混菌液態(tài)發(fā)酵對(duì)提高柿子酒品質(zhì)的研究

羅澤宇,李 晴,劉秀河

齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 食品科學(xué)與工程學(xué)部,山東 濟(jì)南 250353

柿子是我國(guó)常見(jiàn)水果之一,每年霜降時(shí)分成熟[1]。目前全球?qū)κ磷拥难芯恐?發(fā)現(xiàn)了多種活性成分,包括糖類、黃酮類、果膠、單寧、氨基酸等,可廣泛應(yīng)用于多領(lǐng)域[2]。柿子除鮮食外,加工方式主要為柿餅[3],柿餅制作繁雜,市場(chǎng)份額較小。由于柿子收獲期短,采摘成本較為昂貴,目前柿子經(jīng)濟(jì)效益較低,果農(nóng)種植積極性不高[4]。

果酒與白酒相比,具有酒精體積分?jǐn)?shù)低、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高和帶有水果香氣的優(yōu)勢(shì)[5]。適量飲用果酒可令人產(chǎn)生愉悅感,對(duì)身體健康也十分有益[6]。目前酒類釀造方式多采用固態(tài)發(fā)酵,但固態(tài)發(fā)酵影響因素多,且出酒率低[7]。液態(tài)發(fā)酵與固態(tài)發(fā)酵相比,具有參數(shù)準(zhǔn)確、周期短、操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)效率高等優(yōu)勢(shì)[8]。

由于柿子中含有的豐富單寧會(huì)造成發(fā)酵不完全,導(dǎo)致發(fā)酵酒酒精體積分?jǐn)?shù)較低,且風(fēng)味不佳。所以需要研究適合柿子釀造的混菌來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)發(fā)酵[9]。劉曉艷[10]等人采用果酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵的方法,將果酒酵母和安琪干酵母按照1∶1混合,5%接種。研究發(fā)現(xiàn),混菌發(fā)酵對(duì)柿子酒口感風(fēng)味有明顯改善,制成的柿子酒中乙醇含量及酯類物質(zhì)皆高于單獨(dú)菌種發(fā)酵的柿子酒[11-13]。非釀酒酵母也有不利方面,荊雄[14]將兩種非釀酒酵母用于柿子酒發(fā)酵,結(jié)果表明非釀酒酵母發(fā)酵性能較弱,在發(fā)酵前期對(duì)釀酒酵母產(chǎn)生不利影響。

本研究以柿子為主要原料釀造生產(chǎn)柿子酒,對(duì)三種菌種比例及柿子酒發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化,確定柿子酒最佳發(fā)酵工藝參數(shù),并用GC-MS檢測(cè)混菌發(fā)酵與單菌發(fā)酵香氣成分的差異,以改善柿子口感及風(fēng)味。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柿子:濟(jì)南市長(zhǎng)清區(qū);釀酒高活性干酵母(LALVIN EC1118,EC):上?？奠称凤嫎I(yè)有限公司;安琪黃酒高活性干酵母(Saccharomyces cerevisiae,Aq):安琪酵母股份有限公司;釀酒酵母(S.cerevisiae,F33):法國(guó)LAFFORT公司;果膠酶:濟(jì)南百斯杰生物工程有限公司;檸檬酸、蔗糖、偏重亞硫酸鈉:天津市登峰化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

還原糖測(cè)定儀 (SGD-IV),山東省科學(xué)院生物研究所;數(shù)顯恒溫水浴鍋(DK-98-IIA),金壇市金南儀器廠;pH計(jì)(PHS-25),山海精密科學(xué)儀器有限公司;氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(TSQ8000evo),賽默飛世爾科技公司;可見(jiàn)分光光度計(jì)(V-1100D),上海美譜達(dá)儀器有限公司;立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-50KB),上海申安醫(yī)療器械廠;隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9270),上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司;其他儀器為實(shí)驗(yàn)室常用儀器。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

柿子酒釀造工藝流程見(jiàn)圖1。

圖1 柿子酒釀造工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

冷凍脫澀柿子解凍,去蒂、清洗干凈,進(jìn)行打漿。漿液添加果膠酶1.6 g/kg,43 ℃處理3 h,過(guò)濾取汁,加入50 mg/kg偏重亞硫酸鈉。檸檬酸液調(diào)節(jié)pH,蔗糖調(diào)整糖度,加入復(fù)合酵母進(jìn)行混菌液態(tài)發(fā)酵,發(fā)酵完成后,低溫過(guò)濾,陳釀30 d,過(guò)濾包裝滅菌即得成品。

