牡丹皮-赤芍藥對治療川崎病作用機制的網(wǎng)絡藥理學研究*

馮子娟,周虹宏,陽亭亭,羅武政,黃道超▲

(1重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院 兒科研究所 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室 國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學研究中心 兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地 兒科學重慶市重點實驗室,重慶 400014;2重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院中醫(yī)科,重慶 400014)

川崎病(Kawasaki disease,KD)是一種具有系統(tǒng)性、發(fā)熱性、免疫性特點的全身血管炎[1],主要于5歲以下兒童多發(fā),是引發(fā)兒童獲得性心臟病的病因之一[2],威脅兒童身體健康。據(jù)流行病學調查,全世界有超60個國家報道過川崎病,該病的發(fā)病率正在逐年升高,我國也不例外[3-4]。當前研究中,KD的病因及機理尚不清晰。臨床上診斷KD主要通過結膜炎、多形性皮疹、淋巴結病、手腳水腫等癥狀,西醫(yī)中的治療主要為聯(lián)合靜脈注射免疫球蛋白與阿司匹林、依那西普等生物制劑[4-5]。川崎病在中醫(yī)里面無對應病名。根據(jù)KD臨床特點及發(fā)展過程,主要將其歸類于“溫病”范疇,病機主為外感溫熱毒邪,侵犯肺衛(wèi),化火入營血,流竄、壅滯于皮膚、黏膜、經(jīng)脈、四肢,治療多以衛(wèi)氣營血辨證,以透邪解毒、清熱涼血、潤燥養(yǎng)陰等為法[6]。

古籍《神農(nóng)本草經(jīng)》中首次提到牡丹皮(Cortex Moutan),書中記載其特征為“味苦辛寒,主治寒熱,中風,除癥堅,安五臟,療癰瘡”[7]。明代《本草綱目》中提到牡丹皮能“和血生血涼血,治血中伏火”,具有“清熱涼血”之功[8-10]。芍藥首記于《神農(nóng)本草經(jīng)》,后陶弘景將其分為赤、白兩類?！兜崮媳静荨吩u價赤芍(Radix Paeoniae Rubra)可“泄脾火,降氣,行血,退血熱”,屬清熱涼血藥類,主用于熱入營血、肝郁脅痛、瘡瘍癰腫等病證[11-12]。臨床治療中,牡丹皮-赤芍常作為相須配伍使用之藥對,顯協(xié)同增效之力,對溫病熱入營血之發(fā)斑吐衄,血行阻瘀之肢麻體木、關節(jié)痹痛等具有顯著療效?；谂R床復方結合數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn):牡丹皮-赤芍是中藥處方中治療川崎病的常用核心藥對[13]。然而,牡丹皮-赤芍對治療川崎病的作用機制尚不清晰,仍待深入探究。

隨著科技進步,研究中醫(yī)藥作用的方法中發(fā)展出一門新技術——網(wǎng)絡藥理學。中藥和疾病的靶點、基因、通路等互作機理可通過網(wǎng)絡藥理學方法對多學科內容與技術進行系統(tǒng)的、多角度的闡釋。本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法初步探討牡丹皮-赤芍藥對治療川崎病的可能機制,以期為深入研究提供理論支持,為臨床治療提供指導參考。

1 資料與方法

1.1 牡丹皮-赤芍藥對活性成分及靶點

TCMSP數(shù)據(jù)庫[14](https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)中,以口服生物利用度(OB≥30 %)、類藥性(DL≥0.18)為條件,搜索整理牡丹皮-赤芍藥對的活性成分。藥對靶點也經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫進行查詢。然后,基于Uniprot數(shù)據(jù)庫[15](https://www.uniprot.org/)和perl語言工具,整理出藥對預測靶點。

1.2 牡丹皮-赤芍藥對治療川崎病靶點的預測及篩選

以“kawasaki disease”為關鍵詞,通過GeneCards數(shù)據(jù)庫[16](https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫[17](https://www.omim.org/),搜索去重找到KD靶點集。對疾病和藥對相關靶點取交集,利用Draw Venn Diagram[18](http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)行韋恩圖可視化。

1.3 牡丹皮-赤芍-川崎病靶點調控網(wǎng)絡構建與蛋白質相互作用網(wǎng)絡構建

利用perl語言工具對上述獲得的藥對-疾病交集靶點進行處理,得到Type和Network文件,將它們導入Cytoscape3.7.2軟件[19]進行可視化網(wǎng)絡構建。將交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫[20](https://cn.string-db.org/),依次選擇“Multiple proteins”“Homo sapiens”,設置0.7的置信度。下載最終PPI網(wǎng)絡“string_interactions.tsv”文件,并將其導入Cytoscape3.7.2軟件作美化處理。利用該軟件的Cytohubba插件篩出PPI網(wǎng)絡的hub基因。

