高遷移率族蛋白1對低氧狀態(tài)下肺動脈平滑肌細胞的影響研究

李鳴遠，李倩，武云

作者單位：830054 新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學科

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一種由多因素所致的呼吸系統(tǒng)疾病，表現(xiàn)為進行性肺血管重塑、肺動脈壓持續(xù)升高，隨著病情持續(xù)進展，會引發(fā)右心室代償性肥厚，最終導致右心衰竭［1］。以中小肺動脈壁增厚和管腔閉塞為特征的肺血管重塑是PAH患者肺血管阻力和肺動脈壓升高的主要原因。肺動脈平滑肌細胞（pulmonary arterial smooth muscle cell，PASMC）作為肺血管壁的主要成分，其異常增殖和遷移是肺血管重塑的主要特征，也是PAH發(fā)生和疾病進展的基礎［2-3］。細胞焦亡是一種新型程序性細胞死亡形式，表現(xiàn)為細胞膜不斷擴張，引起細胞腫脹、破裂，并釋放大量促炎因子。在低氧環(huán)境下PASMC會發(fā)生細胞焦亡，這與PAH的發(fā)病機制密切相關［4］。

高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是一種染色質相關蛋白，在某些應激條件下，其從巨噬細胞、單核細胞、內皮細胞或其他免疫活性細胞中釋放，并通過與受體結合來促進細胞增殖、遷移和分化［5］。HMGB1現(xiàn)已被確定為PAH的生物標志物，在PAH患者的肺組織和血清中HMGB1水平異常升高，并且與疾病嚴重程度呈正相關［6］。HMGB1靶向治療可能成為PAH的有效治療策略。然而，HMGB1如何驅動PAH發(fā)病的分子機制仍有待闡明?；诖?，本研究以PASMC為研究對象，觀察HMGB1對低氧狀態(tài)下PASMC增殖和遷移的影響，并進一步探討HMGB1中和抗體（HMGB1 Ab）治療PAH的可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

本實驗時間為2022年3月—2023年9月。PASMC購于武漢云克隆科技股份有限公司，HMGB1 Ab購于沈陽萬類生物科技有限公司，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體激動劑——單鈉尿酸鹽（monosodium urate，MSU）購于美國InvivoGen公司，胎牛血清、牛血清白蛋白、DMEM培養(yǎng)基及胰酶購于美國Hyclone公司，CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購于上海貝博生物科技有限公司，Triton X-100購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染料購于北京康瑞納生物科技有限公司，TRIzol RNA提取試劑盒購于美國Invitrogen公司，cDNA第一鏈合成試劑盒和探針法熒光定量PCR檢測試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司，Bradford蛋白質定量試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司，封閉用脫脂奶粉購于北京伊塔生物科技有限公司，RIPA裂解液和ECL試劑液購于上海碧云天生物技術研究所，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購于美國Thermo Fisher公司，AlexaFluor 488熒光標記的山羊抗兔IgG抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體購于北京百奧萊博科技有限公司，α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、HMGB1、NLRP3、天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）、gasdermin D（GSDMD）、白介素1β（interleukin 1β，IL-1β）、白介素18（interleukin 18，IL-18）兔多克隆抗體以及GAPDH兔多克隆抗體購于英國Abcam公司。

1.2 PASMC培養(yǎng)、分組及處理

將PASMC置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，常規(guī)傳代，選用第3～5代細胞進行后續(xù)實驗。將PASMC分為4組：（1）對照組：PASMC置于37 ℃、21% O2、5% CO2培養(yǎng)箱中常氧培養(yǎng)24 h；（2）低氧組：PASMC置于37 ℃、3% O2、5% CO2培養(yǎng)箱中低氧培養(yǎng)24 h；（3）HMGB1 Ab組：PASMC置于37 ℃、3% O2、5% CO2培養(yǎng)箱中低氧培養(yǎng)24 h，加入終濃度為20 μg/ml的HMGB1 Ab培養(yǎng)3 h；（4）HMGB1 Ab＋MSU組：PASMC置于37 ℃、3% O2、5% CO2培養(yǎng)箱中低氧培養(yǎng)24 h，加入終濃度為20 μg/ml的HMGB1 Ab培養(yǎng)3 h，然后采用終濃度為200 g/L的MSU活化細胞3 h。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖活力

將PASMC以5×103個/孔的密度種植在96孔板中，每組設置6個復孔，分組及處理同1.2。按照CCK-8細胞增殖檢測試劑盒說明書，每孔加入10 μl CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，采用酶標儀測定各孔在450 nm波長處的OD值，代表細胞增殖活力。