1.3.3 混菌比例對(duì)CO2失重量及殘?zhí)堑挠绊?/p>

經(jīng)Design-expert設(shè)計(jì)生成Aq酵母、EC酵母和F33酵母的混和比例,通過(guò)CO2失重量判定混菌發(fā)酵速率,殘?zhí)桥袛嗷炀眯?最終獲得最佳混菌比例。

1.3.4 柿子混菌發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)

分別以不同的混菌接種量(0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 g/kg)、初始糖度(20%、21%、22%、23%、24%)、發(fā)酵溫度(18、20、22、24、26 ℃)、發(fā)酵時(shí)間(0、2、4、6、8、10 d)、pH(3.4、3.6、3.8、4.0、4.2)作為單因素,以酒精體積分?jǐn)?shù)及殘?zhí)亲鳛橹饕笜?biāo),為下一步響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化試驗(yàn)提供理論依據(jù)。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在混菌發(fā)酵單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,通過(guò)Box-Benhnken進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以初始糖度(A)、混菌添加量(B)、發(fā)酵溫度(C)為響應(yīng)變量,以感官評(píng)價(jià)為響應(yīng)值,得出響應(yīng)面設(shè)計(jì)最優(yōu)值。因素水平表見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)因素與水平表

1.3.6 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)分析方法

(1)殘?zhí)呛康臏y(cè)定:用還原糖測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定。

(2)酒精含量的測(cè)定:采用比色法進(jìn)行測(cè)定[15]。

(3)CO2失重量的測(cè)定:每隔12 h稱重,相鄰2次的質(zhì)量差值。

1.3.7 柿子酒香氣成分檢測(cè)方法

SPME萃取條件:萃取頭于頂空瓶吸附40 min,之后在氣相色譜進(jìn)樣口280 ℃解析5 min。

GC-MS條件:GC條件為升溫程序?yàn)?0 ℃保持10 min,以3 ℃/min升至100 ℃,再以4 ℃/min升至180 ℃,最后以6 ℃/min升溫至220 ℃。載氣為He,體積流量為1 mL/min,分流進(jìn)樣。MS條件為傳輸線溫度280 ℃,電離方式為EI,70 eV,掃描范圍為全掃描。

1.3.8 柿子酒感官評(píng)價(jià)方法

由表2對(duì)柿子酒進(jìn)行感官評(píng)價(jià),評(píng)價(jià)小組由10名同學(xué)組成,5男5女,年齡在18～26歲之間,分別對(duì)柿子酒的色澤、口感、香氣、余味進(jìn)行評(píng)價(jià),每個(gè)樣品重復(fù)評(píng)價(jià)3次。

表2 柿子酒感官評(píng)價(jià)表

2 結(jié)果與分析

2.1 混菌比例對(duì)CO2失重量及殘?zhí)堑挠绊?/h3>

從表3中可以明顯看出,混菌發(fā)酵對(duì)于柿子酒發(fā)酵速率影響較大,與單菌種發(fā)酵相比,混菌發(fā)酵后,發(fā)酵速率均有增長(zhǎng)。其中,4∶4∶7、 3∶1∶1、 1∶1∶1三種比例的CO2失重量均達(dá)到10 g以上,發(fā)酵力較好。從殘?zhí)墙Y(jié)果分析,4∶4∶7殘?zhí)侵底钚?說(shuō)明柿子中糖分轉(zhuǎn)化較徹底,因此EC酵母、Aq酵母和F33酵母的比例為4∶4∶7時(shí),最適宜柿子發(fā)酵體系。

表3 混菌比例優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

表3(續(xù))

2.2 混菌發(fā)酵單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 混菌接種量對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)及殘?zhí)堑挠绊?/p>

由圖2可以看出,當(dāng)混菌添加量<0.30 g/kg時(shí),酒精體積分?jǐn)?shù)隨著添加量的增加而增長(zhǎng),說(shuō)明適當(dāng)?shù)脑黾泳N添加量,增大了發(fā)酵體系中糖分轉(zhuǎn)化為酒精的速率。當(dāng)混菌添加量>0.30 g/kg時(shí),酒精體積分?jǐn)?shù)隨著添加量的增加而減小,由于混菌的過(guò)量添加,使得大量糖分被用于混菌生長(zhǎng)增殖,使得用于酒精發(fā)酵的糖含量比例減少,從而導(dǎo)致酒精體積分?jǐn)?shù)下降。因此選擇0.3 g/kg為較佳混菌接種量。

