巖藻黃素對小鼠非酒精性脂肪性肝病的修復(fù)作用

任祥雨，鄭佳文，田笑笑，曹洪杰，李航婷，唐云平，楊最素

（浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江省海洋生物醫(yī)用制品重點工程技術(shù)研究中心，浙江 舟山 316022）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種與酒精無關(guān)的、以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變性為主要特征的一類臨床病理綜合征。NAFLD可從脂肪變性發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎、纖維化、肝硬化，容易發(fā)展為癌癥，是目前最常見的慢性肝臟疾病[1]。NAFLD的全球患病率為25%，NAFLD已成為全球關(guān)注的公共健康問題，患者會同時出現(xiàn)2型糖尿病、高血脂、高血壓和心腦血管疾病等并發(fā)癥[2]。目前，臨床上缺乏針對NAFLD的特效藥物。盡管NAFLD發(fā)病機(jī)制尚未完全明晰，但肝脂質(zhì)聚積所致的氧化應(yīng)激、炎性應(yīng)激等是導(dǎo)致疾病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制[3]。研究顯示，高脂飲食是導(dǎo)致NAFLD的形成與發(fā)生的重要因素[4]。NAFLD患者通常會出現(xiàn)體脂和肝質(zhì)量的增加、血脂水平變化以及肝脂肪病變，并伴隨著炎癥的發(fā)生。因此對于NAFLD的預(yù)防和治療仍然強調(diào)健康的生活方式和降低體質(zhì)量的重要性。

已有的研究表明，從海洋褐藻中提取的非VA類胡蘿卜素——巖藻黃素是一種呈橙紅色的粉末狀物質(zhì)，其分子式為C42H58O6，密度為1.09 g/cm3，熔點為166～168 ℃。其不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，穩(wěn)定性較差，但具有強大的抗氧化、減輕炎癥等生理活性，且分子質(zhì)量很小，很容易被生物體吸收[5]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，巖藻黃素對小鼠急性酒精性肝損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制是激活核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）介導(dǎo)的抗氧化防御和抑制由Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）介導(dǎo)的炎癥機(jī)制相關(guān)[6]。此外，還發(fā)現(xiàn)巖藻黃素可以改善體外NAFLD細(xì)胞模型中的脂質(zhì)沉積，降低炎癥因子白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的釋放，通過抑制TLR4信號通路的關(guān)鍵蛋白并通過過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferators-activated receptors α，PPARα）途徑改善Chang liver細(xì)胞脂質(zhì)代謝平衡而發(fā)揮作用[7]。然而巖藻黃素對高脂飼料誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠建立的NAFLD模型是否具有修復(fù)作用目前報道不多。本實驗通過給予8 周高脂飼料喂養(yǎng)小鼠，建立小鼠非酒精性脂肪性肝病的動物模型后，從體內(nèi)途徑通過檢測小鼠生理、生化指標(biāo)的變化，肝臟中主要抗氧化酶和炎癥因子的水平、降脂抗炎信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，來探究巖藻黃素對高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠NAFLD的修復(fù)作用機(jī)制，為開發(fā)海洋來源的天然抗氧化劑在慢性肝病中的防治作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性C57BL/6J小鼠52 只（4 周齡，體質(zhì)量為16～18 g），購自浙江省實驗動物中心（生產(chǎn)許可證號：SCXK 2014-0001）。實驗小鼠均在本校SPF級動物房（SYXK（浙）2014-0013）中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為24～26 ℃、60%相對濕度、12 h光/暗循環(huán)控制條件，自由進(jìn)食進(jìn)水（全營養(yǎng)滅菌飼料，去離子水），適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后對所有小鼠進(jìn)行稱質(zhì)量并分組開始實驗。

