肝癌銅死亡相關(guān)基因及其與預(yù)后、免疫浸潤的關(guān)系分析

陳偉毅，胡柯，劉雨，彭靖，李小成，段紹毅，陳立軍，楊騏彰

（湖南醫(yī)藥學(xué)院 1.醫(yī)學(xué)院 2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 懷化 418000；3.湖南醫(yī)藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院 普通外科，湖南 懷化 418000）

方法：從TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫下載肝癌和正常肝臟組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)和突變分析。采用R語言“clusterProfiler”包進(jìn)行GO和KEGG富集分析。采用LASSO、單因素和多因素回歸分析篩選影響肝癌患者預(yù)后的基因并構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)因子圖。使用R包“rms”構(gòu)建列線圖。使用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析銅死亡相關(guān)基因與肝癌臨床病理特征的關(guān)系并驗(yàn)證。使用Spearman相關(guān)性分析銅死亡相關(guān)基因與免疫細(xì)胞浸潤和免疫檢查點(diǎn)的相關(guān)性。采用TIMER2.0數(shù)據(jù)庫分析銅死亡相關(guān)基因表達(dá)與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）浸潤的相關(guān)性，采用TISDB數(shù)據(jù)庫分析CDKN2A和DLAT表達(dá)與髓源抑制性細(xì)胞（MDSC）浸潤豐度的相關(guān)性。

結(jié)果：與正常肝臟組織比較，9個(gè)銅死亡相關(guān)基因在肝癌中表達(dá)顯著升高，CDKN2A突變頻率最高。銅死亡相關(guān)基因主要參與蛋白質(zhì)脂酰化、三羧酸循環(huán)、檸檬酸循環(huán)等生物過程。基于LASSO、單因素與多因素回歸分析篩選出影響肝癌患者總體生存率（OS）的基因CDKN2A和DLAT，并以此構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)因子圖，時(shí)間依賴性受試者工作特征曲線顯示其具有較好的預(yù)測能力。通過單因素和多因素回歸分析篩選出CDKN2A、DLAT、T分期和腫瘤狀態(tài)是影響肝癌患者OS的獨(dú)立預(yù)后因素，基于上述因素構(gòu)建了列線圖，校正曲線顯示該列線圖預(yù)測和實(shí)際觀察之間有很好的一致性。UALCAN數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)CDKN2A、DLAT與肝癌臨床分期、腫瘤分級有關(guān)，且GEO數(shù)據(jù)庫、HPA數(shù)據(jù)庫及肝癌細(xì)胞中的驗(yàn)證結(jié)果與之一致。相關(guān)性分析顯示，CDKN2A和DLAT表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤和免疫檢查點(diǎn)表達(dá)相關(guān)；TIMER2.0數(shù)據(jù)庫分析顯示，DLAT表達(dá)與CAF浸潤明顯正相關(guān)；TISDB數(shù)據(jù)庫分析顯示，CDKN2A和DLAT表達(dá)與MDSC浸潤豐度無相關(guān)性。

結(jié)論：銅死亡相關(guān)基因CDKN2A、DLAT可能是肝癌新的預(yù)后生物標(biāo)志物和免疫治療的新靶點(diǎn)。

原發(fā)性肝癌又稱為肝癌，是消化道惡性腫瘤之一[1]。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，肝癌發(fā)病率在全國癌癥發(fā)病率中占第4位，病死率占癌癥死因第2位，因此肝癌已成為嚴(yán)重危害人們身體健康的主要疾病之一[2]。針對肝癌的治療，首選手術(shù)切除，然而由于肝癌發(fā)病隱匿、侵襲性強(qiáng)、進(jìn)展迅速、早期診斷困難，大多數(shù)肝癌患者在確診時(shí)往往已進(jìn)入疾病的中晚期或發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，而其他的治療如局部射頻消融、經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞、全身化療等效果并不理想[3-4]。因此，尋找新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)對提高肝癌的臨床療效至關(guān)重要。

