SMYD2介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)小鼠腎成纖維細(xì)胞活化的機(jī)制研究*

左思洋，李霞，陳思羽，陳敏，彭睿，鄒雪，龍合花，楊元，元輝雄，郭兵，趙青青，劉麗榮

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)中心，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究院，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué) 重大疾病發(fā)病機(jī)制研究與藥物防治實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025）

糖尿?。╠iabetes mellitus,DM）已成為全球患病率最高的慢性病之一[1]。國際糖尿病聯(lián)合會(huì)報(bào)告指出，2021年全球DM 患者達(dá)5.37 億，其中我國患者達(dá)1.41 億，且呈快速上升趨勢(shì)[2]。糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease,DKD）是DM 最常見的微血管并發(fā)癥[3]，DKD 是慢性腎臟疾病（chronic kidney disease,CKD）的主要原因[4]。腎纖維化是CKD 進(jìn)展的必經(jīng)之路，未受控制的腎纖維化最終導(dǎo)致CKD 發(fā)展為終末期腎病（end stage renal disease,ESRD）[5]，給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。因此，尋找腎纖維化調(diào)控的有效靶點(diǎn)對(duì)DKD 防治具有重要意義。

腎纖維化的主要病理特征是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）如Ⅰ型膠原蛋白（type Ⅰcollagen,Collagen Ⅰ）、Collagen Ⅲ、纖維連接蛋白（Fibronectin）等的持續(xù)積累和沉積[6]。成纖維細(xì)胞在腎臟進(jìn)行性纖維化和持續(xù)性炎癥中起著至關(guān)重要的作用[7]。在DM 發(fā)展為DKD 的過程中，持續(xù)高血糖可誘導(dǎo)大量活性氧（reactive oxygen species,ROS）形成，加快促炎因子如白細(xì)胞介素-6（Interleukin 6,IL-6）、腫瘤壞死因子- α（tumor necrosis factor,TNF-α）的釋放[8-10]。在高血糖、缺氧和炎癥的刺激下腎成纖維（NRK-49F）細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞[10]，肌成纖維細(xì)胞通過表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α- SMA）及分泌大量的ECM 成分蛋白導(dǎo)致廣泛的腎組織纖維化[11]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）控制多種免疫及炎癥相關(guān)基因，是細(xì)胞生長、分化和凋亡的重要調(diào)節(jié)因子[12]。NF-κB 信號(hào)通路的激活在DKD 的發(fā)生、發(fā)展中起重要調(diào)控作用[13]。研究表明在活化的NRK-49F 細(xì)胞中，NF-κB 信號(hào)通路可通過激活不同路徑，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子和趨化因子釋放[14]。然而NF-κB 信號(hào)通路在DKD 中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2（SET and MYND domain-containing protein 2,SMYD2）是一種含有SET和MYND 結(jié)構(gòu)域的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶[15]，SMYD2可對(duì)組蛋白的不同位點(diǎn)（H3K4、H3K36）進(jìn)行甲基化修飾[16]，也可使非組蛋白如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活轉(zhuǎn)錄因子3、NF-κB p65 和p53 等發(fā)生甲基化而影響細(xì)胞增殖、分化和存活[17]。在多囊腎病基因1 突變小鼠的囊性腎上皮細(xì)胞中，可通過甲基化NF-κB p65 激活SMYD2，影響囊性腎上皮細(xì)胞的增殖和活化[18]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SMYD2 也高表達(dá)于DM 小鼠腎組織[19]，然而SMYD2 在DKD 發(fā)展中確切的作用和分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。因此，本研究基于DM小鼠模型和細(xì)胞模型，旨在探究SMYD2 是否可介導(dǎo)高糖環(huán)境下NRK-49F 細(xì)胞的活化及可能機(jī)制，為DKD 防治靶點(diǎn)的相關(guān)研究提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、主要試劑及儀器

10 只SPF 級(jí)健康雄性C57BL6 小鼠，體重（180±20）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2014-004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（黔）2018-0001。