60%高脂實驗鼠糧（D12492）蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司；巖藻黃素（70%）山東潔晶集團(tuán)股份有限公司；脂聯(lián)素、瘦素試劑盒 武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和糖原染色（periodic acidschiff stain，PAS）試劑盒 南京建成生物工程研究所；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H&E）染色試劑盒上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DAB免疫組織化學(xué)試劑盒博士德生物工程有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、三羥甲基氨基甲烷、ECL Plus超敏發(fā)光液、20×TBS、牛血清白蛋白V 北京索萊寶科技有限公司；甲醇、吐溫80 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甘氨酸上海麥克林生化科技股份有限公司；十二烷基硫酸鈉GEN-VIEW科技有限公司；NAD(P)H-醌氧化還原酶1（NAD(P)H quinone oxidoreductase 1，NQO1）、血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein-1，Keap-1）、Nrf2、谷氨酸-半胱氨酸連接酶（glutamatecysteine ligase modifier，GCLM）、5’-單磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）、磷酸化乙酰輔酶A羧化酶（p-acetyl-CoA carboxylase，p-ACC）、肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1（carnitine acyl transferase 1，CPT-1）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）、PPARα、磷酸化5’-單磷酸腺苷活化蛋白激酶（p-adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，p-AMPK）、乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）、脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）武漢三鷹生物科技有限公司；TLR4、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、磷酸化人核因子κB抑制蛋白α（p-nuclear factor κB inhibitory protein α，p-IκBα）、磷酸化核因子κB（p-nuclear factor kappa-B，p-NF-κB）蛋白 上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CX31型光學(xué)顯微鏡 日本OLYMPUS公司；RM2135型切片機(jī)、HI1210型攤片機(jī)、H1220型烤片機(jī)德國Leica公司；SpectraMax型酶標(biāo)儀、Mini sub cell型電泳系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；BSA124S型電子天平德國Satorius AG公司；CF16RX II型高速低溫離心機(jī)日本日立公司；Fluor Chem FC3型化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)美國ProteinSimple公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組

實驗動物分組情況如圖1所示，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)挑選14 只小鼠喂養(yǎng)普通飼料（Con組），其余38 只小鼠均給予高脂飼料進(jìn)行自由進(jìn)食，8 周后，從Con組和高脂飼料（high fat diet，HFD）組中各挑選小鼠2 只，進(jìn)行血清生化指標(biāo)檢測和肝臟組織學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)高脂飼料組中血清生化指標(biāo)（谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）等）明顯高于Con組，且伴有肝細(xì)胞中的空泡樣脂肪沉著，表明NAFLD小鼠模型建立成功。然后將喂養(yǎng)高脂飼料的小鼠隨機(jī)分為3 組（每組12 只）進(jìn)行灌胃治療，每日1 次，連續(xù)6 周：1）普通飼料+生理鹽水（HFD組）；2）普通飼料+20 mg/kgmb巖藻黃素（Fx-20組）；3）普通飼料+40 mg/kgmb巖藻黃素（Fx-40組）。每周記錄小鼠的體質(zhì)量。第14周結(jié)束時小鼠禁食12 h后全部處死。肝臟、脂肪解剖離體后立即稱質(zhì)量并進(jìn)行觀察拍照，所有組織和血清按實驗所需要保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 小鼠分組和實驗方法Fig.1 Grouping and treatments of mice

1.3.2 小鼠Lee’s指數(shù)的計算

根據(jù)小鼠的體質(zhì)量與體長，計算Lee’s指數(shù)。其計算公式為：

1.3.3 小鼠血清生化指標(biāo)的測定

小鼠眼球取血，4 ℃、10000 r/min離心5 min取血清。血清樣本收集后于-80 ℃儲存，谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）活力，總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、LDL-C、HDL-C、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）脂聯(lián)素和瘦素含量按試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.3.4 小鼠肝臟中炎癥因子和抗氧化指標(biāo)的測定

