生長期施用GA4+7對黃冠梨貯藏過程中揮發(fā)性有機化合物的變化影響

鄭欣欣,顏朦朦,陳子雷,杜紅霞,楊親正,張文君*

1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 生物工程學院,山東 濟南 250353;2.山東省農業(yè)科學院 農產品質量標準與檢測技術研究所,山東 濟南 250100

植物生長調節(jié)劑(plant growth regulators,PGRs)是植物中天然存在(植物激素)或合成開發(fā)的一類有機物質,對植物的生長發(fā)育有促進、延緩或抑制作用[1-2]。目前已發(fā)現(xiàn)并公認的植物調節(jié)劑有脫落酸、赤霉素、乙烯、生長素、茉莉酸甲酯、蕓苔素內酯等[3-4]。PGRs制造成本低廉、用量少、見效快,已在多種作物的生產中得到了廣泛應用[5-8]。其中,在梨果中的應用發(fā)現(xiàn),吲哚乙酸氧化產物能促進Barlett梨的成熟[9]、噴灑2.0×10-5的赤霉素(GA3)溶液可以提高軟梨品種的坐果率[10]。植物生長調節(jié)劑不僅影響水果重量,還能調節(jié)水果的香氣組分。CHEN等[11]在甜瓜花的子房上噴灑膨脹劑溶液(氯吡苯脲,2.5×10-6),發(fā)現(xiàn)氯吡苯脲(CPPU)處理的果實中可代謝為香氣物質的氨基酸含量顯著高于蜜蜂授粉的果實,表明氯吡苯脲的施用影響了香氣的產生。王建萍等[12]用低濃度的GA3+CPPU搭配殼聚糖、海藻精施用,顯著提高了“陽光玫瑰”的果實香氣且揮發(fā)性有機化合物的種類增多。

香氣是水果最重要的感官屬性之一,由幾百甚至上千種化合物組成,主要包括酯類、醇類、醛類、萜烯等,不同種類與不同含量的香氣物質共同形成了不同果品的獨特香氣[13]。香氣同時也是采收期和貯藏期判斷的重要指標之一[14-15]。然而研究發(fā)現(xiàn),果品長期冷藏后,香氣會明顯減弱[16]。目前,很多專家研究梨果采后植物生長調節(jié)劑的施用,發(fā)現(xiàn)部分植調劑對于梨貯藏期香氣成分的保持或改善有明顯的作用。例如,LUO等[17]將采摘后的南果梨用濃度為2 mmol·L-1的水楊酸浸泡15 min后再進行長時間低溫貯藏,發(fā)現(xiàn)水楊酸處理可以增加長期冷藏黃冠梨中酯類芳香物質的含量。YIN等[18]用濃度為0.1 mmol·L-1的茉莉酸甲酯水溶液給采摘后的南果梨進行噴霧,南果梨風干后進行冷藏,發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯可以通過調節(jié)乙烯生成和信號轉導途徑來減少冷藏后南果梨12 d貨架期內香氣酯的損失。

梨果在生長過程中使用植物生長調節(jié)劑是否對果品貯藏過程中揮發(fā)性物質形成有影響,目前還未可知。因此,在本文中,我們采用HS-SPME結合GC×GC/TOFMS方法對生長期施用GA4+7植物生長調節(jié)的黃冠梨進行研究,分別從揮發(fā)性物質的種類、質量分數(shù)和數(shù)量、香氣特征質量分數(shù)百分比分布等方面進行了綜合分析和評價,最終掌握采集樣品貯藏過程中揮發(fā)性物質的變化規(guī)律。本研究將詳細提供生長期施用GA4+7后,黃冠梨果樣品香氣品質的變化,不僅為其貯藏時期的確定提供數(shù)據支撐,同時可為梨果生產過程中植調劑的施用規(guī)程提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

黃冠梨果樣品分為兩組處理,為梨果對照組(CK),GA4+7處理組。

2-壬酮(99.0%),德國Dr.Ehrensorfer公司;甲醇(HPLC級),美國Fisher公司;GA4+7,石家莊開發(fā)區(qū)一生化科技有限公司;市面常見長桿噴霧器;50/30 μm DVB/CAR/PDMS(divinylben-zenelcarboxen/polydimethylsiloxane,二乙烯苯/羧乙基/聚二甲基硅烷)萃取頭,美國SUPELCO公司;DB-5MS(30 m×250 μm,0.25 μm)色譜柱、Rxi-17sil MS柱(2 m×250 μm,0.25 μm),美國安捷倫公司;Sartorius BSA224S-cW分析天平,德國賽多利斯公司;SUPELCO固相微萃取裝置,美國色譜科公司;CORNING PC-420 D磁力攪拌器,美國康寧公司;Agilent 7890B氣相色譜儀(配備LECO Pegasus 4D TOFMS質譜儀),美國安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗及采后處理