DMEM 正常糖培養(yǎng)基（含1 g/L 葡萄糖）、DMEM高糖培養(yǎng)基（含4.5 g/L 葡萄糖）、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）均購自美國Invitrogen Gibco公司，胰酶消化液、青鏈霉素混合液（雙抗）均購自以色列Biological Industries 生物科技公司，SMYD2 特異性抑制劑AZ505 購自美國APExBIO 公司，ECL 發(fā)光試劑盒購自常州天地人和生物科技有限公司，蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin,HE）試劑盒、Masson 三色染色改良試劑盒、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、CCK-8試劑盒、高效RIPA 裂解液、抗熒光衰減封片劑、牛血清白蛋白封閉液（5% BSA）均購自北京索萊寶科技有限公司，F(xiàn)ibronectin（ab2413）兔多克隆抗體、H3K4me3（ab8580）兔單克隆抗體、H3（ab1791）兔單克隆抗體均購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，α-SMA（14395-1-AP）兔單克隆抗體、Collagen Ⅰ（14695-1-AP）兔多克隆抗體、SMYD2（21290-1-AP）兔單克隆抗體均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，NF-κB p65（D14E12）兔單克隆抗體、Phospho-NFκB p65（Ser536）（93H1）兔單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司，SMYD2（sc393827）鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology 生物技術(shù)公司，β-actin（PMK058S）兔單克隆抗體、HRP 山羊標(biāo)記抗兔/鼠二抗購自武漢普美克生物技術(shù)有限公司。

Cobas 8000 型全自動(dòng)生化分析儀購自瑞士羅氏公司，Axio Imager.A2 型光學(xué)顯微鏡購自德國ZEISS公司。

1.2 方法

1.2.1 模型復(fù)制及分組SPF 級(jí)小鼠隨機(jī)分為正常（NC）組和糖尿?。―M）組，各5只。DM組按55.0 mg/kg劑量腹腔注射STZ 復(fù)制模型，1 次/周，連續(xù)5 周，48 h后小鼠尾靜脈取血監(jiān)測(cè)隨機(jī)血糖，血糖＞16.7 mmol/L判定為模型復(fù)制成功；NC 組給予相同劑量生理鹽水。兩組小鼠喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，于模型復(fù)制28 周后處死。小鼠處死前6 h 禁食不禁水，麻醉后，眼球摘除法取血，以4 000 r/min 離心5 min，分離血清，置于-80 ℃冰箱冷凍保存。將腎臟組織對(duì)半分開，一半浸泡于4%的多聚甲醛，另一半保存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)生化指標(biāo)采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組小鼠血糖（blood glucose,BG）、血肌酐（serum creatinine,Scr）水平。

1.2.3 HE、Masson染色觀察腎臟病理改變腎組織經(jīng)4%中性甲醛固定后，石蠟包埋切片（3 μm 厚），采用HE、Masson 染色進(jìn)行觀察。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)小鼠NRK-49F 細(xì)胞在5% FBS、1% 青鏈霉素混合液的DMEM 低糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，細(xì)胞生長密度達(dá)90%時(shí)使用胰酶消化液進(jìn)行消化并傳代。

1.2.5 高糖培養(yǎng)基（high glucose,HG）不同時(shí)間點(diǎn)刺激NRK-49F 細(xì)胞活化將NRK-49F 細(xì)胞按1.5×109個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)6 孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)60%時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行24 h 無血清饑餓處理。在0、6、12、24、36 和48 h 逐次加入HG 培養(yǎng)基（含0.5% FBS、1%青鏈霉素混合液）在37 ℃、含5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，陰性對(duì)照組加正常糖（normal glucose，NG）培養(yǎng)基（含0.5% FBS、1%青鏈霉素混合液），在37 ℃、二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。處理完后，棄培養(yǎng)上清液、收集細(xì)胞、提取細(xì)胞蛋白待測(cè)。