稱取一定質(zhì)量的肝臟，用生理鹽水均質(zhì)處理制成10%的勻漿液，混合液以4000 r/min離心10 min后，取上清液，依照試劑盒操作說明對肝臟中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及抗氧化指標(biāo)MDA、SOD、谷胱甘肽（glutathione，GSH-Px）、CAT含量進(jìn)行測定。

1.3.5 小鼠組織切片和形態(tài)學(xué)分析

1）H&E染色和PAS：小鼠肝臟、脂肪組織取出后，切成1 cm2大小立即放入4%中性甲醛固定液中固定，經(jīng)脫水、包埋、制片，按說明書染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

2）油紅O染色：小鼠肝組織取出后經(jīng)常規(guī)方法進(jìn)行冰凍切片，按試劑盒說明進(jìn)行油紅O染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

3）透射電鏡觀察：小鼠肝組織取出后，切成0.5 cm2大小立即放入2.5%戊二醛固定液中固定，委托浙江大學(xué)電鏡中心進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.3.6 蛋白免疫印跡法檢測小鼠肝臟中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

提取肝臟中蛋白：液氮中研磨肝組織，加入預(yù)先配制含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液并充分混勻，4 ℃條件下10000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測定各個樣品的蛋白濃度，加入適量的5×蛋白上樣緩沖液并在95 ℃金屬浴條件下10 min致蛋白質(zhì)變性，封口后于-20 ℃保存。蛋白免疫印跡法參考Ren Xiangyu等[8]方法進(jìn)行。

1.3.7 免疫組織化學(xué)法觀察小鼠肝臟中p-AMPK、p-ACC、FAS的表達(dá)

小鼠肝臟切片至5 μm厚，脫蠟至水，EDTA高溫高壓進(jìn)行修復(fù)抗原，3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min，37 ℃、5% BSA封閉30 min，一抗4 ℃孵育過夜，二抗孵育30 min，滴加DAB顯色，鏡下控制時間，蘇木素染核2 min，脫水、透明、中性樹膠封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察各蛋白的表達(dá)情況并拍照，隨后用ImageJ軟件對各蛋白表達(dá)量進(jìn)行半定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 巖藻黃素對小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響

如圖2所示，飼喂高脂飼料的小鼠出現(xiàn)明顯的體質(zhì)量上升和豎毛現(xiàn)象。第9周開始用巖藻黃素干預(yù)后，小鼠體質(zhì)量開始下降，特別是Fx-40組的小鼠體質(zhì)量接近于Con組。此外，和Con組相比，HFD組小鼠的肝臟指數(shù)和Lee’s指數(shù)也顯著上升（P＜0.01），而巖藻黃素組逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象，F(xiàn)x-40組小鼠的肝臟指數(shù)和Lee’s指數(shù)與Con組相比無顯著差異（P＞0.05）。說明巖藻黃素對抑制高脂飲食引起的體質(zhì)量和肝質(zhì)量增加效果明顯。

圖2 巖藻黃素對NAFLD小鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)的影響Fig.2 Effect of fucoxanthin on body mass and liver index in NAFLD mice

2.2 巖藻黃素對小鼠脂肪質(zhì)量的影響

相較于皮下脂肪，內(nèi)臟脂肪的顯著增加更能直觀地反映出小鼠存在代謝紊亂、肥胖等健康問題。如圖3所示，HFD誘導(dǎo)后小鼠體內(nèi)附睪和腎周脂肪明顯增多，與HFD組相比，用巖藻黃素干預(yù)的小鼠脂肪質(zhì)量顯著減少（P＜0.01）。同時，對各組的附睪脂肪進(jìn)行H&E染色，結(jié)果顯示，與Con組相比，HFD組小鼠附睪脂肪細(xì)胞明顯增大，而經(jīng)巖藻黃素處理后小鼠的附睪脂肪細(xì)胞明顯減小。