最近，一種新的細(xì)胞死亡形式—銅死亡被發(fā)現(xiàn)[5]。銅死亡是由于銅離子在細(xì)胞內(nèi)的過度積累導(dǎo)致硫辛?；鞍桩惓＞奂蓴_線粒體呼吸相關(guān)的鐵硫簇蛋白，引起蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，與目前已知的其他細(xì)胞死亡形式，如細(xì)胞凋亡、鐵死亡、自噬和程序性壞死等均不同[6-7]。

研究[8-9]發(fā)現(xiàn)銅離子水平在肝癌患者血清及肝臟中明顯升高，血清銅和銅藍(lán)蛋白水平可作為檢測肝癌的標(biāo)志物。有研究[10]報(bào)道肝癌患者血清銅離子水平與肝癌特異性生存期和總體生存期顯著相關(guān)，表明血清銅水平可能是肝癌患者生存期的獨(dú)立預(yù)測因子。同時(shí)有文獻(xiàn)[11]表明使用銅處理肝癌細(xì)胞可增強(qiáng)其增殖和遷移能力。上述研究表明銅離子在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，誘導(dǎo)銅死亡可能是治療肝癌一個(gè)新的途徑。

因此，本研究采用生物信息學(xué)方法研究銅死亡相關(guān)基因與肝癌預(yù)后和免疫浸潤的關(guān)系，以期為肝癌的治療和預(yù)后評估提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從TCGA數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov）中下載了來自肝癌（TCGA-LIHC）隊(duì)列的424例樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及其臨床信息，其中正常肝臟組織樣本53例，肝癌組織樣本371例（表1），去除臨床信息缺失的樣本，從Genotype-Tissue Expression（GTEx）（https://commonfund.nih.gov/GTEx）數(shù)據(jù)庫下載了110例正常肝臟組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。采用R（4.2.1）軟件將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為Transcripts per million（TPM）格式，并轉(zhuǎn)換為log2（TPM+1）。

表1 TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中肝癌患者的臨床信息[n（%）]Table 1 The clinical information of liver cancer patients in the TCGA-LIHC dataset [n (%)]

1.2 方法

1.2.1 銅死亡相關(guān)基因表達(dá)差異和突變分析 10個(gè)銅死亡相關(guān)基因（LIPT1、CDKN2A、GLS、FDX1、MTF1、PDHA、DLAT、LIAS、PDHB、DLD）來源于Tsvetkov等[12]的一項(xiàng)報(bào)道。采用Wilcoxon rank sum test比較銅死亡相關(guān)基因在肝癌組織和正常肝臟組織中的表達(dá)差異。采用R軟件中的“maftools”分析銅死亡相關(guān)基因的突變景觀。

1.2.2 GO和KEGG富集分析、蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò) 使用R軟件中的“clusterProfiler”包對銅死亡相關(guān)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，采用GeneMANIA網(wǎng)站（http://genemania.org）構(gòu)建PPI互作網(wǎng)絡(luò)。

1.2.3 風(fēng)險(xiǎn)因子圖構(gòu)建 首先采用LASSO回歸分析來縮小基因范圍，之后通過單因素和多因素回歸分析篩選影響肝癌患者總體生存率（overall survival，OS）的預(yù)后基因。根據(jù)多因素回歸結(jié)果，采用公式計(jì)算患者風(fēng)險(xiǎn)評分=∑（每個(gè)基因表達(dá)量×多因素回歸系數(shù)），根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分的中位數(shù)將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，并構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)因子圖。采用Kaplan-Meier生存曲線比較高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組患者OS的差異。采用R包“Survival ROC”繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析風(fēng)險(xiǎn)因子圖預(yù)測患者OS的特異度和敏感度。采用Kaplan-Meier生存曲線比較CDKN2A/DLAT/GLS高表達(dá)組與低表達(dá)組之間患者OS的差異。

1.2.4 列線圖構(gòu)建 采用單因素和多因素回歸分析篩選影響肝癌患者OS的獨(dú)立預(yù)后因素，然后基于上述因素使用R包“rms”構(gòu)建列線圖，繪制校正曲線評估列線圖的預(yù)測準(zhǔn)確性。