1.2.6 CCK-8 法檢測(cè)AZ505 對(duì)NRK-49F 細(xì)胞毒性將NRK-49F 細(xì)胞按照1.0×103個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于96 孔板中，在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，再進(jìn)行24 h 無血清饑餓處理。根據(jù)AZ505的作用濃度依次分為0.000 μmol/L 組、0.156 μmol/L組、0.313 μmol/L 組、0.625 μmol/L 組、1.250 μmol/L組、2.500 μmol/L 組、5.000 μmol/L 組、10.000 μmol/L組、20.000 μmol/L 組、40.000 μmol/L 組、60.000 μmol/L組，每個(gè)濃度設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。處理48 h 后，棄原培養(yǎng)基，將CCK-8 試劑與培養(yǎng)基按1∶9 混合后加入各孔，于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育2 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處的吸光度值，計(jì)算不同藥物濃度作用下的細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）=[（實(shí)驗(yàn)組-空白組）/（對(duì)照組-空白組）]×100%。

1.2.7 Western blotting 檢測(cè)蛋白表達(dá)利用細(xì)胞刮刮取各組細(xì)胞、重懸于RIPA（與蛋白酶抑制劑PMSF 按照100∶1 混合）蛋白裂解緩沖液，超聲提取蛋白并高速離心獲取蛋白上清液。使用BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度。與上樣緩沖液（5×loading buffer，含二硫蘇糖醇）混合后于100 ℃變性10 min，樣本立即點(diǎn)泳或冷凍于-20 ℃。配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠[10%的聚丙烯酰胺分離膠（10 mL）：4.1 mL 超純水+3.3 mL 30%丙烯酰胺+ 2.5 mL 1.5M Tris（pH 8.8）+ 0.1 mL 10%SDS +0.1 mL 10%過硫酸銨+ 6 μL 促凝劑；5%聚丙烯酰胺濃縮膠（4 mL）：2.6 mL 超純水+ 1.0 mL 30%丙烯酰胺+ 1.3 mL 1.5 mmol/L Tris（pH 6.8）+ 50 μL 10% SDS + 50 μL 10%過硫酸銨+ 4 μL 促凝劑]，將等質(zhì)量的蛋白樣本加至各泳道，電泳結(jié)束后將蛋白由凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。使用5%脫脂牛奶常溫封閉PVDF 膜1 h。將PVDF 膜與蛋白Fibronectin（1∶5 000）、CollagenⅠ（1∶1 000）、α-SMA（1∶1 000）、SMYD2（1∶2 000）、H3K4me3（1∶1 000）、H3（1∶5 000）、NF-κB p-p65（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶1 000）和β-actin（1∶5 000）一抗于4 ℃搖晃孵育過夜，H3K4me3 蛋白以H3 為內(nèi)參，其余蛋白以β-actin為內(nèi)參。TBST 洗膜3 次，將PVDF 膜與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗搖晃孵育1 h。TBST 洗膜3 次，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光溶液和凝膠成像儀系統(tǒng)顯影、檢測(cè)蛋白印跡條帶，使用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度。

1.2.8 明確AZ505作用濃度并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證根據(jù)CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇對(duì)NRK-49F 細(xì)胞毒性較小濃度（2.500、5.000、10.000 和20.000 μmol/L）的AZ505 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，經(jīng)Western blotting 明確AZ505 抑制HG 誘導(dǎo)NRK-49F 細(xì)胞活化的作用濃度，并取AZ505作用濃度為20.000 μmol/L 用于實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。將細(xì)胞分為NG 組、NG + AZ505 組、HG 組、HG + AZ505 組。NG 培養(yǎng)基和HG 培養(yǎng)基均含0.5% FBS、1%青鏈霉素混合液。處理48 h 后，收集細(xì)胞、提取細(xì)胞蛋白，經(jīng)Western bloting 明確AZ505 對(duì)HG 誘導(dǎo)NRK-49F 細(xì)胞活化的抑制作用。

1.2.9 免疫熒光檢測(cè)腎組織用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋后切片（厚3 μm），脫蠟后用EDTA（pH 9.0）進(jìn)行抗原修復(fù)；用預(yù)熱的4% 多聚甲醛固定NRK-49F 細(xì)胞30 min，隨后用溶解于PBS 的0.5%Triton X-100 通透10 min，5% BSA 常溫封閉1 h，滴加一抗并于4 ℃孵育過夜，使用以下蛋白的一抗：鼠抗SMYD2（1∶200）、兔抗NF-κB p-p65（1∶300）、兔抗α-SMA（1∶300）。孵育結(jié)束后，PBS 洗滌3 次，5 min/次。將樣本與Alexa Flour Plus 488/555 熒光二抗（1∶200）常溫避光孵育1 h。PBS 洗滌3 次后，用抗熒光淬滅封片劑封片，立即使用光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 9.2 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HG誘導(dǎo)NRK-49F細(xì)胞活化