1.4 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力

胰酶消化各組PASMC，制備細胞懸液，按照5×105個/孔的密度將PASMC種植在劃好標記線的6孔板中，生長24 h待細胞鋪滿后，使用10 μl無菌槍頭在細胞的中央?yún)^(qū)域垂直劃線，使劃痕與標記線相交，PBS洗去劃下的細胞。將細胞放入37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。24 h后取出細胞培養(yǎng)板，在顯微鏡下觀察劃痕并拍照，以0 h作為對照，采用Image Pro Plus分析劃痕愈合情況，計算劃痕愈合率〔劃痕愈合率=（0 h劃痕寬度－24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%〕，代表細胞遷移能力。

1.5 免疫熒光染色觀察PASMC中α-SMA表達情況

將PASMC以1×104個/孔的密度種植于含蓋玻片的24孔板上，過夜培養(yǎng)至細胞爬片貼壁后，進行對應分組處理。采用PBS洗滌爬片，采用4%多聚甲醛溶液固定10 min，吸去多余液體，再次采用PBS洗滌后加入0.3%Triton X-100透化10 min，采用PBS洗滌，采用5%牛血清白蛋白封閉非特異性結合位點。在玻片上滴加α-SMA兔多克隆抗體（1∶200），放入濕盒內于4 ℃孵育過夜。次日，采用PBS洗滌后滴加AlexaFluor 488熒光標記的山羊抗兔IgG抗體（1∶500），常溫下避光孵育2 h。采用PBS再次洗滌后，進行DAPI細胞核染色，采用抗熒光淬滅封片劑封固，晾干，熒光共聚焦顯微鏡下觀察細胞染色情況并拍照。

1.6 實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈式反應（real time quantity polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測PASMC中HMGB1及細胞焦亡相關因子（NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18）的mRNA相對表達量

采用TRIzol法提取各組PASMC總RNA，吸取1 μl總RNA樣品，通過微量光度計測定樣品純度與濃度，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA完整性。按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書步驟反轉錄合成cDNA。通過ABI QuantStudio5定量PCR儀測定各目的基因mRNA相對表達量，根據(jù)探針法熒光定量PCR檢測試劑盒說明書配置反應體系，混勻后置于定量系統(tǒng)上，設置反應條件為：95 ℃ 15 min，1個循環(huán)；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，各引物序列見表1，采用2-ΔΔCt法分析目的基因相對表達量，以β-actin為內參基因。實驗重復3次。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.7 Western blot法檢測PASMC中HMGB1及細胞焦亡相關因子（NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18）相對表達量

取各組PASMC，加入適量RIPA裂解液，冰上靜置裂解30 min，于4 ℃條件下以12 000 r/min離心10 min（離心半徑12.5 cm），獲取上清液即為蛋白，采用Bradford法測定其濃度。將蛋白加熱變性，將經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離變性后的等量蛋白電轉至PVDF膜上，采用5%脫脂牛奶封閉非特異性結合位點后，分別加入稀釋的HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18抗體液（1∶1 000），以GAPDH作為內參蛋白，于4 ℃孵育過夜。次日，加入稀釋后的相應二抗液（1∶5 000），室溫孵育1 h，滴加ECL試劑液覆蓋，曝光顯色，采用Image J軟件分析各目的蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白條帶灰度值之比作為蛋白相對表達量。實驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用Gradpad Prism軟件（8.0版本）進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖活力

C C K-8 法檢測結果顯示，對照組、低氧組、HMGB1 Ab組、HMGB1 Ab＋MSU組細胞增殖活力分別為（0.53±0.06）、（0.89±0.09）、（0.55±0.06）、（0.87±0.09）。四組細胞增殖活力比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=32.514，P＜0.001）；其中低氧組細胞增殖活力高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；HMGB1 Ab組細胞增殖活力低于低氧組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；HMGB1 Ab＋MSU組細胞增殖活力高于HMGB1 Ab組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 細胞遷移能力

細胞劃痕實驗檢測結果顯示，對照組、低氧組、HMGB1 Ab組、HMGB1 Ab＋MSU組劃痕愈合率分別為（40.25±4.21）%、（77.56±7.94）%、（41.68±4.30）%、（76.67±7.82）%。四組劃痕愈合率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=241.996，P＜0.001）；其中低氧組劃痕愈合率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；HMGB1 Ab組劃痕愈合率低于低氧組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；HMGB1 Ab＋MSU組劃痕愈合率高于HMGB1 Ab組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 PASMC中α-SMA表達情況

免疫熒光染色結果顯示，與對照組比較，低氧組細胞熒光染色強度明顯增強，α-SMA表達增加；與低氧組比較，HMGB1 Ab組細胞熒光染色強度明顯減弱，α-SMA表達減少；與HMGB1 Ab組比較，HMGB1 Ab＋MSU組細胞熒光染色強度明顯增強，α-SMA表達增加，見圖1。

