)先配制的丙烯酰胺凝膠上上樣，電泳儀電壓設(shè)置為80 V的恒壓狀態(tài)，當(dāng)?shù)鞍讞l帶跑至分離膠中，加大電壓至120 V，蛋白跑至分離膠底部，電泳結(jié)束。將電泳結(jié)束后的凝膠在電轉(zhuǎn)液的緩沖條件下，利用“三明治”法，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上固定，此過程的電泳儀設(shè)置為260 mA的恒流狀態(tài)，電轉(zhuǎn)時(shí)間為60 min。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，用5%脫脂奶粉封閉2 h，排除一些非特異性蛋白的干擾；封閉后的膜根據(jù)目的蛋白選擇一抗，一抗在4 ℃搖床上孵育過夜；一抗孵育完成后，需要用1×Tris含吐溫-20緩沖鹽溶液（tris buffered saline with Tween-20，TBST）在室溫?fù)u床上洗膜3 次，每次10 min；洗膜之后孵育二抗，二抗根據(jù)一抗的種屬選擇，在室溫?fù)u床上孵育2 h即可，二抗孵育結(jié)束后洗膜3 次。再利用Biorad化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行曝光檢測。

1.3.3 體外降血糖活性檢測

1.3.3.1 反應(yīng)溶液配制

底物PNPG溶液：精密稱取0.375 g PNPG，加入適量PBS（pH 6.8）溶解，容量瓶定容至50 mL，配制成25 mmol/L的母液（冷藏）。然后將母液稀釋成0.5、1、2、3、4、5 mmol/L 6 個(gè)不同質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

α-葡萄糖苷酶溶液：精密稱取凍干酶粉末，加入適量PBS（pH 6.8）溶解，配制成1 U/mL的母液（冷藏）。

1.3.3.2 最適底物濃度確定

以對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP）含量為指標(biāo)（顏色越深，說明PNP含量越高），探究PNPG的最佳實(shí)驗(yàn)濃度（0.5、1、2、3、4、5 mmol/L）。實(shí)驗(yàn)步驟如1.3.3.5節(jié)。

1.3.3.3 最適酶濃度確定

以PNP含量為指標(biāo)，探究α-葡萄糖苷酶的最佳活力（0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 U/mL）。實(shí)驗(yàn)步驟如1.3.3.5節(jié)。

1.3.3.4 最適反應(yīng)時(shí)間確定

以PNP含量為指標(biāo)，探究實(shí)驗(yàn)的最佳反應(yīng)時(shí)間（每隔10 min測定一次）。實(shí)驗(yàn)步驟如1.3.3.5節(jié)。

1.3.3.5 銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

PNPG在α-葡萄糖苷酶的作用下能水解產(chǎn)生葡萄糖和PNP，PNP在405 nm波長處有最大吸收，測定其吸光度。如表1所示，依次加入PBS、銅藻多酚溶液和PNPG底物（5 mmol/L、pH 6.8），混合均勻。將96 孔板于37 ℃反應(yīng)5 min，反應(yīng)結(jié)束后，加入0.1 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，充分混勻，于37 ℃反應(yīng)30 min，利用酶標(biāo)儀測定405 nm波長處的吸光度[22]，計(jì)算銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制率，每組平行實(shí)驗(yàn)3 次。計(jì)算公式如下：

表1 銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制實(shí)驗(yàn)Table 1 Experimental design for measuring the inhibitory effects of polyphenols from S.horneri on α-glucosidase activityμL

1.3.4α-葡萄糖苷酶抑制動(dòng)力學(xué)研究

每個(gè)試管中加入銅藻多酚溶液（0、5、10、15 μg/mL）和α-葡萄糖苷酶溶液（0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 U/mL），反應(yīng)50 min后測定吸光度。計(jì)算酶反應(yīng)速率，繪制酶反應(yīng)速率（單位時(shí)間內(nèi)底物的分解速率，以A0/t表示（A0為吸光度））與α-葡萄糖苷酶活力的關(guān)系圖[23]。

配制PNPG溶液（1、2、3、4、4.5、5 mmol/L），計(jì)算不同底物濃度和不同銅藻多酚質(zhì)量濃度下的酶促反應(yīng)速率。繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖和Dixon圖，研究銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型[24]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 銅藻多酚的體外抗炎活性

2.1.1 銅藻多酚對(duì)細(xì)胞存活率的影響（MTT實(shí)驗(yàn)）

通過判斷銅藻多酚對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)在無毒條件下進(jìn)行，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，高質(zhì)量濃度銅藻多酚對(duì)細(xì)胞活力影響較小，RAW 264.7細(xì)胞生長狀況良好。由圖2可知，與陰性對(duì)照對(duì)比，發(fā)現(xiàn)銅藻多酚質(zhì)量濃度低于150 μg/mL對(duì)巨噬細(xì)胞的形態(tài)和活力沒有明顯的影響。

圖2 不同質(zhì)量濃度銅藻多酚對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of S.horneri polyphenols on cell survival rate

