黔產八角楓HPLC指紋圖譜研究*

陳志琳,杜洪志,何 麗,覃春葉,李 瑋

(貴州中醫(yī)藥大學,貴州 貴陽 550025)

0 引言

八角楓為八角楓科植物八角楓(Alangiumchinense(Lour.)Harms.)及瓜木(Alangium.platanifolium(Sieb．et Zucc.)Harms.)的干燥細須根(白龍須)或干燥支根(白金條)。具有舒經活絡、祛風除濕、散瘀止痛等功效,主要用于治療四肢麻木、風濕痹痛、跌打損傷等癥[1]?，F(xiàn)代研究表明,八角楓主要含有生物堿[2-4]、酚苷、木脂素[5-6]、揮發(fā)油[7-8]等化學成分,具有肌松及收縮平滑肌[9-11]、抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛[12]等藥理作用。由于藥材受不同地理環(huán)境、土壤微生物、采收時節(jié)、加工炮制等綜合因素的影響,導致其藥材質量參差不齊,因此,建立一種整體、全面的八角楓藥材質量控制方法尤為重要[15-16]。本實驗采用HPLC以黔產10 個批次的八角楓藥材為研究對象,建立了黔產八角楓的 HPLC指紋圖譜,為完善八角楓藥材質量控制提供依據。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀;分析天平; SHA-B數(shù)顯恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司);沃特浦超純水機。對照品八角楓堿(批號C102642-210317)質量分數(shù)≥98%,購自貴州迪大生物科技有限公司;甲醇、乙酸、乙腈為色譜純,其余試劑為分析純。實驗用八角楓藥材經貴州中醫(yī)藥大學杜洪志老師鑒定為八角楓科植物八角(Alangiumchinense(Lour.)Harms.)的須根,共10 批,產地及采集日期見表1。

表1 八角楓藥材信息表

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

取對照品八角楓堿適量,加含5%醋酸的30%甲醇溶液制成2 mg/mL的溶液,即得。

2.2 供試品溶液的制備

取八角楓藥材粉末(過3號篩)約2.0 g,置100 mL錐形瓶中,精密加入含5%醋酸的30%甲醇溶液25 mL,搖勻,稱定質量,超聲提取50 min,放冷,補重,搖勻,濾過,即得。

2.3 色譜條件

色譜柱:HC-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;檢測波長:259 nm;流速:1.0 mL/min;進樣體積 :15 μL。流動相為甲醇-緩沖液(0.2 g庚烷磺酸鈉,2.0 g磷酸二氫鉀,0.3 mL磷酸,定容至1000 mL),洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

2.4 色譜信息完整性考察

為檢查色譜化學信息的完整性,取八角楓(編號S5) 供試品溶液適量,按上述條件進樣分析,并將洗脫程序擴展至90 min。色譜圖顯示,在58 min之后沒有出現(xiàn)其他色譜峰,表明采集60 min的HPLC色譜圖可以完整地表達八角楓的化學信息,見圖1。

圖1 樣品完整性

圖2 10批八角楓藥材HPLC指紋圖譜疊加圖

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗

取八角楓(編號S5) 供試品溶液適量,連續(xù)進樣6次。對各主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積進行統(tǒng)計,結果顯示RSD均小于3%,表明儀器的精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗

取八角楓(編號S5) 供試品溶液適量,在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h進樣。記錄色譜圖,分別計算HPLC圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD,結果顯示RSD均小于3%,表明樣品溶液在12 h內基本穩(wěn)定。

2.5.3 重復性試驗

取八角楓(編號S5)供試品溶液適量,連續(xù)進樣6次。記錄色譜圖,并計算共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD,結果顯示RSD均小于3%,表明重復性良好。

2.6 八角楓藥材指紋圖譜采集

2.6.1 共有峰和對照圖譜的采集

運用中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012A版對10批次八角楓的指紋圖譜進行相似度分析,指定S7為參照圖譜,采用中位數(shù)法,自動匹配,多點校正生成對照圖譜R,由生成數(shù)據的輸出結果得到8個共有峰,見圖 2。