NC 組與DM 組小鼠血清BG、Scr 水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），DM 組高于NC 組。見表1。

表1 NC組與DM組小鼠血清BG、Scr水平比較（n=5，±s）

表1 NC組與DM組小鼠血清BG、Scr水平比較（n=5，±s）

組別NC組DM組t 值P 值BG/（mol/L）8.33±1.70 30.49±4.41 10.480 0.000 Scr/（μmol/L）5.98±1.47 11.00±0.71 6.899 0.000

2.2 NC 組與DM 組小鼠腎組織HE、Masson 染色

高倍鏡下觀察可見DM 組小鼠腎小管排列紊亂，部分腎間質(zhì)可見炎癥細(xì)胞浸潤且出現(xiàn)明顯的藍(lán)染的膠原纖維沉積，NC 組小鼠腎組織無明顯病理改變。見圖1。

圖1 NC組與DM組小鼠腎組織HE、Masson染色

2.3 DM 組與NC 組小鼠腎組織α-SMA、CollgenⅠ、Fibronectin、SMYD2、H3K4me3、NF-κB p65、NF-κB p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

DM 組與NC 組小鼠腎組織α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin、SMYD2、H3K4me3、NF-κB p-p65 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），DM 組高于NC 組。兩組NF-κB p65 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2 和表2。

圖2 各組小鼠腎組織各蛋白條帶圖

表2 DM組與NC組小鼠腎組織α-SMA、Collgen Ⅰ、Fibronectin、SMYD2、H3K4me3、NF-κB p65、NF-κB p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=5，±s）

表2 DM組與NC組小鼠腎組織α-SMA、Collgen Ⅰ、Fibronectin、SMYD2、H3K4me3、NF-κB p65、NF-κB p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=5，±s）

組別NC組DM組t 值P 值α-SMA 0.46±0.09 0.99±0.16 4.981 0.008 CollagenⅠ0.26±0.08 1.26±0.17 9.490 0.000 Fibronectin 0.31±0.11 0.74±0.88 5.356 0.006 SMYD2 0.52±0.09 0.89±0.21 2.813 0.048 H3K4me3 0.59±0.24 1.14±0.20 2.998 0.040 NF-κB p65 1.67±0.31 1.64±0.09 0.352 0.742 NF-κB p-p65 0.38±0.07 1.19±0.17 12.420 0.000

免疫熒光結(jié)果示，高倍鏡下觀察可見α-SMA、SMYD2 在NC 組小鼠腎組織低表達(dá)，但在DM 組小鼠腎組織中高表達(dá)。見圖3。

圖3 各組小鼠腎組織免疫熒光檢測(cè)α-SMA、SMYD2定位圖

2.4 HG 刺激不同時(shí)間點(diǎn)NRK-49F 細(xì)胞α-SMA、Collagen I、Fibronectin、SMYD2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

HG 刺激小鼠0、6、12、24、36、48 h NRK-49F 細(xì)胞α-SMA、Collagen I、Fibronectin、SMYD2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3 和圖4。

圖4 HG刺激不同時(shí)間點(diǎn)NRK-49F細(xì)胞α-SMA、Collagen I、Fibronectin、SMYD2蛋白條帶圖

表3 HG刺激不同時(shí)間點(diǎn)NRK-49F細(xì)胞α-SMA、Collagen I、Fibronectin、SMYD2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=3，±s）

表3 HG刺激不同時(shí)間點(diǎn)NRK-49F細(xì)胞α-SMA、Collagen I、Fibronectin、SMYD2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=3，±s）