于2020年山東聊城一商業(yè)果園內,對盛花后30 d、疏果后套袋前的全棵果樹進行植物生長調節(jié)劑的均勻噴施,每一處理重復3次,每組處理選擇果樹5～6棵。空白對照按照同樣的方法噴施清水。梨果在八月中下旬的商業(yè)成熟期采摘,當天運回山東省農業(yè)科學院,儲藏在0～4 ℃的冷庫內200 d,每隔50 d取樣測試,每次測試重復3次。

1.2.2 內標溶液的制備

精準稱取0.1 g(精確至0.000 1 g)2-壬酮標準品,用甲醇溶液稀釋至10 mg/L備用,所有標準溶液于-18 ℃冰箱中貯存。

1.2.3 全二維氣相色譜/質譜條件

揮發(fā)性組分在全二維氣相色譜/飛行時間質譜儀上進行分析。色譜條件:色譜柱以1.4 mL/min恒定流速的高純氦氣使用。前進樣口和傳輸線溫度分別設置為270 ℃和280 ℃。色譜一維烘箱溫度程序:起始溫度為40 ℃持續(xù)2 min,然后以5 ℃/min上升至200 ℃,最后以20 ℃/min上升至280 ℃并保持2 min。二維烘箱溫度在色譜運行的整個過程中始終比一維烘箱高5 ℃,調制器溫度比二維烘箱高15 ℃。調制周期為3 s,熱脈沖時間為0.6 s。

質譜條件:質譜儀在-70 V的電子電離(EI)模式下進行,采集范圍為33～550 m/z,采集速率為100(spectrum/s)。離子源溫度設置為250 ℃,采集延遲60 s。檢測器電壓為1 450 V。全氟三丁胺(PFTBA)用于日常校準和調整。

1.2.4 梨揮發(fā)性成分的提取

根據前人文獻中所用方法進行揮發(fā)性物質的提取[19-23]。采用四分法將梨果分為四部分,去除每個梨的果核和種子,果實切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的立方體。將6.00 g樣品放入15 mL螺旋帽小瓶中,密封小瓶之前,加入5 μL 10 mg/L的2-壬酮作為內標,靜置10 min,之后將萃取頭暴露在小瓶頂部空間40 min以吸附揮發(fā)性成分,萃取溫度保持在40 ℃。最后,在色譜柱10∶1的分流模式條件下將萃取頭立即插入270 ℃的GC進樣口解析2 min。

1.3 數(shù)據處理方法

1.3.1 揮發(fā)性化合物半定量質量濃度的測定

采用計算機進行儀器控制、數(shù)據采集和處理并將各組分與NIST2017譜庫進行比較,最小相似度值為700。揮發(fā)性化合物的含量通過其峰面積與內標物(2-壬酮)的峰面積進行比較來計算。半定量質量濃度計算公式如下[19]:

Ca:揮發(fā)性物質的質量分數(shù)(ng/g);Sa:揮發(fā)性物質的峰面積;Sis:內標物的峰面積;Cis:內標物的質量濃度(μg/mL);m:樣品質量(g);2-壬酮的質量濃度為10 μg/mL;樣品的質量為6.00 g。

1.3.2 揮發(fā)性有機化合物保留指數(shù)的測定

保留指數(shù)(IR)又稱科瓦茨(kovats)指數(shù),是使用最廣泛并被國際上公認的定性分析法,為色譜定性分析的一個重要參數(shù)。在本研究中,通過根據步驟1.2.4的分析獲得了正構烷烴(C6-C9、C8-C40)的保留時間,并計算了各揮發(fā)性化合物的保留指數(shù),旨在輔助TOF-MS與NIST譜庫相匹配為化合物定性的可靠性。ChromaTOF GC使用鄧肯工具和Kratz方程計算保留指數(shù)。公式為[19]:

TRa:目標化合物的保留指數(shù);a:目標化合物;n:低級正構烷烴的碳數(shù);N:高級正構烷烴的碳數(shù);TR:保留時間。

1.3.3 特征香韻的分析

1.4 統(tǒng)計分析

應用SIMCA-P 14.1軟件進行主成分分析(PCA),以檢測聚類形成并建立樣品與揮發(fā)性有機化合物之間的關系。應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行所有統(tǒng)計分析,計算了單向方差并通過鄧肯檢驗檢測單向方差差異的顯著性(P<0.05)。數(shù)據顯示為平均值±標準差(n=3)。