1.2.5 CDKN2A和DLAT在肝癌不同臨床病理特征的表達(dá)差異 采用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析CDKN2A和DLAT在肝癌各個(gè)臨床分期、腫瘤分級之間的表達(dá)差異。

1.2.6 CDKN2A和DLAT在肝癌中的表達(dá)驗(yàn)證 從GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載GSE144269、GSE207435兩個(gè)數(shù)據(jù)集，GSE144269包含70例配對肝癌組織樣本，GSE207435包含27例配對肝癌組織樣本，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較CDKN2A和DLAT在肝癌組織和正常肝臟組織中的表達(dá)差異。利用人類蛋白圖譜（HPA）（https://www.proteinatlas.org）數(shù)據(jù)庫中的組織化學(xué)染色驗(yàn)證CDKN2A和DLAT蛋白在肝癌組織和正常肝臟組織中的表達(dá)差異。

1.2.7 細(xì)胞來源及細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌HepG2、HuH-7細(xì)胞、人正常肝細(xì)胞QSG-7701購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.8 Western blot檢測蛋白表達(dá) 使用RIPA裂解液對不同細(xì)胞冰上裂解30 min，10 000 r/min離心15 min，取上清，使用BCA法測定蛋白濃度。加入5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液，95 ℃加熱10 min使蛋白變性后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗（1∶1 000）4 ℃過夜孵育。TBST洗膜后，與一抗相應(yīng)種屬的二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h。TBST洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算蛋白相對表達(dá)量。CDKN2A、DLAT、GAPDH抗體均購自美國Abcam公司。

1.2.9 免疫浸潤相關(guān)性分析 采用R包“GSVA”中的ssGSEA法計(jì)算24種免疫細(xì)胞（aDC、B cells、CD8 T cells、cytotoxic cells、DC、eosinophils、iDC、macrophages、mast cells、neutrophils、NK CD56bright cells、NK CD56dim cells、NK cells、pDC、T cells、T helper cells、Tcm、Tem、Tfh、Tgd、Th1 cells、Th17 cells、Th2 cells、Treg）的浸潤豐度，利用Spearman相關(guān)性分析CDKN2A和DLAT表達(dá)與24種免疫細(xì)胞浸潤豐度的相關(guān)性。采用TIMER2.0數(shù)據(jù)庫分析CDKN2A和DLAT表達(dá)與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblast，CAF）細(xì)胞浸潤的相關(guān)性，采用TISDB數(shù)據(jù)庫分析CDKN2A和DLAT表達(dá)與髓源抑制性細(xì)胞（MDSC）浸潤豐度的相關(guān)性。采用Spearman相關(guān)性分析CDKN2A/DLAT表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)CD274、CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1、TIGIT、PDCD1LG2表達(dá)之間的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用R（4.2.1）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 銅死亡相關(guān)基因在肝癌中的表達(dá)、相關(guān)性及突變情況

在10個(gè)銅死亡相關(guān)基因中，9個(gè)基因（CDKN2A、DLD、DLAT、LIAS、GLS、LIPT1、MTF1、PDHA1、PDHB）在肝癌組織中表達(dá)明顯升高（均P<0.05），1個(gè)基因（FDX1）在肝癌組織和正常肝組織中表達(dá)無明顯差異（P>0.05）（圖1A）。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)10個(gè)銅死亡相關(guān)基因彼此互相關(guān)聯(lián)，其中DLAT與MTF1呈高度正相關(guān)（r=0.567，P<0.001）（圖1B-C）。基因突變分析發(fā)現(xiàn)在364例肝癌樣本中，有18例樣本銅死亡相關(guān)基因發(fā)生了體細(xì)胞突變，占4.95%（圖1D），其中錯(cuò)義突變是最常見的突變類型，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是最普遍的DNA變異，C>T和C>A是最常見的單核苷酸變異類型，CDKN2A突變頻率最高（圖1E）。