注：①與0 h比較，P＜0.05；②與6 h比較，P＜0.05；③與12 h比較，P＜0.05。

SMYD2 0.65±0.08 0.79±0.07 0.75±0.11 0.69±0.04 1.01±0.15①1.08±0.07①②③11.190 0.000時(shí)間0 h 6 h 12 h 24 h 36 h 48 h F 值P 值α-SMA 0.38±0.05 0.33±0.04 0.38±0.09 0.68±0.08①②0.67±0.08①②0.72±0.03①②③22.240 0.000 CollagenⅠ0.31±0.17 0.38±0.09 0.41±0.09 0.86±0.19①②③0.99±0.15①②③1.04±0.11①②③17.510 0.000 Fibronectin 0.23±0.06 0.24±0.08 0.21±0.07 0.58±0.11①②③0.67±0.08①②③0.73±0.09①②③25.210 0.000

2.5 不同AZ505 的作用濃度組NRK-49F 細(xì)胞存活率比較

0.000 μmol/L 組、0.156 μmol/L 組、0.313 μmol/L組、0.625 μmol/L 組、1.250 μmol/L 組、2.500 μmol/L組、5.000 μmol/L 組、10.000 μmol/L 組、20.000 μmol/L組、40.000 μmol/L 組和60.000 μmol/L 組小鼠NRK-49F 細(xì)胞存活率分別為（100.00±0.00）%、（96.34±1.82）%、（88.47±1.44）%、（86.73±1.33）%、（83.71±1.29）%、（81.15±2.34）%、（81.15±2.48）%、（77.77±2.16）、（71.91±5.39）% 、（23.24±1.52）% 、（0.09±0.16）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=385.000，P=0.000）。40.000 μmol/L 組、60.000 μmol/L組較0.000 μmol/L 組低（P＜0.05）。

2.6 AZ505可抑制HG誘導(dǎo)的NRK-49F細(xì)胞活化

NG 組、HG 組、HG + AZ505（2.500 μmol/L）組、HG + AZ505（5.000 μmol/L）組、HG + AZ505（10.000 μmol/L）組、HG+AZ505（20.000 μmol/L）組小鼠NRK-49F 細(xì)胞Fibronectin、CollagenⅠ、SMYD2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HG 組較NG 組高（P＜0.05），HG +AZ505（20.000 μmol/L）組較HG 組低（P＜0.05），后續(xù)采用20.000 μmol/L AZ505 作用濃度用于實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。見表4 和圖5A。

圖5 各組小鼠NEK49F細(xì)胞的蛋白條帶圖

表4 各組小鼠NEK49F細(xì)胞Fibronectin、CollagenⅠ、SMYD2蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（n=3，±s）

表4 各組小鼠NEK49F細(xì)胞Fibronectin、CollagenⅠ、SMYD2蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（n=3，±s）

組別NG組HG組HG+AZ505（2.500 μmol/L）組HG+AZ505（5.000 μmol/L）組HG+AZ505（10.000 μmol/L）組HG+AZ505（20.000 μmol/L）組F 值P 值Fibronectin 0.40±0.05 0.97±0.13 0.94±0.11 CollagenⅠ0.52±0.05 1.08±0.09 0.90±0.16 SMYD2 0.67±0.12 1.04±0.17 0.81±0.07 0.70±0.17 0.87±0.09 0.75±0.09 0.71±0.15 0.90±0.13 0.54±0.07 0.66±0.16 7.228 0.003 0.64±0.12 9.572 0.000 0.37±0.13 12.420 0.000

20 μmol/L AZ505 干預(yù)后，NG 組、NG + AZ505 組、HG 組、HG + AZ505 組小鼠 NRK-49F 細(xì)胞Fibronectin、Collagen Ⅰ、α-SMA、H3K4me3、SMYD2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HG 組較NG 組高（P＜0.05），HG + AZ505 組較HG 組低（P＜0.05）。見表5和圖5B。

表5 各組小鼠NRK49F細(xì)胞α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin、H3K4me3、SMYD2蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（n=3，±s）

表5 各組小鼠NRK49F細(xì)胞α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin、H3K4me3、SMYD2蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（n=3，±s）