1.4 富集功能分析

通過R x64 4.1.2軟件的“ClusterProfiler”“pathview”“colorspace”等程序包[21]分析共有靶點的GO功能和KEGG通路情況,以P<0.05為篩選條件,做條形圖或氣泡圖可視化。

1.5 分子對接

使用Pubchem數(shù)據(jù)庫[22](https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載牡丹皮-赤芍藥對的2D化合物結構,通過3D Chem工具轉成3D格式并保存。利用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫[23](https://www.rcsb.org/)得到治療KD有關靶點蛋白的文件,在PyMOL軟件[24]中進行去水、去小配體預處理。然后,通過AutoDock Vina軟件[25]進行分子對接,根據(jù)活性成分與核心靶點最低結合能的值來評價化合物和靶點之間的相互作用。

2 結果

2.1 牡丹皮-赤芍藥對活性成分及靶點信息

依據(jù)上述篩選標準,獲取牡丹皮-赤芍藥對的活性化學成分,且結合文獻、藥典內容,得到牡丹皮活性成分12個,赤芍28個,其中4個有效成分為兩藥共有(表1)。篩選去重整理出牡丹皮活性成分對應靶點155個,赤芍對應靶點88個。

表1 牡丹皮-赤芍藥對中主要活性成分

2.2 川崎病潛在靶點

通過OMIM和GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索KD致病基因,合并保留唯一值得到KD有關靶點1619個。利用Venn工具制圖分析,將牡丹皮-赤芍藥對潛在靶點與KD潛在靶點取交集,得到藥對-疾病靶點100個(圖1)。

圖1 牡丹皮-赤芍-川崎病靶點韋恩圖

2.3 牡丹皮-赤芍-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡

“牡丹皮-赤芍-化學成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡經(jīng)Cytoscape3.7.2軟件構建(圖2)。12個化合物和100個潛在靶點構成此網(wǎng)絡。牡丹皮-赤芍藥對中度值靠前的活性成分有MOL000098(槲皮素,Degree=81)、MOL000422(山柰酚,Degree=30)、MOL002714(黃芩素,Degree=21)、MOL000358(β-谷甾醇,Degree=14)。節(jié)點連接數(shù)越多,靶點就越大,表示其在網(wǎng)絡的位置越重要。HSP90AB1、PTGS2、ESR1、AR、CASP3是度值排名靠前的靶點。此網(wǎng)絡體現(xiàn)了牡丹皮-赤芍藥對是通過多個成分和多個靶點的方式來治療川崎病。

注:黑色圓形代表牡丹皮潛在活性成分,白色圓形代表赤芍潛在活性成分,灰色矩形代表中藥與疾病的潛在交集靶點。圖2 牡丹皮-赤芍-化學成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖

2.4 PPI網(wǎng)絡與核心靶點篩選

將藥對-疾病靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫分析網(wǎng)絡,利用Cytoscape3.7.2軟件作可視化處理(圖3)。該網(wǎng)絡擁有95個節(jié)點和648條邊。以節(jié)點大小代表Degree值,值越大的節(jié)點就越大,說明此節(jié)點位于網(wǎng)絡的關鍵位置。該PPI網(wǎng)絡Degree值較大的靶點有AKT1、TP53、JUN、CASP3等,推測其為治療川崎病的關鍵靶點。經(jīng)CytoHubba插件篩出前10位的Hub基因(圖4)。顯示川崎病可能通過MYC、HIF1A、AKT1等靶點發(fā)揮作用,達到治療效果。

圖3 牡丹皮-赤芍藥對治療KD潛在靶點的PPI網(wǎng)絡

圖4 PPI網(wǎng)絡的hub基因

2.5 富集功能分析

中藥-疾病的交集靶點利用R語言分析GO功能和KEGG通路情況。GO功能條形圖見圖5。橫坐標為富集靶點數(shù),富集靶點的顯著性用P值表示。P值越小,顏色越淺,反之越深。結果顯示,BP相關條目數(shù)最多,有1883條,主要與細胞對外刺激的反應、對生物刺激的反應及氧化應激反應等相關。CC相關條目數(shù)有40條,主要包含細胞膜和蛋白激酶復合物。MF相關條目數(shù)有147條,主要包含DNA結合轉錄、RNA 聚合酶Ⅱ特異性、泛素樣蛋白連接酶結合等。