圖1 銅死亡相關(guān)基因在肝癌中的表達(dá)、相關(guān)性和突變情況 A：銅死亡相關(guān)基因在肝癌組織和正常肝組織中的表達(dá)差異；B：銅死亡相關(guān)基因的相關(guān)性分析；C：DLAT與MTF1的相關(guān)性；D-E：銅死亡相關(guān)基因的突變頻率和突變類型Figure 1 Expression pattern, correlation and mutation of cuproptosis-related genes in liver cancer A: The expression of cuproptosis-related genes in liver cancer and normal tissues; B: Correlation between the expression of cuproptosis-related genes; C: Correlation between the expression of DLAT and MTF1; D-E: Mutation frequency and classification of cuproptosis-related genes in liver cancer

2.2 銅死亡相關(guān)基因GO、KEGG富集分析和PPI網(wǎng)絡(luò)

對10個(gè)銅死亡相關(guān)基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果顯示，10個(gè)基因主要參與乙酰輔酶A從丙酮酸生物合成過程、蛋白質(zhì)脂?；⑷人嵫h(huán)、葡萄糖代謝過程、氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)功能（圖2A）。KEGG富集分析顯示，10個(gè)基因主要參與硫辛酸代謝、檸檬酸（TCA）循環(huán)、丙酮酸代謝、糖酵解/糖異生、癌癥的中心碳代謝等（圖2B）。利用GeneMANIA網(wǎng)站構(gòu)建了10個(gè)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)DLAT、PDHB、DLD、PDHA1為核心基因（圖2C）。

圖2 GO、KEGG富集分析和PPI網(wǎng)絡(luò) A：GO富集分析；B：KEGG 富集分析；C：PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 2 GO, KEGG pathway enrichment and PPI network analysis A: GO enrichment analysis; B: KEGG pathway enrichment analysis; C: PPI network analysis

2.3 基于銅死亡相關(guān)基因的風(fēng)險(xiǎn)因子圖構(gòu)建

首先對10個(gè)銅死亡相關(guān)基因進(jìn)行LASSO回歸以縮小基因范圍，從中篩選出CDKN2A、DLAT、GLS和LIPT1等四個(gè)肝癌OS預(yù)后相關(guān)基因（圖3），然后采用單因素和多因素回歸分析，確定CDKN2A和DLAT是影響肝癌患者OS的預(yù)后相關(guān)基因（表2）。根據(jù)公式：風(fēng)險(xiǎn)評分=0.573×CDKN2A表達(dá)量+0.409×DLAT表達(dá)量，計(jì)算肝癌患者的風(fēng)險(xiǎn)評分。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分的中位數(shù)，將肝癌患者分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組，并構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)因子圖（圖4A）。Kaplan-Meier生存分析顯示低風(fēng)險(xiǎn)組患者比高風(fēng)險(xiǎn)組患者有更好的OS（圖4B）。時(shí)間依賴性ROC曲線顯示風(fēng)險(xiǎn)因子模型1、3、5年的曲線下面積（area under curve，AUC）值分別為0.736、0.642、0.630，表明該模型具有較好的預(yù)測能力（圖4C）。Kaplan-Meier生存分析顯示低表達(dá)CDKN2A、DLAT、GLS患者比高表達(dá)CDKN2A、DLAT、GLS患者有更好的OS（圖4D-F）。

圖3 銅死亡相關(guān)基因LASSO回歸分析Figure 3 Cuproptosis-related genes screened by the Lasso cox regression analysis

圖4 基于銅死亡相關(guān)基因的風(fēng)險(xiǎn)因子圖構(gòu)建 A：基于CDKN2A和DLAT的風(fēng)險(xiǎn)因子圖；B：Kaplan-Meier生存曲線比較高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組患者OS；C：時(shí)間依賴ROC曲線評估風(fēng)險(xiǎn)因子圖模型預(yù)測能力；D-F：CDKN2A、DLAT、GLS高表達(dá)組和低表達(dá)組患者Kaplan-Meier生存曲線比較Figure 4 Construction of the risk score model of cuproptosis-related genes in liver cancer A: The risk score model based on CDKN2A and DLAT; B: Kaplan-Meier survival analysis of the high-risk group and low-risk group; C: Time-dependent ROC curves assessing the prediction ability of the risk score model; D-F: Comparison of Meier survival curves between patients with high and low CDKN2A, DLAT and GLS expressions