注：①與NG組比較，P＜0.05；②與NG+AZ505組比較，P＜0.05；③與HG組比較，P＜0.05。

SMYD2 0.61±0.08 1.06±0.04①②0.57±0.03 0.66±0.08③35.190 0.010組別NG組HG組NG + AZ505組HG + AZ505組F 值P 值α-SMA 0.63±0.28 1.39±0.22①②0.51±0.11 0.49±0.25③10.870 0.003 CollagenⅠ0.56±0.17 1.12±0.10①②0.44±0.07 0.86±0.08③23.060 0.000 Fibronectin 0.55±0.09 1.15±0.05①②0.57±0.06 0.64±0.12③33.270 0.000 H3K4me3 0.28±0.07 0.95±0.09①②0.44±0.16②0.27±0.12③23.490 0.000

2.7 各組小鼠NRK49F 細(xì)胞SMYD2 和α-SMA、SMYD2和NF-κB p-p65免疫熒光共定位

NG 組、NG + AZ505 組、HG 組、HG + AZ505 組小鼠NRK-49F 細(xì)胞SMYD2 和α-SMA、SMYD2 和NFκB p-p65 免疫熒光共定位結(jié)果示，高倍鏡下可見靜息狀態(tài)下，SMYD2 主要表達(dá)在細(xì)胞核、α-SMA 主要表達(dá)細(xì)胞質(zhì)；HG 刺激后，兩者的定位未發(fā)生改變但熒光強(qiáng)度均增加。靜息狀態(tài)下，NF-κB p-p65 主要表達(dá)細(xì)胞質(zhì)，HG 刺激后，NF-κB p-p65 在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有表達(dá)，即SMYD2 和NF-κB p-p65 在細(xì)胞核存在共定位，且兩者的熒光強(qiáng)度均增強(qiáng)，以上現(xiàn)象均可被AZ505 抑制。見圖6。

圖6 各組小鼠NRK49F細(xì)胞SMYD2和α-SMA、SMYD2和NF-κB p-p65免疫熒光共定位

2.8 各組小鼠NRK-49F 細(xì)胞NF-κB p65、NFκB p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

NG 組、NG + AZ505 組、HG 組、HG + AZ505 組小鼠NRK-49F 細(xì)胞NF-κB p-p65 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HG 組較NG 組高（P＜0.05），HG + AZ505組較HG 組低（P＜0.05）。各組小鼠NRK-49F 細(xì)胞NF-κB p65 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表6和圖7。

表6 各組小鼠NRK-49F細(xì)胞NF-κB p65、NF-κB p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=3，±s）

表6 各組小鼠NRK-49F細(xì)胞NF-κB p65、NF-κB p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=3，±s）

注：①與NG 組比較，P＜0.05；②與NG+AZ505 組比較，P＜0.05；③與HG組比較，P＜0.05。

NF-κB p-p65組別NF-κB p65 0.42±0.29 1.11±0.18①②0.65±0.07 0.52±0.25③6.027 0.019 NG組HG組NG+AZ505組HG+AZ505組F 值P 值1.09±0.14 1.06±0.15 0.99±0.19 1.31±0.20 1.904 0.208

3 討論

腎纖維化是CKD 向ESRD 轉(zhuǎn)化的共同途徑[20]，ECM 成分蛋白的過度沉積及瘢痕形成是進(jìn)行性腎纖維化的主要病理事件[21]。肌成纖維細(xì)胞是腎纖維化的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞[22]；在各種慢性損傷的作用下，肌成纖維細(xì)胞通過分泌CollagenⅠ、CollagenⅢ、CollagenⅣ、Fibronectin 和層黏連蛋白發(fā)揮其促纖維化功能[23]。肌成纖維細(xì)胞來源包括NRK-49F 細(xì)胞、周細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等，其中NRK-49F 細(xì)胞活化是肌成纖維細(xì)胞的主要來源[24-25]。研究表明，在DKD進(jìn)程中NRK-49F 細(xì)胞活化不僅受多種生長因子及細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)控，如血管緊張素Ⅱ、轉(zhuǎn)化生子因子-β 及磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B 等[26]；還受表觀遺傳學(xué)的調(diào)控，如染色質(zhì)組蛋白修飾、DNA 甲基化及非編碼RNA 等，在DKD 的發(fā)病機(jī)制中也起關(guān)鍵作用[27]，然而表觀遺傳調(diào)控在腎成纖維活化中的作用還有待進(jìn)一步闡明。

