基于ERS 信號(hào)蛋白異常表達(dá)探討清肝降濁方治療NAFLD 的機(jī)制研究

丁云錄，薄天儒，王鐵成，李馳坤，李曉兵，歐喜燕，劉彥晶*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117；2.吉林國(guó)文醫(yī)院，長(zhǎng)春 130012；3.長(zhǎng)春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司，長(zhǎng)春 130012）

隨著高脂高熱量食物在人們飲食結(jié)構(gòu)中比重的日益增加，社會(huì)肥胖率呈現(xiàn)出大幅度增長(zhǎng)趨勢(shì)，非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）病發(fā)率也隨之提高，據(jù)目前調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)NAFLD 新發(fā)人數(shù)比例以每年4%的速度增加，已成為威脅我國(guó)居民健康的第一大慢性肝病[1-3]。該病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，并且現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚無(wú)理想的治療藥物，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為NAFLD 病位在肝，涉及脾腎，主要病機(jī)以肝脾腎功能失調(diào)為本，痰濕、瘀血交阻互結(jié)停積于肝而形成脂肪肝。而采用中醫(yī)藥治療本病在減少脂肪沉積、改善肝功、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝及降低不良反應(yīng)方面具有獨(dú)到優(yōu)勢(shì)，研究前景廣闊。

清肝降濁方是基于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的臨床驗(yàn)方研制的一種預(yù)防治療脂肪肝的新型中藥制劑，療效顯著，但清肝降濁方干預(yù)NAFLD 的具體作用機(jī)制尚不明確。最新證據(jù)表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）與NAFLD 的發(fā)病有極為密切的聯(lián)系，PERK/eIF2a/ATF4 信號(hào)通路是ERS 中參與脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在NAFLD的形成過(guò)程中具有重要意義[4]。本次研究，清肝降濁方以PERK/eIF2a/ATF4 信號(hào)通路為基礎(chǔ)，檢測(cè)相關(guān)蛋白，從而明確其治療NAFLD 的作用機(jī)制，對(duì)于尋求NAFLD 更有效的治療方案及進(jìn)一步發(fā)揚(yáng)中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 動(dòng) 物 SD 大鼠，SPF 級(jí)，雄性，體質(zhì)量（220.1±13.6）g。自由攝食、飲水，分籠飼養(yǎng)，室溫（22±2）℃，日溫差：≤4 ℃，相對(duì)濕度：40%～70%，與相通房間的最小靜壓差：10 Pa，氨濃度≤14 mg/m3，噪音：≤60 dB，最低工作照度：150 Lm，晝夜暗交替時(shí)間：12 h/12 h。倫理許可證號(hào)：2021137。1.1.1 藥品 清肝降濁方（ 深棕褐色顆粒，20211215），長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心。易善復(fù)，批號(hào)：CBJD333，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20059010，賽諾菲（北京）制藥有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑 堿性磷酸酶試劑盒（223741，10 mL×10支）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒（221591，10 mL×10 支）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒（224961，10 mL×10 支）、總膽固醇檢測(cè)試劑盒（225351，10 mL×10支）、三酰甘油檢測(cè)試劑盒（224281，10 mL×10支），中生北控生物科技股份有限公司；總超氧化物歧化酶（T- SOD）測(cè)試盒，規(guī)格：50 管/48 樣，批號(hào)：20221018，游離脂肪酸（NEFA）測(cè)試盒，規(guī)格：50 管/48 樣，批號(hào)：20220915，丙二醛（MDA），規(guī)格：50管/48 樣，批號(hào)：20220927，南京建成生物工程研究所。ATF4抗體，規(guī)格：100 μg/mL，批號(hào)：D0581，eIF2a抗體，200 μg/mL，批號(hào)：C2473，CHOP 抗體，100 μg/mL，批號(hào)：S3627，Santa Cruz。

1.1.3 儀器 全自動(dòng)分析儀（selectra junior），荷蘭威圖；酶標(biāo)儀（BIO680），BIO RAD 公司；蛋白凝膠成像儀（TACON320），GE 公司；倒置熒光顯微鏡（IX71），OLYMPUS；高速冷凍離心機(jī)（Biofuge Stratos），德國(guó)賀利氏公司。

1.2 方法[5-10]

1.2.1 動(dòng)物分組 將60 只SPF 級(jí)SD 雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，稱(chēng)重，按體質(zhì)量大小編號(hào)，通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表法，將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組；脂肪肝模型組；易善復(fù)膠囊組；清肝降濁方設(shè)高、中和低3 個(gè)給藥劑量組。共6 組，每組10 只。