圖3 巖藻黃素對NAFLD小鼠脂肪質(zhì)量的影響Fig.3 Effect of fucoxanthin on fat mass in NAFLD mice

2.3 巖藻黃素對小鼠血清ALT和AST活力的影響

血清ALT、AST的檢測結(jié)果如圖4所示，對比Con組，HFD組的ALT和AST活力出現(xiàn)了異常升高。而與HFD組相比，巖藻黃素給藥組小鼠血清中的ALT和AST活力均顯著降低（P＜0.01）。

圖4 巖藻黃素對NAFLD小鼠血清ALT（A）和AST（B）水平的影響Fig.4 Effect of fucoxanthin on the serum levels of ALT (A) and AST (B)in NAFLD mice

2.4 巖藻黃素對小鼠血脂水平的影響

小鼠血清中脂質(zhì)代謝參數(shù)TG、TC、LDL-C、HDL-C和FFA的含量如表1所示。相較于Con組，HFD組小鼠血清中TG、TC、LDL-C和FFA含量均顯著升高（P＜0.01），而HDL-C則顯著性下降（P＜0.01）。與此同時，巖藻黃素組中小鼠的TG、TC、LDL-C和FFA含量相較于HFD組則顯著下降（P＜0.01），并且基本恢復(fù)到正常水平，而HDL-C含量明顯升高。

表1 巖藻黃素對NAFLD小鼠血脂水平的影響Table 1 Effect of fucoxanthin on blood lipid levels in NAFLD micemmol/L

2.5 巖藻黃素對小鼠血清脂聯(lián)素和瘦素水平的影響

如圖5所示，HFD誘導(dǎo)使小鼠血清中脂聯(lián)素水平下降，瘦素水平上升。而與HFD組相比，巖藻黃素可降低血清中瘦素水平，并增加脂聯(lián)素的分泌。

圖5 巖藻黃素對NAFLD小鼠血清脂聯(lián)素（A）和瘦素（B）水平的影響Fig.5 Effect of fucoxanthin on the serum levels of adiponectin (A) and leptin (B) in NAFLD mice

2.6 巖藻黃素對小鼠肝臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)的影響

各組小鼠解剖后，取出肝臟用生理鹽水清洗后觀察其形態(tài)的變化。如圖6所示，可見Con組小鼠肝臟體積較小，呈鮮艷的暗紅色，相比之下，HFD組肝臟體積變大，顏色偏黃無光澤，經(jīng)巖藻黃素處理后肝臟的體積減小，顏色與正常相近呈暗紅色。

圖6 巖藻黃素對NAFLD小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響Fig.6 Effect of fucoxanthin on morphological characteristics of liver tissue in NAFLD mice

H&E染色結(jié)果顯示，Con組小鼠的肝索呈放射狀排列在中央靜脈周圍、肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)少見脂肪滴。而HFD組的肝索排列紊亂，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)大量空泡樣變性。經(jīng)巖藻黃素處理后肝組織修復(fù)較好，肝索排列整齊，細(xì)胞質(zhì)中空泡較少。

油紅O染色陽性部位呈紅色顆粒，從圖6可以看出，HFD組肝組織較Con組出現(xiàn)大量的脂質(zhì)沉積，細(xì)胞內(nèi)可見不同大小的脂滴。而巖藻黃素組切片顯示細(xì)胞內(nèi)脂滴分布明顯減少。

PAS陽性部位為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)的紫紅色區(qū)域，從圖中可見，HFD組細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞間糖原染色明顯增多，糖原顆粒明顯。巖藻黃素組的糖原陽性區(qū)域明顯減少。

2.7 巖藻黃素對小鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)的影響

如圖7所示，Con組小鼠肝臟細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器豐富，核膜清晰；HFD組小鼠肝臟中出現(xiàn)大量大小不一、電子密度低的白色圓形脂滴，同時細(xì)胞器結(jié)構(gòu)模糊，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，核膜不清晰。經(jīng)巖藻黃素干預(yù)后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的數(shù)量增多，脂滴數(shù)量明顯減少，線粒體明顯增多。