2.1.2 銅藻多酚對(duì)NO分泌量的影響

采用Griess法檢測培養(yǎng)液中NO水平。由圖3可知，與空白組（Con）相比，模型組（LPS）中NO含量顯著提升（P＜0.0001），說明經(jīng)過LPS誘導(dǎo)，RAW 264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥釋放大量NO，炎癥細(xì)胞模型建立成功。與模型組相比，地塞米松陽性對(duì)照組（Dex（5 μmol/L））和給藥組中NO含量都有明顯的下降，銅藻多酚質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，NO含量變化不顯著，銅藻多酚質(zhì)量濃度為30、40 μg/mL兩組中NO含量均表現(xiàn)為顯著下降，從100%分別下降到76.23%（P＜0.05）、62.45%（P＜0.01），銅藻多酚可以有效抑制NO分泌量，說明其具有很好的抗炎活性。

2.1.3 銅藻多酚對(duì)炎癥因子mRNA表達(dá)水平的影響

LPS本身為細(xì)菌細(xì)胞壁的成分，作為一種炎癥介質(zhì)，可以使單核巨噬細(xì)胞活化，在LPS的作用下，巨噬細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β。利用real-time PCR檢測銅藻多酚能否可以改變致炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)水平。由圖4可知，30 μg/mL銅藻多酚溶液顯著降低LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6和IL-1β 3 種細(xì)胞因子的mRNA下調(diào)。此外，可以發(fā)現(xiàn)銅藻多酚對(duì)炎性因子的抑制作用與銅藻多酚的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。

圖4 銅藻多酚對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β（A）、TNF-α（B）和IL-6（C）的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of S.horneri polyphenols on mRNA expression of IL-1β (A),TNF-α (B) and IL-6 (C) in LPS-induced RAW 264.7 cells

2.1.4 銅藻多酚對(duì)促炎細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平的影響

經(jīng)過LPS誘導(dǎo)，RAW 264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥釋放IL-1β、TNF-α，細(xì)胞裂解液用免疫印跡法檢測TNF-α、IL-1β和α-Tubulin。通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)和灰度分析，與LPS處理組相比，發(fā)現(xiàn)高質(zhì)量濃度銅藻多酚可以顯著降低促炎細(xì)胞因子TNF-α蛋白表達(dá)，但是對(duì)IL-1β蛋白表達(dá)的抑制作用不顯著（P＞0.05）。由圖5可知，隨著銅藻多酚質(zhì)量濃度增大，對(duì)促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)的抑制作用逐漸增強(qiáng)。

圖5 銅藻多酚對(duì)促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)的抑制（A）及灰度分析（B）Fig.5 Western blotting patterns (A) and grayscale analysis (B) of the inhibitory effect of polyphenols from S.horneri on protein expression of pro-inflammatory cytokines TNF-α and IL-1β

2.2 銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響

2.2.1 底物濃度的選擇

為了確定α-葡萄糖苷酶活性抑制實(shí)驗(yàn)中的最佳的PNPG濃度。本實(shí)驗(yàn)利用不同濃度的PNPG（0.5、1、2、3、4、5 mmol/L）和α-葡萄糖苷酶進(jìn)行反應(yīng)，由圖6可知，隨著PNPG濃度增大，α-葡萄糖苷酶對(duì)PNPG的反應(yīng)能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)PNPG濃度為5 mmol/L時(shí)，吸光度達(dá)到最大，此時(shí)底物和酶反應(yīng)完全。所以PNPG的最適濃度為5 mmol/L。

圖6 不同濃度的底物（PNPG）對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.6 Effects of different concentrations of substrate (PNPG) on the activity of α-glucosidase

2.2.2α-葡萄糖苷酶濃度的選擇

當(dāng)?shù)孜颬NPG濃度和反應(yīng)時(shí)間為定值時(shí)，在α-葡萄糖苷酶作用下，PNPG被分解成葡萄糖和PNP，隨著α-葡萄糖苷酶濃度增大，分解速率不斷變大。由圖7可知，當(dāng)α-葡萄糖苷酶活力為0.1 U/mL時(shí)，α-葡萄糖苷酶能夠開始水解底物，并且酶的濃度越低，越容易與抑制劑發(fā)生反應(yīng)。α-葡萄糖苷酶為0.1 U/mL時(shí)，已經(jīng)能夠判斷銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力。利用低濃度的α-葡萄糖苷酶能夠減少酶的用量，節(jié)約成本。所以最終確定α-葡萄糖苷酶的最佳濃度為0.1 U/mL。

圖7 不同α-葡萄糖苷酶濃度對(duì)底物分解速率的影響Fig.7 Effects of different α-glucosidase concentrations on substrate decomposition rate

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間的選擇

隨著反應(yīng)時(shí)間延長，底物和α-葡萄糖苷酶的反應(yīng)越完全。由圖8可知，40 min時(shí)，底物和α-葡萄糖苷酶的反應(yīng)還在進(jìn)行，50 min時(shí)，底物和酶的反應(yīng)幾乎趨于穩(wěn)定，隨著時(shí)間延長并未進(jìn)一步反應(yīng)。所以確定最佳反應(yīng)時(shí)間為50 min。

圖8 反應(yīng)時(shí)間對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.8 Effect of reaction time on α-glucosidase activity