圖1 各組PASMC中α-SMA表達情況（免疫熒光染色，×100）Figure 1 Expression of α-SMA in PASMC in each group

2.4 PASMC中HMGB1及細胞焦亡相關因子的mRNA相對表達量

qRT-PCR檢測結果顯示，四組PASMC中HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 mRNA相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中低氧組PASMC中HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 mRNA相對表達量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；HMGB1 Ab組PASMC中HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 mRNA相對表達量低于低氧組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；HMGB1 Ab＋MSU組PASMC中HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 mRNA相對表達量高于HMGB1 Ab組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 四組PASMC中HMGB1及細胞焦亡相關因子的mRNA相對表達量比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of mRNA relative expression levels of HMGB1 and pyroptosis related factors in PASMC among the four groups

表2 四組PASMC中HMGB1及細胞焦亡相關因子的mRNA相對表達量比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of mRNA relative expression levels of HMGB1 and pyroptosis related factors in PASMC among the four groups

注：HMGB1 Ab=高遷移率族蛋白1中和抗體，MSU=單鈉尿酸鹽；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與低氧組比較，P＜0.05；c表示與HMGB1 Ab組比較，P＜0.05。

組別HMGB1NLRP3Caspase-1GSDMDIL-1βIL-18對照組1.00±0.061.00±0.051.00±0.061.00±0.061.00±0.051.00±0.06低氧組HMGB1 Ab1.86±0.19a1.72±0.18a1.79±0.18a2.24±0.22a2.30±0.24a1.84±0.18a組1.16±0.11b1.31±0.13b1.35±0.13b1.51±0.13b0.98±0.09b1.01±0.10b HMGB1 Ab＋MSU組1.76±0.11c1.74±0.17c1.76±0.18c2.05±0.21c2.04±0.20c1.80±0.17c F值53.54038.12742.39478.64395.70160.228 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.5 PASMC中HMGB1及細胞焦亡相關因子相對表達量

W e s t e r n b l o t 檢測結果顯示，四組P A S M C中H M G B 1、N L R P 3、C a s p a s e-1、G S D M D、IL-1β、IL-18相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中低氧組PASMC中HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18相對表達量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；HMGB1 Ab組PASMC中HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18相對表達量低于低氧組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；HMGB1 Ab＋MSU組PASMC中HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18相對表達量高于HMGB1 Ab組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3、圖2。

圖2 Western blot法檢測四組PASMC中HMGB1及細胞焦亡相關因子相對表達量的SDS-PAGE圖Figure 2 Electrophoretic map of protein relative expression levels of HMGB1 and pyroptosis related factors in PASMC of four groups

表3 四組PASMC中HMGB1及細胞焦亡相關因子相對表達量比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of protein relative expression levels of HMGB1 and pyroptosis related factors in PASMC among the four groups

表3 四組PASMC中HMGB1及細胞焦亡相關因子相對表達量比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of protein relative expression levels of HMGB1 and pyroptosis related factors in PASMC among the four groups

注：a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與低氧組比較，P＜0.05；c表示與HMGB1 Ab組比較，P＜0.05。

組別HMGB1NLRP3Caspase-1GSDMDIL-1βIL-18對照組低氧組0.26±0.030.08±0.010.19±0.020.35±0.030.30±0.030.28±0.03 0.94±0.09a0.76±0.08a0.83±0.08a1.10±0.12a1.18±0.13a0.94±0.09a HMGB1 Ab組0.21±0.02b0.14±0.01b0.29±0.03b0.37±0.04b0.18±0.02b0.26±0.03b HMGB1 Ab＋MSU組0.89±0.08c0.77±0.08c0.81±0.08c1.02±0.10c1.01±0.11c0.92±0.10c F值36.21528.49033.54350.21147.76935.608 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

3 討論

PAH作為一種慢性破壞性心肺疾病，對人類健康造成嚴重威脅，遺傳因素和環(huán)境因素均是PAH發(fā)生發(fā)展的主要因素，長期暴露于高海拔或繼發(fā)性肺部疾病狀態(tài)可造成肺泡缺氧，導致肺動脈壓逐漸升高，造成心肺結構與功能被破壞［7-8］。PASMC具有收縮和舒張功能，可調節(jié)血壓和血流量，維持血液循環(huán)。正常狀態(tài)下，PASMC處于穩(wěn)定的終末分化階段，表現(xiàn)為收縮型；而缺氧引起血管收縮異常，導致肺血管阻力可逆性增加，使PASMC由收縮型向合成型轉化，并獲得異常的增殖和遷移能力，引起肺血管重塑［9］。α-SMA是PASMC由收縮型向合成型轉化的標志物［10］。為了探索PAH發(fā)展的機制及有效治療方案，通常采用低氧誘導PASMC來模擬體外PAH模型。本研究結果顯示，低氧狀態(tài)下PASMC增殖、遷移能力異常增高，α-SMA表達也明顯增加。