圖7 巖藻黃素對NAFLD小鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.7 Effect of fucoxanthin on ultrastructure of liver tissue in NAFLD mice

2.8 巖藻黃素對小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化的影響

如圖8所示，MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志性產(chǎn)物，與Con組相比，HFD組MDA含量顯著增高（P＜0.01），而相較于HFD組，巖藻黃素組小鼠肝臟中MDA的含量明顯降低。肝臟中SOD、GSH-Px和CAT是體內(nèi)固有抗氧化防御系統(tǒng)的標(biāo)志物，與Con組相比，HFD組中SOD、GSH-Px和CAT的活性顯著下降（P＜0.01），而巖藻黃素干預(yù)可以逆轉(zhuǎn)由HFD引起的小鼠肝臟中抗氧化酶活力的下降，使其呈劑量依賴性增加。

圖8 巖藻黃素對NAFLD小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化的影響Fig.8 Effect of fucoxanthin on lipid peroxidation of liver tissue in NAFLD mice

2.9 巖藻黃素對小鼠肝臟中炎癥因子水平的影響

為探究巖藻黃素對HFD誘導(dǎo)小鼠NAFLD炎癥水平的影響，檢測了血清中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的質(zhì)量濃度。如圖9所示，相較于Con組，HFD組小鼠肝臟中IL-1β、IL-6和TNF-α質(zhì)量濃度均顯著增加（P＜0.01），而與HFD組相比，巖藻黃素組這3 種因子的質(zhì)量濃度均顯著下降（P＜0.01）。

圖9 巖藻黃素對NAFLD小鼠肝臟中炎癥因子質(zhì)量濃度的影響Fig.9 Effect of fucoxanthin on the levels of inflammatory cytokines in liver tissue of NAFLD mice

2.10 巖藻黃素對AMPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖10所示，相較于Con組，HFD組小鼠肝臟中p-AMPK、PPARα蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），SREBP-1c、FAS蛋白的表達(dá)上升；給予巖藻黃素干預(yù)后p-AMPK和PPARα的蛋白表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01），SREBP-1c表達(dá)下降，上調(diào)p-ACC、CPT-1蛋白和抑制FAS蛋白的表達(dá)。

圖10 巖藻黃素對NAFLD小鼠肝臟中AMPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.10 Effect of fucoxanthin on the expression of proteins associated with AMPK signaling pathway in liver tissue of NAFLD mice

為了進(jìn)一步證實該結(jié)論，采用免疫組織化學(xué)法檢測小鼠肝臟組織中p-AMPK、p-ACC和FAS蛋白的表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)的棕黃色結(jié)構(gòu)即為陽性部位。如圖11所示，經(jīng)各蛋白的半定量分析結(jié)果可以看出，免疫組織化學(xué)的結(jié)果與蛋白免疫印跡法結(jié)果一致。

圖11 免疫組織化學(xué)法檢測NAFLD小鼠肝臟中p-AMPK、p-ACC和FAS光學(xué)顯微鏡照片和蛋白表達(dá)情況Fig.11 Immunohistochemical results of optical microscope photo and the protein expression of p-AMPK,p-ACC and FAS in liver tissue of NAFLD mice

2.11 巖藻黃素對Nrf2通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為進(jìn)一步探討巖藻黃素對NAFLD小鼠氧化應(yīng)激關(guān)鍵調(diào)控蛋白的影響，檢測了Keap/Nrf2通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。如圖12所示，HFD喂養(yǎng)后可顯著提高小鼠肝臟中Keap-1的水平（P＜0.01），同時抑制Nrf2及其下游抗氧化蛋白HO-1、NQO1和GCLM的表達(dá)水平。巖藻黃素給藥組顯著改變了這些蛋白的表達(dá)水平（P＜0.01），與Con組的表達(dá)情況一致，說明巖藻黃素可以通過激活Nrf2介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)，從而減輕HFD對小鼠肝臟造成的氧化應(yīng)激。

