基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討健胃清腸合劑治療急性胰腺炎作用機(jī)制

趙世偉 ，李生財(cái) ，漆利紅

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是臨床常見(jiàn)的急腹癥，發(fā)病急驟，病情變化快，根據(jù)嚴(yán)重程度可分為輕癥AP、中重癥AP和重癥AP，嚴(yán)重者可并發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能衰竭，甚至危及患者生命安全[1]。目前，西醫(yī)治療AP主要采用液體復(fù)蘇、對(duì)癥和支持治療等方法，尚未有針對(duì)性藥物，臨床應(yīng)用胰酶抑制劑和生長(zhǎng)抑素的治療價(jià)值還需驗(yàn)證，抗生素的使用也存在爭(zhēng)議[2-3]。

AP屬中醫(yī)學(xué)“腹痛”“脾心痛”范疇，臨床多屬里、實(shí)、熱證，治療以通里攻下法應(yīng)用多且效果顯著[4-5]。健胃清腸合劑是由甘肅省中醫(yī)院廖志峰研制的院內(nèi)制劑，其組成為大黃、木香、枳殼、黃連、檳榔、元明粉，有通腑泄熱、清熱解毒、通里攻下功用。前期實(shí)驗(yàn)表明，其能降低腸梗阻模型大鼠血清中白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-10水平，減輕炎癥反應(yīng)[6]，臨床應(yīng)用表明，其聯(lián)合生長(zhǎng)抑素較單獨(dú)使用生長(zhǎng)抑素能更快縮短AP合并腸梗阻患者病程[7-8]?？梢?jiàn)，本方可能對(duì)AP及其并發(fā)癥有一定的治療作用。本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選健胃清腸合劑活性成分，分析其治療AP的主要靶點(diǎn)和信號(hào)通路，從分子層面解釋其藥理作用機(jī)制，為后續(xù)相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 健胃清腸合劑活性成分篩選與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.tcmsp-e.com/），結(jié)合文獻(xiàn)收集方中大黃、木香、枳殼、檳榔、黃連、元明粉的活性成分。其中元明粉在HERB（http://herb.ac.cn/）及TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，根據(jù)口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18篩選活性成分，獲得健胃清腸合劑活性成分及靶點(diǎn)，通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org）將靶點(diǎn)信息標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2 急性胰腺炎相關(guān)靶點(diǎn)篩選

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.omim.org/）中以關(guān)鍵詞“Acute Pancreatitis”進(jìn)行檢索，匯總整理疾病靶點(diǎn)信息。在DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.drugbank.ca/）中檢索收集治療AP相關(guān)上市藥物的靶點(diǎn)。將以上檢索結(jié)果合并，去除重復(fù)值，獲得AP相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 藥物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用Venny 平臺(tái)（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將藥物活性成分靶點(diǎn)與疾病潛在靶點(diǎn)進(jìn)行映射，并繪制韋恩圖。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），將蛋白質(zhì)種類設(shè)置為“Homo sapiens”， 最小互作用閾值為“highest confidence＞0.9”，構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO功能和KEGG通路富集分析

將藥物-疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID平臺(tái)（https://david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析，設(shè)置P＜0.05，將結(jié)果上傳微生信平臺(tái)（http://www.bioinformatics.com.cn），并將排名前20位的條目繪圖。

1.5 藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape3.9.1軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用Network Analyzer進(jìn)行拓?fù)浞治觯?jì)算節(jié)點(diǎn)度值、中介中心性和緊密中心性。分析健胃清腸合劑治療AP的重要活性成分及核心靶點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 健胃清腸合劑活性成分及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

全方共篩選得到活性成分37個(gè)（見(jiàn)表1），其中，大黃9個(gè)、木香5個(gè)、枳殼4個(gè)、黃連11個(gè)、檳榔7個(gè)，大黃、枳殼、元明粉共有1個(gè)成分，全方預(yù)測(cè)到靶點(diǎn)232個(gè)。藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖1。

圖1 健胃清腸合劑藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表1 健胃清腸合劑活性成分

2.2 急性胰腺炎潛在靶點(diǎn)篩選

在GeneCards、OMIM、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中分別得到1 193個(gè)、260個(gè)、6個(gè)疾病靶點(diǎn)，將其去重，用UniProt平臺(tái)規(guī)范，獲得1 360個(gè)AP潛在靶點(diǎn)。

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用Venn平臺(tái)將活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)映射，獲得123個(gè)交集靶點(diǎn)。將其導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖2），包含123個(gè)節(jié)點(diǎn)、526條邊。