1.2.2 模型制備 正常對(duì)照組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)；其余各組均飼喂高脂飼料，高脂飼料配比（82.3%標(biāo)準(zhǔn)飼料+ 15%豬油+ 2%膽固醇+ 0.2%丙硫氧嘧啶+ 0.5%膽酸鈉），連續(xù)8 周。

1.2.3 給藥方法 從第9 周開(kāi)始陽(yáng)性對(duì)照組給予易善復(fù)懸浮液244.3 mg/kg 灌胃，清肝降濁方3 個(gè)劑量組給藥劑量分別為865.1 mg/kg、432.6 mg/kg 和216.3 mg/kg，給藥方式為灌胃給藥，給藥體積均為10 mL/kg，模型組和正常對(duì)照組給予等體積10 mL/kg 蒸餾水灌胃，持續(xù)給藥4 周。

1.2.4 標(biāo)本留取 給藥周期結(jié)束，大鼠禁食不禁水12 h，稱(chēng)重、麻醉。腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置30 min，3 000 rpm離心15 min，分離血清。剪取肝臟，置于-80℃超低溫冰箱保存。肝組織勻漿樣本處理：準(zhǔn)確稱(chēng)取肝組織重量，按重量（g）:體積（mL）=1:9 的比例，加入9 倍體積的勻漿介質(zhì)，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，2 500 轉(zhuǎn)/分，離心10 min，取上清液待測(cè)。

1.2.5 檢測(cè)指標(biāo) 1）日常狀態(tài)觀察：每日定時(shí)觀察各組大鼠的進(jìn)食及飲水情況、毛發(fā)色澤、活動(dòng)情況、糞便性狀等，每周對(duì)大鼠稱(chēng)重并記錄。2）肝功能指標(biāo)AST、ALT、AKP 檢測(cè)、血清中TC、TG、NEFA 及肝組織勻漿中TC、TG 檢測(cè)、肝組織勻漿中SOD、MDA檢測(cè)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)。3）蛋白免疫印跡（Western-blot），制備樣本：每個(gè)實(shí)驗(yàn)組各取50 mg肝臟組織，加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸化抑制劑混合物，勻漿，離心（4 ℃，16 000 rpm，30 min）后取上清。制膠及電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉、一抗孵育、二抗孵育，將PDF 從二抗稀釋液中取出繼續(xù)用TBST 漂洗，加入ECL 發(fā)光液后于凝膠成像儀上顯影拍照。檢測(cè)信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，大鼠ATF4、eIF2a、CHOP 表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 試驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用組間t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)肝功能相關(guān)指標(biāo)的影響 清肝降濁方865.1 mg/kg、432.6 mg/kg 和216.3 mg/kg 給藥組動(dòng)物血清AST、AKP、ALT 活性明顯低于模型組（P＜0.01或P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 清肝降濁方對(duì)NAFLD 大鼠血清AST、AKP、ALT 活性的影響（± s，n = 10）

表1 清肝降濁方對(duì)NAFLD 大鼠血清AST、AKP、ALT 活性的影響（± s，n = 10）

注：與模型對(duì)照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

組別 劑量/（mg/kg） ALT 活性/（U/L） AST 活性/（U/L） AKP 活性/（U/L）正常對(duì)照組 — 30.15±7.03## 29.93±4.98## 149.07±18.80##模型對(duì)照組 — 75.79±20.24 61.55±20.20 284.31±48.01易善復(fù)膠囊組 244.3 48.98±16.71## 40.02±15.54# 216.08±47.37##清肝降濁方組 865.1 38.39±19.50## 36.40±12.00## 154.87±50.50##清肝降濁方組 432.6 45.62±25.23## 39.93±11.07# 181.87±51.10##清肝降濁方組 216.3 54.75±22.86# 44.68±13.49# 197.66±91.67#

2.2 對(duì)血清及肝組織中TC、TG 含量的影響 清肝降濁方865.1 mg/kg 和432.6 mg/kg 給藥組動(dòng)物血清及肝勻漿中TC、TG 含量顯著低于模型對(duì)照組（P＜0.01或P＜0.05）；216.3 mg/kg 給藥組動(dòng)物肝勻漿中TG 含量顯著低于模型對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表2 和表3。