SMYD2 是研究最廣泛的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶之一，在胃癌、膀胱癌、結(jié)腸癌及乳腺癌等患者中高表達(dá)[28]；盡管一些研究已經(jīng)報(bào)道SMYD2 在許多腫瘤中的作用和功能，但其在DKD 進(jìn)展中的作用尚未明確。本研究結(jié)果中，與NC 組相比，DM 組可誘導(dǎo)小鼠腎組織損傷、腎纖維化指標(biāo)（Fibronectin、CollagenⅠ）、肌成纖維細(xì)胞活化標(biāo)志物（α-SMA）、SMYD2 及其組蛋白甲基化底物（H3K4me3）、NF-κB p65 亞基磷酸化表達(dá)增高，表明DM 組小鼠腎組織損傷且腎臟纖維化、肌成纖維細(xì)胞活化可能與SMYD2表達(dá)增高及NF-κB 激活有關(guān)。在體外使用HG 刺激NRK-49F 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，HG 可誘導(dǎo)NRK-49F 細(xì)胞活化伴SMYD2 表達(dá)上調(diào)；應(yīng)用SMYD2 特異性抑制劑AZ505 可抑制HG 誘導(dǎo)的NRK-49F 細(xì)胞內(nèi)SMYD2、ECM 成分蛋白及α-SMA 表達(dá)，提示SMYD2 可能介導(dǎo)HG 誘導(dǎo)的NRK-49F 細(xì)胞活化。

炎癥反應(yīng)在腎纖維化進(jìn)展中具有重要作用，NF-κB 作為炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[29]，在腎臟纖維化中NF-κB 激活可通過誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、激活腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞及影響炎癥因子釋放等方式調(diào)控其發(fā)生、發(fā)展[30-31]。SMYD2 作為組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶也可甲基化非組蛋白（如NF-κB），從而調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖、凋亡[32-33]。在三陰性乳腺癌細(xì)胞系中SMYD2 可通過協(xié)同甲基化和激活NF-κB，使NFκB p65 發(fā)生甲基化和磷酸化，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和活化[32]。研究表明，SMYD2 可促進(jìn)NF-κB p65磷酸化，SMYD2 過表達(dá)可激活細(xì)胞中的NF-κB 信號(hào)通路，從而促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的釋放[33]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用SMYD2 特異性抑制劑AZ505 可下調(diào)單側(cè)輸尿管閉塞小鼠模型中小鼠腎臟中腎纖維化指標(biāo)的蛋白表達(dá)，AZ505 或其特異性siRNA 抑制SMYD2 可抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1 培養(yǎng)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞中蛋白的表達(dá)，明確了SMYD2 是腎纖維化及NRK-49F 細(xì)胞活化中的重要介質(zhì)[34]。然而SMYD2 通過NF-κB 信號(hào)通路的激活如何調(diào)控DKD腎纖維化仍有待進(jìn)一步明確。為評(píng)估SMYD2 介導(dǎo)HG 誘導(dǎo)的NRK-49F 細(xì)胞活化中的可能機(jī)制，本研究經(jīng)免疫熒光檢測(cè)NF-κB p-p65 和SMYD2 在NRK-49F 細(xì)胞共定位及Western blotting 檢測(cè)NF-κB p65總蛋白及磷酸化蛋白水平，發(fā)現(xiàn)AZ505 可抑制NFκB p-p65 由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核、并抑制其表達(dá)上調(diào)，提示SMYD2 可能通過調(diào)控NF-κB p65 磷酸化介導(dǎo)HG 誘導(dǎo)的腎臟成纖維細(xì)胞活化。

綜上所述，SMYD2 特異性抑制劑AZ505 可抑制HG 誘導(dǎo)的NRK-49F 細(xì)胞活化，其機(jī)制可能與抑制NF-κB 細(xì)胞信號(hào)通路激活相關(guān)，提示SMYD2 可能通過調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路激活介導(dǎo)HG 誘導(dǎo)的NRK-49F 細(xì)胞活化。然而在DKD 的發(fā)展中，SMYD2 如何調(diào)控NF-κB 細(xì)胞信號(hào)通路及可能涉及到的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究，也是本課題組接下來的研究重點(diǎn)。