圖2 健胃清腸合劑治療AP靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析

GO富集分析得到954條目，其中生物過(guò)程（BP）747條，涉及缺氧反應(yīng)、基因表達(dá)、凋亡調(diào)控等；細(xì)胞組分（CC）81條，包括細(xì)胞成分、線粒體等；分子功能（MF）126條，涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、酶結(jié)合等（見(jiàn)圖3）。將123個(gè)藥物-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID平臺(tái)進(jìn)行KEGG通路富集分析，以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，得到174條信號(hào)通路，包括癌癥、IL-17、TNF、PI3K-Akt等信號(hào)通路。排名前20位的信號(hào)通路見(jiàn)圖4。

圖3 健胃清腸合劑治療AP靶點(diǎn)GO富集分析

圖4 健胃清腸合劑治療AP靶點(diǎn)KEGG富集分析

2.5 藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape3.9.1軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖5，該網(wǎng)絡(luò)共有280個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 140個(gè)相互作用關(guān)系。根據(jù)degree 值篩選出前10 位活性成分，degree值越高，參與BP越多，據(jù)此可判斷健胃清腸合劑治療AP的關(guān)鍵活性成分及核心靶點(diǎn)（見(jiàn)表2）。

圖5 健胃清腸合劑治療AP藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

表2 健胃清腸合劑治療AP關(guān)鍵活性成分

3 討論

腑氣不通是AP的基本病機(jī)[9]，臨床常以承氣湯類方治療，已有基礎(chǔ)研究闡述其機(jī)制[10-11]。健胃清腸合劑是在承氣方基礎(chǔ)上加入健胃藥，以達(dá)保胃氣、存津液之效[12]。

本研究共挖掘出健胃清腸合劑活性成分37個(gè)，藥物和疾病共同靶點(diǎn)123個(gè)，KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)本方主要通過(guò)IL-17、TNF、PI3K-Akt、HIF-1信號(hào)通路治療AP。IL-17信號(hào)通路與炎癥發(fā)生密切相關(guān)，由Th17產(chǎn)生，IL-17可刺激中性粒細(xì)胞并進(jìn)一步促進(jìn)IL-6等促炎因子的表達(dá)[13-14]。同時(shí)，IL-6累積到一定水平會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)Th17 分化，形成正反饋，加重AP 的炎癥反應(yīng)[15]。TNF信號(hào)通路在機(jī)體中有重要作用，可以調(diào)控細(xì)胞凋亡、免疫和炎癥反應(yīng)[16]。其中TNF-α可以激活NF-κB炎癥核心因子，引發(fā)炎癥聯(lián)級(jí)反應(yīng)[17]。PI3K-Akt信號(hào)通路可影響細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡，通過(guò)調(diào)控該信號(hào)通路可有效減輕炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡[18-19]。HIF-1信號(hào)通路涉及缺氧、癌癥、炎癥等[20]，還影響細(xì)胞自噬，低氧環(huán)境可激活NF-κB，從而影響炎癥發(fā)生[21]。由此推測(cè)，健胃清腸合劑可通過(guò)相關(guān)信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、影響細(xì)胞自噬與凋亡，以治療AP。

從主要活性成分網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果得知，治療AP主要包括槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素等活性成分。研究表明，槲皮素有較好的抗炎作用，還可調(diào)節(jié)自噬功能、調(diào)控NF-κB 通路以減輕AP 造成的相關(guān)損傷[22-23]。β-谷甾醇有較好的抗炎作用，能影響IL-8、TNF-α表達(dá)及NLRP3激活。柚皮素可發(fā)揮在機(jī)體中抗菌消炎、抗損傷的作用。研究表明，柚皮素可通過(guò)長(zhǎng)鏈非編碼RNA途徑減少炎癥因子的產(chǎn)生，并可有效干預(yù)AP造成的心肌細(xì)胞損傷[24-25]。川陳皮素有較強(qiáng)的抗氧化功能，還可影響PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活[26-28]。因此，槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素、川陳皮素可能是治療AP的關(guān)鍵活性成分，主要通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、影響相關(guān)自噬、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡程序與信號(hào)通路干預(yù)AP造成的損傷。

分析健胃清腸合劑治療AP的作用靶點(diǎn)，度值較高的PTGS2、HSP90AA1、PTGS1、MAPK1 均為治療AP 常用靶點(diǎn)。PTSG1 和PTSG2 可參與機(jī)體炎癥反應(yīng)[29]。Zuehlke等[30]研究表明，HSP90AA1可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，抑制細(xì)胞凋亡。MAPK1可參與自噬，還可調(diào)控NF-κB影響炎癥反應(yīng)[31-32]。

綜上所述，健胃清腸合劑能多成分、多通路、多靶點(diǎn)干預(yù)AP對(duì)機(jī)體造成的損傷。本研究為健胃清腸合劑后續(xù)研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)受限于數(shù)據(jù)庫(kù)更新限制，分析可能有偏差，也無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)健胃清腸合劑的濃度控制和檢測(cè)。因此，本研究結(jié)果仍需要細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，才能為健胃清腸合劑治療AP提供更客觀的理論支撐。