2 結果與討論

2.1 貯藏期間黃冠梨中的揮發(fā)性物質鑒定

我們對生長期間施用了GA4+7的黃冠梨在0～200 d貯藏過程中的8類揮發(fā)性化合物(酯類、烯類、醇類、醛類、酮類、烷烴類、芳烴類和硫化物類)進行了檢測,總離子流圖見圖1。在貯藏當天,GA4+7處理組中的總揮發(fā)性物質質量分數(shù)最高,達到了636 ng/g,化合物數(shù)量在3個組當中也最高(53種),見圖2(a)和圖3(b)。但隨著貯藏時間的延長,到貯藏時間結束時,對照和GA4+7處理組中的揮發(fā)性物質質量分數(shù)全部下降嚴重(下降了587～292 ng/g)。

圖1 黃冠梨的GC×GC/TOFMS總離子流圖

從圖2(b)～(c)可知,通過不同類型香氣物質的相對質量分數(shù)比對發(fā)現(xiàn)酯類是“黃冠梨”中最主要的揮發(fā)性有機化合物且在貯藏過程中的變化較明顯。在貯藏當天,相比于對照(72.2%),GA4+7處理組(85.0%)中酯類物質質量分數(shù)占比較高;但隨著貯藏時間的延長,在200 d貯藏期結束時,對照和GA4+7處理組的酯類質量分數(shù)分別下降了221 ng/g和514 ng/g,質量分數(shù)占比也分別下降了12.4%和30.1%。并且,從圖3可看出,貯藏當天(第0 d)到貯藏結束(第200 d),酯類物質的數(shù)量在對照和GA4+7處理組中的變化也有很大差別。對照中的酯類物質數(shù)量先上升后下降,最后與貯藏當天的種類數(shù)量保持在相同水平;而GA4+7處理組中的酯類數(shù)量持續(xù)下降(從33種減少到了23種)。這個結果表明被GA4+7處理過的梨果具有高的成熟度以及差的耐貯性[26-27]。

除酯類物質外,醇類和醛類揮發(fā)性物質也是梨果香氣組成的重要部分,在梨果成熟的過程中開始積累[28]。通過對醛類和醇類進行分析,發(fā)現(xiàn)在采摘的當天,醇類與醛類這兩種物質在對照(36.9 ng/g;56.7 ng/g)與GA4+7處理組中(26.2 ng/g;53.5 ng/g)的質量分數(shù)差別不大;隨著貯藏時間的延長,對照和GA4+7處理組中的醇類物質的質量分數(shù)分別下降了25.3 ng/g和14.5 ng/g(質量分數(shù)占比分別上升了5.04%,20.0%),醛類分別下降了52.9 ng/g和50.8 ng/g(質量分數(shù)占比下降了10.5%,2.64%)。

除上述描述的化合物之外,烯類化合物也是一種梨果中常見的揮發(fā)性化合物,之前在西洋梨、亞洲梨中均有檢出[25,29-30]。本研究中,在貯藏當天和貯藏結束的各個處理組中出現(xiàn)了多種揮發(fā)性烯類化合物,如主要靠碳水化合物分解產生的α-法尼烯,(Z,E)-α-法尼烯等[25,31]。由表1、表2和圖3可看出,到貯藏結束時,對照中烯類化合物的質量分數(shù)上升了2.19 ng/g,其數(shù)量增加了2種,質量分數(shù)占比上升了5.22%;而GA4+7處理組中的烯類化合物質量分數(shù)下降了5.65 ng/g,其數(shù)量也減少了2種,質量分數(shù)占比上升了5.44%。此結果再次表明,與對照相比,GA4+7處理過的梨果在低溫貯藏過程中的揮發(fā)性物質質量分數(shù)極易下降。

基于以上發(fā)現(xiàn),GA4+7處理過的梨果具有較高的成熟度,但耐貯性較差,揮發(fā)物容易在貯藏期分解或揮發(fā)。

表1 對照組梨果中烯烴類揮發(fā)性物質的質量分數(shù) 單位:ng/g

表2 赤霉素4+7組梨果中烯烴類揮發(fā)性物質的質量分數(shù) 單位:ng/g

注:(a)對照組和處理組在0～4℃下貯藏0～200 d中總揮發(fā)性物質質量分數(shù)變化;(b,c)對照組和處理組在0～4 ℃下貯藏0～200 d中各類別揮發(fā)性成分相對質量分數(shù)占比變化。