表2 單因素和多因素Cox回歸分析篩選OS相關(guān)因素Table 2 Univariate and multivariate Cox regression analysis of factors for OS

2.4 基于銅死亡相關(guān)基因的肝癌預(yù)后列線圖的構(gòu)建與驗(yàn)證

通過單因素和多因素Cox回歸分析，確定CDKN2A、DLAT、T分期和腫瘤狀態(tài)是肝癌患者OS的獨(dú)立預(yù)后因素（圖5A-B），基于上述因素構(gòu)建了預(yù)測肝癌患者1、3、5年OS的列線圖（圖5C）。校正曲線顯示該列線圖預(yù)測和實(shí)際觀察之間有很好的一致性（圖5D）。

圖5 基于銅死亡相關(guān)基因肝癌患者預(yù)后列線圖構(gòu)建 A：單因素回歸分析；B：多因素回歸分析；C：列線圖預(yù)測肝癌患者1、3、5年OS；D：校準(zhǔn)曲線Figure 5 Construction of nomogram for prognosis in liver cancer patients A: Univariate analysis; B: Multivariate analysis;C: Nomogram for predicting 1-, 3-, and 5-year OS in liver cancer patients; D: The calibration curves for the nomogram

2.5 銅死亡相關(guān)基因CDKN2A和DLAT與肝癌臨床病理特征的關(guān)系

采用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析CDKN2A和DLAT與肝癌臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果顯示，CDKN2A在肝癌臨床分期1、2、3期中的表達(dá)均顯著高于正常組織，其中在臨床2、3期的表達(dá)均明顯高于臨床1、4期，表明CDKN2A與肝癌臨床分期相關(guān)（圖6A）。其次，CDKN2A在肝癌各腫瘤分級中的表達(dá)均明顯高于正常組織，并隨著腫瘤分級增加而不斷增高，其中在腫瘤3級的表達(dá)明顯高于腫瘤1、2級，表明CDKN2A與肝癌腫瘤分級相關(guān)（圖6B）。DLAT在肝癌臨床分期1、2、3期表達(dá)均明顯高于正常組織，但各分期之間表達(dá)無明顯差異（圖6C）。DLAT在肝癌各腫瘤分級中的表達(dá)均明顯高于正常組織，并隨著腫瘤分級增加而不斷增高，其中在腫瘤2、3級的表達(dá)明顯高于腫瘤1級，表明DLAT與肝癌腫瘤分級相關(guān)（圖6D）。

圖6 CDKN2A和DLAT在肝癌不同臨床病理特征中的表達(dá) A-B：CDKN2A在肝癌各臨床分期和腫瘤分級中的表達(dá)；C-D：DLAT在肝癌各臨床分期和腫瘤分級中的表達(dá)Figure 6 Expression of CDKN2A and DLAT in liver cancer with different clinicopathologic features A-B: CDKN2A expressions in different clinical stages and tumor grades; C-D: DLAT expressions in different clinical stages and tumor grades

2.6 銅死亡相關(guān)基因CDKN2A和DLAT在肝癌中的表達(dá)驗(yàn)證

從GEO數(shù)據(jù)庫中下載數(shù)據(jù)集GSE144269和GSE207435，分析CDKN2A和DLAT在肝癌中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDKN2A和DLAT在肝癌組織中的表達(dá)均明顯高于正常組織（均P<0.05）（圖7A-D）。HPA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)CDKN2A和DLAT在肝癌組織中的表達(dá)均明顯高于正常組織（圖7E-F）。采用Western blot檢測CDKN2A、DLAT在肝癌細(xì)胞HuH-7、HepG2和肝細(xì)胞QSG-7701中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CDKN2A、DLAT在肝癌細(xì)胞HuH-7和HepG2中的表達(dá)均明顯高于肝細(xì)胞QSG-7701（均P<0.05）（圖7G-H）。