圖5 中藥治療KD潛在靶點的GO富集分析條形圖

KEGG通路分析氣泡圖見圖6。富集靶點數(shù)目的多少以圓圈大小表示,即圓圈越大,富集靶點數(shù)越多。富集靶點的顯著性用P值表示,P值越小,顏色越淺,反之越深。富集結果顯示,共168條信號通路,主要涉及AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路等,在脂質沉積、動脈粥樣硬化、炎癥等過程中發(fā)揮關鍵作用。

圖6 中藥治療KD潛在靶點的KEGG通路富集氣泡圖

2.6 分子對接結果

將上述得到的槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)與PPI網(wǎng)絡里的關鍵靶點(JUN、AKT1、CASP3)進行對接(表2)。通常,結合能小于-5 kcal/mol表明結合活性較好,小于-7 kcal/mol表明結合穩(wěn)定[26]。由結果可知,蛋白受體與藥物小分子配體的結合親和力均小于-5 kcal/mol,說明核心化合物與關鍵靶點均具有潛在活性效果。

表2 牡丹皮-赤芍藥對治療KD的核心化合物與關鍵靶點的結合能

3 討論

本文采用網(wǎng)絡藥理學方法,對牡丹皮-赤芍治療川崎病的核心化合物、靶點及作用機制進行探究。結果顯示,牡丹皮-赤芍藥對治療川崎病的核心化合物主要涉及槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、黃芩素等。基于PPI網(wǎng)絡篩選核心靶點,分析出10個關鍵靶點(AKT1、JUN、CASP3等)與川崎病有緊密聯(lián)系。將牡丹皮-赤芍藥對活性成分中的槲皮素、山柰酚與靶點JUN、AKT1、CASP3進行分子對接,發(fā)現(xiàn)結合親和力均低于-5 kcal/mol,具有較好的結合度。因此,推測牡丹皮-赤芍藥對的有效成分可與上述相關靶點相互作用產(chǎn)生治療效果。

黃酮類化合物(黃芩素、槲皮素、山柰酚等)對抑制炎癥細胞因子和氧化應激具有重要作用。異丙腎上腺素誘導的心肌損傷大鼠模型中,黃芩素可減輕氧化應激和抑制致炎因子釋放,達到保護心臟的作用[27]。槲皮素和山柰酚可通過下調NF-κB、TNF、NLRP3、IL-6等表達并抑制氧化應激,從而減輕炎癥損傷[28-31]。β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化的作用。文獻指出,谷甾醇可通過LR4/Nrf2/ERK1/2/JNK等信號通路,下調ROS、MDA以及IL-6、TNF-α水平,以此緩解氧化應激損傷,改善炎癥反應[32-34]。因此,牡丹皮-赤芍治療KD的關鍵化合物可通過下調炎癥因子表達、激活相關通路等,進而產(chǎn)生藥理作用。

AKT1參與細胞增殖、存活、生長和血管生成等過程,能調節(jié)VEGF介導的血管生長,從而減緩心功能受損[35-37]。JUN是活化蛋白-1(AP-1)轉錄復合物中的一種,其可調節(jié)表皮生長因子受體(EGFR)的表達,參與增殖、凋亡等生物過程[38-39]。CASP3是調控細胞凋亡過程的關鍵位點,研究顯示,下調CASP3表達,可降低酒精性肝損傷、減輕缺血再灌注損傷導致的腦梗死體積[40-41]。此外,也有研究證實了川崎病患者冠狀動脈病變的形成與CASP3有關[42]。

據(jù)GO功能和KEGG通路富集結果,牡丹皮-赤芍藥對可通過細胞氧化應激反應、抗細胞凋亡作用等網(wǎng)絡方式緩解川崎病,其作用的信號通路可能同TNF信號通路、IL-17信號通路、PI3K-Akt信號通路等相關。

綜上所述,牡丹皮-赤芍藥對治療川崎病的作用機制可能是槲皮素、黃芩素、山柰酚、β-谷甾醇等成分作用于AKT1、JUN、CASP3等相關靶點發(fā)揮藥效,并可經(jīng)TNF信號通路、IL-17信號通路、PI3K-Akt信號通路等調控氧化應激、炎癥細胞因子水平、血管內皮等起到治療川崎病的效果。該研究為治療川崎病的藥效物質基礎和通路機制研究提供了新的理論參考,為后續(xù)實驗驗證提供依據(jù)。