圖2 混菌接種量對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)及殘?zhí)堑挠绊?/p>

2.2.2 初始糖度對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)及殘?zhí)堑挠绊?/p>

由圖3可以看出,當(dāng)初始糖度<23%時(shí),隨著初始糖度的增加,酒精體積分?jǐn)?shù)增長(zhǎng)趨勢(shì),說(shuō)明發(fā)酵體系糖度過(guò)低,導(dǎo)致柿子酒酒精體積分?jǐn)?shù)偏低,發(fā)酵風(fēng)味不明顯。在初始糖度>23%時(shí),隨著糖度的增加,酒精體積分?jǐn)?shù)變化微弱,且對(duì)應(yīng)殘?zhí)窃鲩L(zhǎng)明顯,這是由于混菌發(fā)酵能力有限,導(dǎo)致發(fā)酵體系內(nèi)糖分未能被完全利用,且較高糖度也會(huì)抑制混菌的生長(zhǎng)代謝。因此最佳初始糖度為23%。

圖3 初始糖度對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)及殘?zhí)堑挠绊?/p>

2.2.3 溫度對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)及殘?zhí)堑挠绊?/p>

由圖4可以看出,對(duì)不同發(fā)酵溫度的柿子酒進(jìn)行酒精體積分?jǐn)?shù)及殘?zhí)菧y(cè)定,隨著發(fā)酵溫度的增加,酒精體積分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)。溫度是影響柿子酒品質(zhì)的重要因素,當(dāng)溫度>20 ℃時(shí),酒精體積分?jǐn)?shù)隨著溫度的增加而減小,溫度過(guò)高會(huì)使得混菌代謝速率加快,縮短壽命,不利于混菌發(fā)酵的進(jìn)程。在20 ℃時(shí),酒精體積分?jǐn)?shù)達(dá)到最高值,為11.14%,對(duì)應(yīng)殘?zhí)菫?.53 g/L。因此選擇最佳發(fā)酵溫度為20 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)及殘?zhí)堑挠绊?/p>

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)及殘?zhí)堑挠绊?/p>

由圖5可以看出,對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間的柿子酒進(jìn)行酒精體積分?jǐn)?shù)及殘?zhí)菧y(cè)定,在0～4 d,酒精體積分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)趨勢(shì),殘?zhí)强焖傧陆?說(shuō)明在此期間,混菌迅速生長(zhǎng)繁殖,柿子中糖分被迅速利用,因此酒精生成速率較快。在6～10 d,酒精體積分?jǐn)?shù)趨于平穩(wěn),8 d后殘?zhí)亲兓⑷?說(shuō)明混菌基本停止進(jìn)行生長(zhǎng)。因此選擇發(fā)酵時(shí)間為8 d。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)及殘?zhí)堑挠绊?/p>

2.2.5 pH對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)及殘?zhí)堑挠绊?/p>

由圖6可以看出,對(duì)不同pH的柿子酒進(jìn)行酒精體積分?jǐn)?shù)及殘?zhí)菧y(cè)定,在pH<3.8時(shí),酒精體積分?jǐn)?shù)隨著pH的增長(zhǎng)而增大,在pH為3.8時(shí)酒精體積分?jǐn)?shù)最高,為10.18%,對(duì)應(yīng)殘?zhí)菫?.016 g/L。pH>3.8時(shí),酒精體積分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì),說(shuō)明柿子酒發(fā)酵過(guò)程中,微酸性條件下更適宜混菌的生長(zhǎng)繁殖,有利于發(fā)酵的進(jìn)行。因此選擇pH=3.8為最適發(fā)酵pH。

圖6 pH對(duì)酒精體積分?jǐn)?shù)及殘?zhí)堑挠绊?/p>

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

使用Design Expert軟件對(duì)3個(gè)顯著性因素水平設(shè)計(jì),并進(jìn)行試驗(yàn),表4為Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)表與試驗(yàn)結(jié)果,表5為方差結(jié)果。

表4 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

使用Design Expert軟件對(duì)表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析,得到二次回歸模型方差分析結(jié)果,如表5所示,得到二次回歸分析的相關(guān)數(shù)據(jù)。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)擬合分析并獲得二次多項(xiàng)擬合回歸方程:Y=87.4+2.68A+1.14B+0.76C-0.17AB+0.48AC-0.45BC-3.45A2-8.83B2-2.47C2。