HMGB1是一種普遍存在的DNA結合蛋白，在各種病理生理過程中起著重要作用。HMGB1可以從壞死或受損細胞中被動釋放，在低氧條件下也可以由免疫細胞或組織主動分泌。當HMGB1進入細胞外空間時，能夠與受體結合，并作為損傷相關分子發(fā)揮作用；此外，HMGB1還通過作用于模式識別受體來傳導細胞信號，誘導促炎細胞因子的釋放，并加速炎癥反應［11-13］。目前，大量研究表明，HMGB1在PAH的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，其可能是PAH的潛在治療靶點［14-15］。ZABINI等［16］在特發(fā)性PAH和PAH患者血清中均檢測到HMGB1水平升高，并發(fā)現(xiàn)HMGB1通過激活c-Jun氨基末端激酶而促進PASMC和原代人動脈內皮細胞（primary arterial endothelial cell，PAEC）的增殖，從而誘導血管重塑；ZHANG等［17］研究表明，HMGB1通過上調內質網(wǎng)應激相關蛋白表達而促進PASMC的增殖和遷移，并發(fā)現(xiàn)利用甘草酸干擾HMGB1表達或4-苯基丁酸抑制內質網(wǎng)應激均能夠減緩PAH的進展；LI等［18］研究指出，HMGB1介導的晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）表達的增加促進了炎癥反應，導致嚴重的肺功能障礙，加重了缺氧性PAH的癥狀。本研究結果顯示，加入HMGB1 Ab處理后，PASMC增殖、遷移能力降低，α-SMA表達也明顯減少，表明HMGB1 Ab能夠抑制低氧誘導的PASMC異常增殖與遷移。

細胞焦亡是不同于凋亡和壞死的細胞死亡形式，NLRP3炎癥小體是介導細胞焦亡的關鍵因子，其與ASC相互作用，募集Caspase-1前體并促進Caspase-1成熟體的產(chǎn)生，一方面，激活的Caspase-1剪切GSDMD后形成GSDMD-N端片段，該片段與脂質結合后會破壞細胞膜，并釋放大量促炎因子；另一方面，激活的Caspase-1促進促炎細胞因子IL-1β和IL-18的成熟與釋放，從而招募炎性細胞聚集，加重炎癥反應［19-21］。近年來，關于細胞焦亡參與PAH的研究報道越來越多，在低氧狀態(tài)下PASMC焦亡水平明顯增加，而敲低PASMC中的程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PD-1）可抑制細胞焦亡，并減輕肺血管纖維化［22］；低氧可誘導膠質瘤相關癌基因家族鋅指1（gliomaassociated oncogene family zinc finger 1，GLI1）異常表達，而抑制GLI1可減弱PASMC焦亡，起到抑制PAH進展的作用［23］；敲低驅動蛋白家族成員23（kinesin family member 23，KIF23）可抑制PASMC焦亡和增殖，進而抑制PAH中肺動脈壓升高、右心室肥厚和降低肺血管阻力［24］。本研究結果顯示，HMGB1 Ab可以抑制PASMC中HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 mRNA及其蛋白相對表達量，推測HMGB1 Ab抑制低氧誘導的PASMC異常增殖與遷移的作用可能與調控細胞焦亡有關。為了進一步驗證這一推測，采用NLRP3炎癥小體激動劑——MSU處理PASMC，結果顯示，PASMC增殖、遷移能力又明顯升高，α-SMA表達明顯增加，同時HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 mRNA及其蛋白相對表達量升高，提示HMGB1 Ab通過抑制細胞焦亡來抑制低氧誘導的PASMC異常增殖與遷移。

4 結論

綜上所述，HMGB1與低氧狀態(tài)下PASMC增殖、遷移相關，HMGB1 Ab能夠抑制低氧誘導的PASMC異常增殖與遷移，該作用與其抑制細胞焦亡有關，這可為PAH的治療提供新思路。但本研究僅從細胞水平上證實了HMGB1對低氧狀態(tài)下PASMC的影響，而HMGB1參與PAH發(fā)生發(fā)展的具體機制仍未完全闡明，HMGB1 Ab能否在體內通過抑制PASMC異常增殖和遷移來改善肺血管重塑仍有待進一步探討。

作者貢獻：李鳴遠、武云進行文章的構思與設計；李鳴遠、李倩進行研究的實施與可行性分析，資料收集、整理；李鳴遠進行論文撰寫，統(tǒng)計學處理；武云進行論文的修訂，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。