圖7 CDKN2A和DLAT在肝癌中的表達(dá)驗(yàn)證 A-D：CDKN2A和DLAT在GSE144269/GSE207435中的表達(dá)分析；E-F：HPA數(shù)據(jù)庫分析CDKN2A和DLAT在肝癌組織中的表達(dá)；G-H：Western blot檢測CDKN2A和DLAT表達(dá)Figure 7 Validation of differential expression of CDKN2A and DLAT in liver cancer A-D: CDKN2A and DLAT expressions in GSE144269 and GSE207435; E-F: CDKN2A and DLAT expression in HPA dataset; G-H: The protein expressions of CDKN2A and DLAT measured by Western blot analysis

2.7 銅死亡相關(guān)基因CDKN2A和DLAT與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性

采用Spearman相關(guān)性分析了CDKN2A和DLAT表達(dá)與24種免疫細(xì)胞浸潤豐度的相關(guān)性，結(jié)果顯示：CDKN2A表達(dá)與Th2 cells、aDC等免疫細(xì)胞浸潤豐度呈明顯正相關(guān)，與eosinophils、CD8 T cells、NK cells、Th17 cells、mast cells、neutrophils、iDC、DC等免疫細(xì)胞浸潤豐度呈明顯負(fù)相關(guān)（圖8A）。DLAT表達(dá)與Tcm、T helper cells、Tem、Th2 cells、macrophages等免疫細(xì)胞浸潤豐度呈明顯正相關(guān)，與cytotoxic cells、pDC、Th17 cells、DC、B cells、NK CD56dim cells等免疫細(xì)胞浸潤豐度呈明顯負(fù)相關(guān)（圖8B）。采用TIMER2.0數(shù)據(jù)庫分析CDKN2A和DLAT表達(dá)與Cancer associated fibroblast（CAF）細(xì)胞浸潤的相關(guān)性，結(jié)果顯示：CDKN2A表達(dá)與CAF浸潤無相關(guān)性，DLAT表達(dá)與CAF細(xì)胞浸潤明顯正相關(guān)（圖8C-D）。采用TISDB數(shù)據(jù)庫分析CDKN2A和DLAT表達(dá)與MDSC細(xì)胞浸潤豐度的相關(guān)性，結(jié)果顯示，CDKN2A和DLAT表達(dá)與MDSC細(xì)胞浸潤豐度無相關(guān)性（圖8E-F）。

圖8 CDKN2A和DLAT與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性 A：CDKN2A；B：DLAT；C-D：CDKN2A和DLAT與CAF細(xì)胞浸潤相關(guān)性；E-F：CDKN2A和DLAT與MDSC細(xì)胞浸潤豐度相關(guān)性Figure 8 Correlation of CDKN2A and DLAT with immune cell infiltration in liver cancer A: CDKN2A; B: DLAT; C-D:The correlation of CDKN2A and DLAT with CAF infiltration; E-F: The correlation of CDKN2A and DLAT with MDSC infiltration abundance

2.8 銅死亡相關(guān)基因CDKN2A和DLAT與免疫檢查點(diǎn)的相關(guān)性

CDKN2A、DLAT與免疫檢查點(diǎn)相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CDKN2A表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)CD274、CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1、TIGIT等呈明顯正相關(guān)（圖9A-F），DLAT表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)CD274、HAVCR2、PDCD1LG2、TIGIT等呈明顯正相關(guān)（圖9G-J）。

3 討 論

肝癌是消化系統(tǒng)一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速、惡性程度高，臨床缺乏有效的治療手段。因此，迫切需要尋找肝癌新的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[13]。銅死亡是一種銅依賴的、程序性的、新的細(xì)胞死亡方式，繼發(fā)于銅過載誘發(fā)的線粒體功能受損[14-15]。銅死亡與肝癌的關(guān)系目前尚不清楚。本研究擬分析銅死亡相關(guān)基因在肝癌中的作用，并借此發(fā)掘出新的肝癌篩查、治療及預(yù)后評估手段。