圖12 巖藻黃素對NAFLD小鼠肝臟中Nrf2通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.12 Effect of fucoxanthin on the expression of proteins associated with the Nrf2 signaling pathway in liver tissue of NAFLD mice

2.12 巖藻黃素對TLR4通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

TLR4信號通路與NAFLD發(fā)展過程密切相關(guān)，從圖13可以看出，相較于Con組，HFD組小鼠肝臟中TLR4表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），同時啟動下游信號級聯(lián)，誘導(dǎo)MyD88、p-IκBα和p-NF-κB (p65)表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）。而巖藻黃素有效抑制了這些蛋白的上調(diào)，表明巖藻黃素能通過減少TLR4蛋白的表達(dá)，繼而抑制其與下游MyD88的結(jié)合，減少炎癥因子的合成及活化，從而達(dá)到抑制炎癥產(chǎn)生、緩解肝臟損傷的目的。

圖13 巖藻黃素對NAFLD小鼠肝臟中TLR4通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.13 Effect of fucoxanthin on the expression of proteins associated with the TLR4 signaling pathway in liver tissue of NAFLD mice

3 討論

隨著生活方式及飲食習(xí)慣的改變，全球代謝綜合征患病率不斷上升，NAFLD已取代病毒性肝病成為全球第一肝病，對病人的身體造成嚴(yán)重的影響并加重了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。然而NAFLD尚無明確的發(fā)病機(jī)制，缺乏有效的防治方法[9]。目前的“多重打擊假說”已取代了“二次打擊”，從最初的脂質(zhì)堆積和單純脂肪變性，逐漸演變?yōu)榫€粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、脂肪和細(xì)胞因子改變等，最終導(dǎo)致NAFLD發(fā)展為非酒精脂肪性肝炎[10]，因此減脂、抗氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)仍是防治的要點[11-12]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)可成功建立NAFLD模型，表現(xiàn)為小鼠體質(zhì)量異常增加，肝臟指數(shù)和Lee’s指數(shù)增加，肝組織結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)大量的脂滴堆積，附睪和腎周脂肪的質(zhì)量增加及脂肪細(xì)胞體積增大，肝功能敏感指標(biāo)ALT、AST升高，并伴有血清TG、TC和LDL-C等血脂水平的增高，而給予巖藻黃素后改善了這些異常表現(xiàn)，使肝的形態(tài)結(jié)構(gòu)、肝功能敏感指標(biāo)和血脂水平恢復(fù)到正常范圍。同時使用巖藻黃素后減輕了氧化應(yīng)激水平，表現(xiàn)為SOD、GSH-Px和CAT水平的升高，MDA水平的降低；炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)明顯下降，表明巖藻黃素通過抑制脂質(zhì)水平和減輕氧化應(yīng)激改善小鼠NAFLD，這與文獻(xiàn)報道的修復(fù)NAFLD的活性物質(zhì)的機(jī)制[13-14]相似。另有研究表明，肥胖小鼠的脂肪組織可分泌過量的瘦素，并與下丘腦神經(jīng)元上的瘦素受體發(fā)生結(jié)合，從而降低食欲，減輕體質(zhì)量[15]。脂聯(lián)素也是由脂肪細(xì)胞分泌產(chǎn)生，可調(diào)節(jié)血清中的葡萄糖和脂質(zhì)水平，并減少肝臟中的脂質(zhì)積累[16]，實驗中給予巖藻黃素改善NAFLD的作用可通過降低血清中瘦素水平、升高脂聯(lián)素的分泌而實現(xiàn)。