表2 清肝降濁方對(duì)NAFLD 大鼠血清TC、TG、NEFA 含量的影響（± s，n = 10）

表2 清肝降濁方對(duì)NAFLD 大鼠血清TC、TG、NEFA 含量的影響（± s，n = 10）

注：與模型對(duì)照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

組別 劑量/（mg/kg） 血清TC/（mmol/L） 血清TG/（mmol/L） 血清NEFA/（μmol/L）正常對(duì)照組 — 2.48±0.30## 1.83±0.29## 494.70±89.06##模型對(duì)照組 — 4.01±0.93 3.15±0.86 862.55±212.37易善復(fù)膠囊組 244.3 3.11±0.54# 2.38±0.49# 575.28±133.04##清肝降濁方組 865.1 2.94±0.47# 2.18±0.42## 568.58±124.42##清肝降濁方組 432.6 3.05±0.76# 2.29±0.52# 662.71±140.48#清肝降濁方組 216.3 3.39±0.84 2.47±0.67 754.95±197.69

表3 清肝降濁方對(duì)NAFLD 大鼠肝組織中TC、TG 含量的影響（± s，n = 10）

表3 清肝降濁方對(duì)NAFLD 大鼠肝組織中TC、TG 含量的影響（± s，n = 10）

注：與模型對(duì)照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

肝組織TG/（mmol/L）正常對(duì)照組 — 3.61±0.68## 2.95±0.32##模型對(duì)照組 — 6.12±0.94 4.08±0.49易善復(fù)膠囊組 244.3 5.03±0.84# 3.25±0.57##清肝降濁方組 865.1 4.79±0.89# 3.21±0.44##清肝降濁方組 432.6 4.99±1.19# 3.52±0.60#清肝降濁方組 216.3 5.20±1.07 3.60±0.48#組別 劑量/（mg/kg）肝組織TC/（mmol/L）

2.3 對(duì)血清NEFA 含量、肝組織中MDA 含量及SOD活性的影響 NAFLD 肝損傷模型形成后，模型組動(dòng)物血清NEFA 含量、肝組織MDA 含量明顯高于對(duì)照組，SOD 活性卻明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）。清肝降濁方865.1 mg/kg 和432.6 mg/kg 2 個(gè)給藥組動(dòng)物血清NEFA 含量及肝組織MDA 含量均明顯低于模型組（P＜0.01 或P＜0.05）；而清肝降濁方制劑865.1 mg/kg、432.6 mg/kg 和216.3 mg/kg 給藥組動(dòng)物肝組織SOD 活性卻明顯高于模型組（P＜0.01 或P＜0.05）。見(jiàn)表2 和表4。

表4 清肝降濁方對(duì)NAFLD 大鼠肝組織中SOD、MDA 含量的影響（± s，n = 10）

表4 清肝降濁方對(duì)NAFLD 大鼠肝組織中SOD、MDA 含量的影響（± s，n = 10）

注：與模型對(duì)照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

肝組織MDA/（nmol/mgprot）正常對(duì)照組 — 178.34±45.28## 8.84±1.96##模型對(duì)照組 — 69.14±40.61 14.27±2.12易善復(fù)膠囊組 244.3 128.11±53.58# 12.02±3.07清肝降濁方組 865.1 162.99±31.54## 11.99±1.29#清肝降濁方組 432.6 151.54±28.18## 12.43±1.35#清肝降濁方組 216.3 115.22±48.52# 13.53±2.60組別 劑量/（mg/kg）肝組織SOD/（U/mgprot）

2.4 對(duì)肝組織ATF4、eIF2a、CHOP 蛋白表達(dá)的影響 清肝降濁方制劑865.1 mg/kg、432.6 mg/kg 和216.3 mg/kg 3 個(gè)給藥組動(dòng)物ATF4、CHOP 表達(dá)量明顯低于模型組（P＜0.05 或P＜0.01）；清肝降濁方865.1 mg/kg、432.6 mg/kg 2 個(gè)給藥組動(dòng)物eIF2a 表達(dá)量明顯低于模型組（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 清肝降濁方對(duì)NAFLD 大鼠肝中ATF4、eIF2a、CHOP蛋白表達(dá)的影響（± s，n = 10）

表5 清肝降濁方對(duì)NAFLD 大鼠肝中ATF4、eIF2a、CHOP蛋白表達(dá)的影響（± s，n = 10）

注：與模型對(duì)照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

組別 劑 量/（mg/kg） ATF4 eIF2a CHOP正常對(duì)照組 — 0.11±0.01## 0.09±0.02## 0.13±0.03##模型對(duì)照組 — 0.77±0.18 0.83±0.12 0.98±0.08易善復(fù)膠囊組 244.3 0.61±0.12# 0.66±0.14# 0.87±0.10#清肝降濁方組 865.1 0.48±0.13## 0.56±0.13# 0.63±0.13##清肝降濁方組 432.6 0.59±0.09# 0.69±0.11# 0.78±0.11##清肝降濁方組 216.3 0.60±0.12# 0.74±0.10 0.87±0.14#