2.2.4 銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制結(jié)果

由圖9可知，銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果為：隨著銅藻多酚質(zhì)量濃度增大，抑制效果逐漸增強(qiáng)。銅藻多酚質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí)抑制率達(dá)到90%以上，說明銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性有較強(qiáng)的抑制效果。銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為5.96 μg/mL。

圖9 不同質(zhì)量濃度銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.9 Inhibitory effect of S.horneri polyphenols at different concentrations on α-glucosidase activity

2.2.5α-葡萄糖苷酶抑制動(dòng)力學(xué)結(jié)果

抑制劑對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用包括不可逆抑制和可逆抑制兩種類型。由圖10可知，隨著銅藻多酚質(zhì)量濃度增大，直線斜率逐漸減小，同時(shí)所有直線都基本過原點(diǎn)，說明銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用是可逆的[25]。

為了確定銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的可逆抑制類型，按照Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線作圖法，研究銅藻多酚質(zhì)量濃度、底物濃度和酶解速率之間的關(guān)系，確定抑制類型和抑制常數(shù)。由Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖11可知，隨著銅藻多酚質(zhì)量濃度降低，α-葡萄糖苷酶的酶解速率明顯升高。隨著底物濃度增加，酶解速率也不斷增大。說明銅藻多酚優(yōu)先與酶結(jié)合，從而使葡萄糖苷酶活性下降[24-25]。

圖11 不同質(zhì)量濃度銅藻多酚與α-葡萄糖苷酶反應(yīng)的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.11 Lineweaver-Burk double reciprocal curves for the reaction of S.horneri polyphenols with α-glucosidase at different concentrations

通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線可以看出米氏常數(shù)Km和最大酶解速率Vmax值的變化，Km和Vmax的比值為斜率，Y軸截距為1/Vmax，Km和Vmax的比值隨著銅藻多酚質(zhì)量濃度增大而增大。通過Dixon圖（圖12）可以看出，不同質(zhì)量濃度銅藻多酚直線相交于第2象限，交點(diǎn)接近Y軸，說明銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用是混合抑制。Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線中交點(diǎn)的橫坐標(biāo)的絕對(duì)值表示競爭性抑制常數(shù)Kic值，而Dixon圖中交點(diǎn)橫坐標(biāo)的絕對(duì)值表示非競爭性抑制常數(shù)Kiu值。計(jì)算得到銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的Kic值為0.06 μg/mL，Kiu值為6.68 μg/mL。非競爭性常數(shù)大于競爭性常數(shù)，說明銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型是非競爭性大于競爭性的混合可逆性抑制類型[26-29]，具體數(shù)值如表2所示。

表2 不同質(zhì)量濃度銅藻多酚與α-葡萄糖苷酶的抑制常數(shù)Table 2 Inhibition constants of S.horneri polyphenols at different concentrations on α-glucosidase

圖12 不同質(zhì)量濃度銅藻多酚與α-葡萄糖苷酶反應(yīng)的Dixon曲線Fig.12 Dixon curves for the reaction of S.horneri polyphenols with α-glucosidase at different concentrations

3 討論

糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的主要因素是炎癥，研究發(fā)現(xiàn)植物多酚不僅對(duì)糖尿病并發(fā)癥有一定的抑制作用，而且能夠直接降血糖。本實(shí)驗(yàn)研究了銅藻多酚的體外抗炎活性，利用LPS誘導(dǎo)RAW 264.7巨噬細(xì)胞建立體外炎癥模型。結(jié)果表明，通過細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)（MTT法）檢測銅藻多酚質(zhì)量濃度在1.25～150 μg/mL之間時(shí)，細(xì)胞存活率高，說明銅藻多酚沒有明顯的細(xì)胞毒性。40 μg/mL銅藻多酚顯著降低炎癥介質(zhì)中NO含量，30 μg/mL的銅藻多酚可以使IL-1β、TNF-α 和IL-63 種細(xì)胞因子的mRNA水平顯著下調(diào)，對(duì)炎癥因子TNF-α的蛋白表達(dá)水平有顯著抑制作用，但是對(duì)炎癥因子IL-1β蛋白表達(dá)水平抑制作用不顯著，具有較強(qiáng)的抗炎活性，與純化后咖啡果殼多酚的抗炎活性[30]相比，銅藻多酚的對(duì)炎癥因子的蛋白和mRNA水平的抑制作用更明顯。銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性有明顯抑制效果，并且隨著銅藻多酚質(zhì)量濃度增大抑制效果逐漸增強(qiáng)，銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50為5.96 μg/mL，說明銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性有較強(qiáng)的抑制效果，明顯高于紅景天多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50（2.83 mg/mL）[31]。根據(jù)雙倒數(shù)曲線可知，銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的Kic值為0.06 μg/mL，Kiu值為6.68 μg/mL，非競爭性常數(shù)Kiu值大于競爭性常數(shù)Kic值，說明銅藻多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型是非競爭性大于競爭性的混合可逆性抑制類型。綜上，銅藻多酚具有抗炎活性和降血糖活性，可以作為化工、食品、醫(yī)藥等行業(yè)的優(yōu)質(zhì)原料。