圖3 對照組(a)和處理組(b)在0～4 ℃下貯藏0～200 d中的揮發(fā)性物質種類數(shù)量變化

2.2 黃冠梨貯藏過程中的揮發(fā)性有機化合物變化趨勢

我們對各個處理組0～200 d貯藏期內黃冠梨中檢測出的各種揮發(fā)性有機化合物進行主成分分析(principal component analysis,PCA)。如圖4所示,PC1和PC2兩個分量共解釋了75%以上的方差。隨著貯藏時間的延長,樣品在PCA載荷圖的不同區(qū)域分布明顯,說明貯藏期的變化對香氣組分有顯著影響。

除此之外,儲存對不同處理組中同一類揮發(fā)性化合物的影響也不同。為了更加清晰地了解主要成分的變化,我們進行了熱圖分析。如圖5所示,由熱圖清晰地展示了各處理組中的化合物隨貯藏時間的質量分數(shù)變化,由圖可看出不同貯藏階段下各處理組中的優(yōu)勢化合物。從整個貯藏期來看,在對照組貯藏初期,乙醛、己醇、乙醇、3-己酮和2-己酮等非酯類物質的質量分數(shù)較高,隨著貯藏時間的延長,開始出現(xiàn)質量分數(shù)較高的(E)-2-己烯酸甲酯、乙酸異戊酯等酯類物質,到貯藏結束時,出現(xiàn)了烯類物質如:1-十四烯、(Z)-3-十四碳烯等?？梢娰A藏對梨果中化合物的種類和質量分數(shù)有較大影響。GA4+7處理組與對照在貯藏初期的高質量分數(shù)化合物種類不同,在GA4+7處理組中,丁酸己酯、惕各酸乙酯、乙酸異丁酯等數(shù)量較多的酯類化合物占很大優(yōu)勢,隨著貯藏的進行,開始出現(xiàn)丁醇和α-蒎烯等醇類和烯類化合物,到貯藏結束時2-癸烯-1-醇、十二烷、壬醛等化合物出現(xiàn)。

鑒于以上,我們推測,對照組在貯藏初期還未達到最高的成熟度,這一階段的物質代謝主要是氫過氧化物在HPL酶的作用下生成醇和醛等非酯類物質;經過貯藏,梨果成熟度逐漸升高,醛類物質在ADH酶的作用下代謝為醇類物質,而醇類物質在AAT酶的作用下與乙酰輔酶A一起合成酯類物質;有趣的是,在酯類物質形成的過程中會產生丙酮酸和乙酰輔酶A為主的代謝物質,而這兩種物質恰恰是通過MVA途徑和MEP途徑合成萜烯類物質的底物,這也就導致了在貯藏的后期烯類物質開始出現(xiàn)。而施用GA4+7激素后,梨果在貯藏初期的酯類化合物質量分數(shù)明顯增多但隨著貯藏時間的延長其質量分數(shù)會嚴重減少。據此我們推測GA4+7提高了脂氧合酶、HPL酶、ADH酶等的活性,合成酯類、醇類等物質的速度較快,所以在采摘時其揮發(fā)性物質質量分數(shù)較對照高出很多,相應的促進了梨果的成熟度。然而在貯藏過程中梨果中合成酯類香氣物質的酶類物質活性不斷降低,且酯類物質一部分揮發(fā),一部分在梨果中被相關酶類分解,生成其它類的揮發(fā)性物質,如烯類及幾種醇。由此可見GA4+7激素對于梨果香氣物質的形成與轉化有顯著的影響[25-27,32-33]。這說明生長施用植調劑后對梨果貯藏過程中的香氣物質的變化也有顯著影響。

圖4 對照組(a)和處理組(b)在0～4 ℃下貯藏0～200 d中的揮發(fā)性物質主成分分析

圖5 對照組(a)和處理組(b)在0～4 ℃下貯藏0～200 d中的揮發(fā)性物質熱圖分析

2.3 黃冠梨貯藏過程中的特征香氣占比變化

水果香氣由各種揮發(fā)性有機化合物組成,只有把這些芳香性有機物質作為一個整體時,才構成果實的整體香氣特征。為了探索黃冠梨在貯藏過程中的整體香氣特征的變化,我們在“氣味ABC”系統(tǒng)和檢出的香氣成分的基礎上對各個處理組中的特征香韻值進行了計算。相對影響值表示一種香氣成分與芳樟醇相比的強度,芳樟醇的固定值為100。ABC值代表26種氣味分類中一種香氣成分的百分比,26種氣味類別見圖6,數(shù)據顯示在表3中。