AMPK可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)分解代謝和合成代謝來改善能量代謝的激酶，并調(diào)節(jié)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，因此是代謝疾病的潛在治療靶標(biāo)。AMPK活化可能通過抑制肝臟中的脂肪生成、增加ACC的磷酸化來改善脂肪酸氧化，抑制NAFLD[17]。AMPK信號通路活化可以改善NAFLD小鼠肝臟的脂質(zhì)沉積[18]。在NAFLD中，PPARα的激活可預(yù)防TG的積累，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[19]；并可通過誘導(dǎo)CPT-1表達(dá)而增加游離脂肪酸氧化[20]。而AMPK是下游ACC、SREBP-1c和FAS的主要激酶調(diào)節(jié)因子[21-22]，其中ACC主要存在于合成脂類組織的細(xì)胞質(zhì)中[23]；SREBP-1c是一種細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，主要被胰島素激活，在脂質(zhì)合成的誘導(dǎo)中起核心作用[24]；FAS是脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵酶[25]，其過表達(dá)會導(dǎo)致大量脂肪酸的合成，SREBP-1c通過刺激FAS來誘導(dǎo)脂肪酸和TG的合成。有研究表明，在糖尿病小鼠模型中巖藻黃素能通過激活A(yù)MPK調(diào)節(jié)糖原生成[26-27]。因此檢測AMPK通路的相關(guān)蛋白可判斷巖藻黃素是否激活該通路影響能量代謝。本實驗結(jié)果表明，在HFD組中，AMPK通路蛋白受到抑制，同時脂質(zhì)合成關(guān)鍵蛋白的表達(dá)增加，而巖藻黃素改變了這一現(xiàn)象：激活A(yù)MPK通路，通過PPARα途徑改善肝臟脂質(zhì)代謝平衡，減少脂質(zhì)的生成，促進(jìn)NAFLD修復(fù)。

脂質(zhì)積累的衰減和氧化應(yīng)激的抑制將是治療NAFLD的有效方法[28]。Nrf2信號作為關(guān)鍵的細(xì)胞防御系統(tǒng)，通過調(diào)節(jié)一系列基因來防止病理性損傷[29]。Nrf2信號還參與負(fù)控制脂質(zhì)積累，不僅通過抑制FFA攝取因子，也可通過激活PPARα信號來調(diào)節(jié)脂肪酸代謝和轉(zhuǎn)運[30]。Nrf2通過參與脂質(zhì)代謝、炎癥和抗氧化反應(yīng)的調(diào)節(jié)，在NAFLD的發(fā)展中起關(guān)鍵作用[31]。有報道稱，橘子素通過Nrf2途徑改善高脂肪飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠的肝脂肪變性和氧化應(yīng)激[32]。本實驗通過檢測Keap/Nrf2介導(dǎo)的抗氧化通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)巖藻黃素可明顯降低Keap-1的水平，增加Nrf2及其下游抗氧化蛋白HO-1、NQO1和GCLM的表達(dá)水平，因此巖藻黃素通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而發(fā)揮修復(fù)作用。

TLR4信號傳導(dǎo)是先天免疫的關(guān)鍵組成部分，與NAFLD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，當(dāng)其與特異性配體結(jié)合后，可通過系列的級聯(lián)反應(yīng)激活信號通路下游的炎癥因子，導(dǎo)致肝臟損傷[33]。有研究證明，TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB的水平在HFD誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肝臟中顯著增加[34]，本實驗結(jié)果與此相似，即給予巖藻黃素后，這些相關(guān)的蛋白表達(dá)明顯下降，表明巖藻黃素可通過TLR4/NF-κB途徑介導(dǎo)其在NAFLD修復(fù)中的作用。

綜上所述，本研究認(rèn)為巖藻黃素對HFD誘導(dǎo)的小鼠NAFLD有一定的修復(fù)作用，通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等多途徑、多靶點起作用，從而對HFD誘導(dǎo)NAFLD的“多重打擊”具有保護(hù)作用，為揭示巖藻黃素修復(fù)NAFLD的機(jī)制提供新的思路。