對(duì)柿子酒感官評(píng)價(jià)的回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果如表5所示,得到回歸模型極顯著(P=0.000 2),失擬相不顯著(P=0.469 2>0.05),其中方程中二次項(xiàng)C2影響顯著(P<0.05),一次項(xiàng)A、二次項(xiàng)A2和二次項(xiàng)B2影響極顯著(P≤0.01)。同時(shí)從表中F值可知,在三個(gè)因素中初始糖度(A)對(duì)感官評(píng)價(jià)影響最大,發(fā)酵溫度(C)對(duì)感官評(píng)價(jià)影響最小。此外,模型相關(guān)系數(shù)R2=0.97,校正系數(shù)RAdj2=0.92,且模型變異系數(shù)(αC.V=1.96%)較低。這說(shuō)明該回歸模型的誤差低,具有較高的可信度和擬合度,實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性較好。

對(duì)二次多項(xiàng)擬合回歸方程進(jìn)行求解可以得到混菌發(fā)酵生產(chǎn)柿子酒的最優(yōu)條件,最佳條件為A(初始糖度)=22.40%、B(混菌添加量)=0.30 g/kg、C(發(fā)酵溫度)=20.37 ℃,預(yù)計(jì)混菌發(fā)酵柿子酒的感官評(píng)分理論值為88.04分?？紤]到實(shí)驗(yàn)實(shí)際操作,在A(初始糖度)22.5%、B(混菌添加量)0.30 g/kg、C(發(fā)酵溫度)20.5 ℃條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),最終得感官評(píng)價(jià)得分平均值為87.8分,與預(yù)測(cè)值大體一致。

2.4 柿子酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

將單菌種發(fā)酵柿子酒與混菌發(fā)酵柿子酒進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析其相對(duì)含量對(duì)比結(jié)果如表6所示。

表6 柿子酒醇類及酯類揮發(fā)性成分分析表

混菌發(fā)酵柿子酒中共檢測(cè)出38種化合物,其中,醇類、酯類和酸類分別為7種、15種和10種,其它類6種。Aq酵母發(fā)酵柿子酒中共檢測(cè)出28種,其中醇類、酯類和酸類分別為6種、10種和8種,其它類物質(zhì)4種。EC酵母發(fā)酵柿子酒中共檢測(cè)出27種,其中醇類、酯類和酸類分別為8種、9種和7種,其它類物質(zhì)4種。F33酵母發(fā)酵柿子酒中共檢測(cè)出25種,其中醇類、酯類和酸類分別為7種、8種和7種,其它類物質(zhì)3種。4種柿子酒相比,混菌發(fā)酵柿子酒中的風(fēng)味物質(zhì)增加,尤其是酯類物質(zhì)。醇類物質(zhì)中以苯乙醇、戊醇、活性戊醇為主要醇類,3種醇類含量均有提升。其中苯乙醇具有玫瑰清香味,是構(gòu)成柿子酒主要特征香氣的組分[16]。混菌發(fā)酵柿子酒中酯類化合物種類最多,酯類物質(zhì)可以增強(qiáng)酒體復(fù)雜性,使人有愉悅的感官享受。酯類物質(zhì)中,以乙酸苯乙酯、9-癸烯酸乙酯、癸酸乙酯及辛酸乙酯為主。與單菌發(fā)酵相比,增添了5種酯類物質(zhì),由此可見(jiàn),混菌發(fā)酵可使得風(fēng)味物質(zhì)的種類及含量增加。

3 結(jié) 論

通過(guò)單因素及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),得到EC酵母、Aq酵母和F33酵母的最佳比例為4∶4∶7,柿子酒混菌液態(tài)發(fā)酵最適因素條件為:初始糖度22.5%,pH 3.8,混菌添加量0.3 g/kg,發(fā)酵溫度20.5 ℃,發(fā)酵8 d,最終所得感官評(píng)價(jià)得分為87.8分?；炀l(fā)酵柿子酒中共檢測(cè)出38種化合物,其中,醇類、酯類和酸類分別為7種,15種和10種,其它類6種。與單菌柿子酒相比,混菌發(fā)酵柿子酒中的風(fēng)味物質(zhì)種類增加,尤其是酯類物質(zhì)。本研究可以解決柿子酒風(fēng)味不佳問(wèn)題,改善柿子資源浪費(fèi)現(xiàn)狀,提高柿子產(chǎn)品附加值及經(jīng)濟(jì)效益。