如圖6所示,在0～200 d的貯藏期內,梨果中共檢測出18種香型,這些香型中以酯香(A)、果香(F)與青草香(G)的質量分數(shù)最高,是梨果中的主要特征香型。所有香型中質量分數(shù)最高的果香,在對照和GA4+7處理組中的差別也最明顯。與對照(60.0%)中的果香質量分數(shù)相比,GA4+7處理組在貯藏當天的果香質量分數(shù)(75.6%)是最高的。然而隨著貯藏時間的延長,GA4+7處理組中梨果的果香質量分數(shù)則持續(xù)下降,到貯藏結束時質量分數(shù)共下降了36.9%。而對照中梨果的果香質量分數(shù)在貯藏過程中先上升后下降,最后貯藏結束時果香質量分數(shù)與貯藏當天相比下降了15.2%。

酯香是西洋梨的特征香氣之一,主要由氨基酸和脂肪酸的衍生物揮發(fā)產生,也是鴨梨的特征香氣之一[29]。在本研究中,對照中的酯香質量分數(shù)在貯藏過程中由貯藏初期的16.8%下降至貯藏結束后的9.41%;而GA4+7處理組中的酯香質量分數(shù)在開始時是最低的(13.8%),并且隨著貯藏時間的進行,下降到了7.70%。

青草香主要是由C6化合物形成,多在未成熟的梨果果皮中出現(xiàn)[25]。本研究中,貯藏當天,與對照相比,GA4+7處理組中的青草香質量分數(shù)較低(6.28%)。到貯藏結束時,對照組和GA4+7處理組中的青草香質量分數(shù)則由原來的18.7%和6.28%上升至30.8%和39.1%。

我們的分析結果表明,梨果果香的質量分數(shù)與梨果中的酯類物質發(fā)展趨勢一致,而之前的研究也證明果香主要是梨果中帶有果味的酯類物質所貢獻,是梨果成熟期和貯藏期主要的特征香型[25,34]。所以,與對照組相比,GA4+7能增加梨果采摘時的果香香氣。本研究中,酯香和青草香是由少量酯類還有一些醇類和醛類物質共同貢獻出的香氣。由貯藏當天的香韻分析得出,GA4+7處理組中的酯香質量分數(shù)與對照相比差異很小,而青草香質量分數(shù)卻比對照組少很多。這或許是由于梨果采摘時,GA4+7處理組中含有的酯類物質含量高,尤其是能散發(fā)果味的酯類,這“弱化”了梨果青草香在所有香型中的質量分數(shù)。而在貯藏后期,GA4+7處理組中的酯類物質質量分數(shù)下降嚴重,這在“弱化”了果香的同時,也“加強”了其他的香型的質量分數(shù),如青草香。

注:A:酯;B:冰;C:柑橘;D:乳酪;E:食品;F:水果;G:青,綠的;H:藥草;K:松柏;L:芳香族化合物;M:鈴蘭花;N:麻醉性的;O:蘭花;Q:香膏;R:玫瑰;U:動物香;V:香夾蘭;W:木頭;Y:土壤香;Z:有機溶劑。

表3 “香韻ABC”的三個值

表3(續(xù))

3 結 論

本研究探討了貯藏對赤霉素4+7處理過的黃冠梨中揮發(fā)物的影響。從揮發(fā)性物質的種類、質量濃度和數(shù)量、香氣特征質量分數(shù)百分比分布等方面進行綜合分析和評價分析,根據分析結果掌握GA4+7處理過的梨果在貯藏過程中揮發(fā)性物質的變化規(guī)律,全面闡明了在生長期施用GA4+7對梨果實貯藏期間揮發(fā)性成分的影響,最終發(fā)現(xiàn)赤霉素4+7植物生長調節(jié)劑處理過的梨果中的揮發(fā)性物質質量濃度和數(shù)量在貯藏期間下降迅速,尤其含量,到貯藏結束時與對照組相比多下降約13%,盡管其果味香型質量分數(shù)占比在貯藏當天比對照組高15.6%,但在貯藏期間也嚴重下降。這表明GA4+7會改善梨果貯藏初期的揮發(fā)性物質組成,但在貯藏過程中維持時間較短、下降迅速。以上結果為梨貯藏周期的確定和生產管理提供了重要的理論支持。