2.6.2 相似度分析

使用中藥色譜指紋圖相似度評價系統(tǒng)2012A版進行相似度分析,結果10批次八角楓與對照圖譜的相似度在0.801～0.994之間,結果表明收集的黔產八角楓藥材整體概貌有一定差異,結果見表3。

表3 黔產八角楓藥材指紋圖譜相似度

2.7 聚類分析

將生成的8個共有峰峰面積導入SPSS 26.0軟件,采用組間連接法進行Q型聚類分析。在類間距為15時,10批次樣品聚為3類。其中產自凱里的2批八角楓藥材(S7、S8)聚為一類,產自畢節(jié)和遵義的2批聚為一類,其余6批聚為一類。

2.8 主成分分析及因子分析

以主成分貢獻率及特征值為依據,對8個共有峰峰面積原始數(shù)據進行主成分因子分析。特征值和方差貢獻率見表4,其值累計為80.110%,表明所分析樣品中的大部分化學信息可以通過前三個組分反映出來。根據碎石圖(圖4)走勢可知,前三個成分的曲線陡峭,說明其為引起黔產不同批次八角楓差異性的主要原因。通過正交旋轉,得到8個指標在3個主成分中的旋轉成分矩陣,見表5。由表5可知,主成分1可以反映所有組分的信息;主成分2可以反映出1、2、5、7、8共5個指標組分的信息;主成分3可以反映出2、3、4、8共4個指標組分的信息。由八角楓藥材主成分分析三維圖可以看出,10批八角楓藥材被分為3大類,結果與聚類分析一致(圖3)。載荷圖(圖5)被用于描述圖像的特性,載荷代表的點到原點間的距離被用于衡量載荷的絕對值大小,絕對值越大,表明對主要分量的影響也就越大。10個批次八角楓的主成分綜合評分和排序結果見表5,采自遵義地區(qū)(S6)的八角楓綜合得分最高、品質最佳。

圖3 八角楓指紋圖譜聚類樹狀關系

圖4 公共因子碎石圖

圖5 八角楓藥材主成分得分圖

表4 主成分方差分析

表5 八角楓藥材成分矩陣

表6 10批八角楓藥材主成分綜合得分及排序

綜合得分計算公式:

Y=0.39266M1+0.24809M2+0.16035M3

3 討論

3.1 流動相的選擇

比較了乙腈-緩沖液和甲醇-緩沖液不同洗脫梯度對樣品的分離情況,結果流動相為甲醇-緩沖液(0.2 g庚烷磺酸鈉,2.0 g磷酸二氫鉀,0.3 mL磷酸,定容至1000 mL),樣品中各峰分離度好。

3.2 檢測波長的選擇

分別考察229 nm、254 nm、259 nm、262 nm、273 nm共5個檢測波長下樣品的圖譜,發(fā)現(xiàn)259 nm下的基線平穩(wěn),出峰信息較豐富,而且色譜峰響應值高。

3.3 色譜柱的選擇

分別考察了樣品在HC-C18柱、Alltech Alltima C18柱、Agilent HP-C18柱、Diamonsil C18柱等不同品牌色譜柱的分離情況,結果顯示色譜柱對樣品中色譜峰的分離影響不大,色譜條件在上述色譜柱上均能重現(xiàn)。

3.4 供試品樣品制備方法的選擇

對提取溶劑濃度(30%甲醇、35%甲醇、25%甲醇)、提取方法(超聲、回流提取),提取時間(30 min、50 min、70 min)、提取溶劑用量(25 mL 、30 mL、 20 mL)等條件進行篩選,用含 5 %醋酸的30 %甲醇溶液25 mL,超聲提取50 min作為供試品溶液的提取方法。

本實驗建立了八角楓藥材HPLC指紋圖譜共有模式,共標示出8個共有峰;不同批次的八角楓藥材指紋圖譜相似度相對較高(大于0.80),說明黔產各地八角楓的質量相對較穩(wěn)定。由主成分分析發(fā)現(xiàn),10個批次八角楓的主成分綜合評分和排序結果顯示,遵義地區(qū)(S6)的八角楓綜合得分最高。由聚類分析可知黔產各地的八角楓化學成分存在一定差異。