3 討論

非酒精性脂肪性肝病是常見(jiàn)的慢性肝病，指除外酒精、藥物、病毒或自身免疫性等確切因素而誘發(fā)的一系列肝臟疾病，NAFLD 治療手段受諸多因素影響，如飲食、腸道菌群、代謝、遺傳等，全世界總發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增高態(tài)勢(shì)，因此，有效治療藥物的開(kāi)發(fā)具有重要的臨床價(jià)值[11-13]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可反映細(xì)胞發(fā)育、分化、內(nèi)信號(hào)、蛋白質(zhì)相互作用等細(xì)胞內(nèi)部的變化，在細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)和膽固醇合成中也起著重要作用，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是非酒精性脂肪性肝病的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制[14-15]。本課題通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察清肝降濁方對(duì)NAFLD的治療作用，并探討其與ERS 及其誘導(dǎo)的炎癥作用相關(guān)的機(jī)制。

本研究以高脂飲食喂養(yǎng)大鼠，脂代謝為主要調(diào)節(jié)因子，其影響是TC、TG 相應(yīng)變化。結(jié)合表2 和表3，清肝降濁方治療后血清及肝組織中TC、TG 水平均顯著降低，證明清肝降濁方具有調(diào)節(jié)脂代謝的作用；結(jié)合表1 和表2 的結(jié)果，清肝降濁方可降低ALT、AST、AKP、NEFA 水平，可見(jiàn)清肝降濁方調(diào)節(jié)肝脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、增強(qiáng)肝功能；表4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示清肝降濁方具有抗氧化活性，可通過(guò)降低大鼠肝組織MDA 水平，增加SOD 活性等抗氧化酶，改善非酒精性脂肪性肝大鼠肝臟氧化損傷。

PERK/eIF2a/ATF4 信號(hào)通路與NAFLD 形成存在著一定關(guān)系，在緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)代謝的壓力，減少細(xì)胞損傷方面具有重要意義。真核起始因子2a（eukaryotic initiation factor 2a，eIF2a），蛋白激酶介導(dǎo)的eIF2a 磷酸化可以增加ATF4 翻譯，eIF2a 活性降低，可以改善鼠的糖耐量和肝細(xì)胞脂肪變性；活性轉(zhuǎn)錄因子4（activating transcription factor 4，ATF4） 是ERS 細(xì) 胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子之一，ATF4 除參與許多生理病理過(guò)程，可以促進(jìn)脂肪因子的分泌間接調(diào)節(jié)脂代謝；C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP），是ERS 介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，為PERK/eIF2a/ATF4 通路的下游效應(yīng)因子，其蛋白表達(dá)主要以PERK/eIF2a/ATF4 途徑為主，研究證實(shí)阻斷該通路可抑制肝細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)脂肪代謝[16-18]。本研究中，清肝降濁方能降低 NAFLD 模型大鼠中ERS相關(guān)蛋白 ATF4、eIF2a、CHOP 的表達(dá)，這提示清肝降濁方對(duì) NAFLD 的改善作用可能是通過(guò)反饋性抑制ERS，而有利于緩解肝內(nèi)脂代謝紊亂。

中藥治療NAFLD 具有顯著優(yōu)勢(shì)，對(duì)NAFLD 具有治療和預(yù)防雙重作用，可以通過(guò)多種途徑進(jìn)行綜合治療[19-21]。本次研究結(jié)果顯示，清肝降濁方能減少肝臟中過(guò)度沉積的脂質(zhì)，降低血清肝酶、血脂，肝脂，有一定的保護(hù)肝臟、改善脂質(zhì)代謝紊亂的作用；具有改善肝臟氧化應(yīng)激狀態(tài)和脂質(zhì)過(guò)氧化，減輕大鼠肝細(xì)胞脂肪變性的作用；明顯降低大鼠肝臟組織ATF4、eIF2a、CHOP 蛋白表達(dá)量，從而阻斷PERK/eIF2a/ATF4信號(hào)通路的激活，發(fā)揮對(duì)NAFLD 的治療作用，這可能是清肝降濁方防治NAFLD 的機(jī)制之一。