本研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)銅死亡相關(guān)基因在肝癌中表達(dá)顯著升高，并且銅死亡相關(guān)基因在肝癌樣本中有一定的突變率。該研究結(jié)果與Zhang等[16-18]研究結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)銅離子可以促使肝癌生長和轉(zhuǎn)移，因此肝癌組織傾向于保持較高濃度的銅離子。但肝癌并不會(huì)發(fā)生銅死亡[19]，其原因可能是由于銅死亡相關(guān)基因在肝癌中表達(dá)失衡和突變，促使肝癌能夠逃避銅死亡。因此，如果能夠糾正銅死亡相關(guān)基因的表達(dá)失衡和突變，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞銅死亡，可能是治療肝癌的一種新的途徑。

之后本研究從10個(gè)銅死亡相關(guān)基因中篩選出CDKN2A和DLAT，并基于這2個(gè)基因構(gòu)建了風(fēng)險(xiǎn)因子模型，時(shí)間依賴曲線顯示該模型具有較好的預(yù)測能力。與本研究結(jié)果相反，Chen等[20]采用了5個(gè)銅死亡相關(guān)基因構(gòu)建了肝癌風(fēng)險(xiǎn)因子模型；Liu等[21]建立了9個(gè)基因的肝癌風(fēng)險(xiǎn)因子模型。上述研究結(jié)果的差異主要是由于采用篩選的銅死亡相關(guān)基因不同。本研究采用的是Tsvetkov等[12]報(bào)道的10個(gè)銅死亡相關(guān)基因，Chen等[20]選用的是在肝癌中發(fā)現(xiàn)的136個(gè)銅死亡相關(guān)基因，而Liu等[21]是將銅死亡相關(guān)的mRNA和lncRNA聯(lián)合起來進(jìn)行篩選。

列線圖是腫瘤預(yù)后評估的常用工具[22-23]。相較于傳統(tǒng)的腫瘤TNM分期系統(tǒng)，列線圖包含更詳細(xì)的臨床信息，可以提供更準(zhǔn)確的患者生存概率估計(jì)[24-25]。Chen等[26]將TNM分期、年齡和銅死亡相關(guān)lncRNA風(fēng)險(xiǎn)評分作為參數(shù)構(gòu)建肝癌患者列線圖預(yù)測預(yù)后，并具有較高的準(zhǔn)確性。Liu等[27]將腫瘤分期和銅死亡相關(guān)基因風(fēng)險(xiǎn)評分作為參數(shù)構(gòu)建了肝癌患者預(yù)后列線圖，具有較好的預(yù)測效果。本研究首次將CDKN2A、DLAT、T分期和腫瘤狀態(tài)納入預(yù)測因素構(gòu)建肝癌患者的預(yù)后列線圖，校正曲線顯示該列線圖預(yù)測和實(shí)際觀察之間有很好的一致性。因此，本研究所建立的列線圖可以為臨床醫(yī)生評估肝癌患者預(yù)后以及制定個(gè)性化治療方案提供一種新的、更有效的方法。

腫瘤微環(huán)境中的免疫浸潤細(xì)胞在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[28]，并嚴(yán)重影響患者的臨床預(yù)后[29-30]。本研究首先發(fā)現(xiàn)CDKN2A和DLAT與肝癌患者預(yù)后相關(guān)，之后發(fā)現(xiàn)CDKN2A和DLAT與Th2 cells、aDC、T helper cells等免疫細(xì)胞浸潤，以及CD274、CTLA4、HAVCR2等免疫檢查點(diǎn)表達(dá)相關(guān)。因此，本研究認(rèn)為CDKN2A和DLAT可能通過影響免疫細(xì)胞浸潤和免疫檢查點(diǎn)表達(dá)，影響肝癌患者預(yù)后。CDKN2A和DLAT可能是肝癌免疫治療的潛在靶點(diǎn)。

然而本研究也存在一些局限：第一，本研究只采用TCGA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了肝癌患者的預(yù)后模型，沒有外部數(shù)據(jù)集進(jìn)一步驗(yàn)證；第二，對于CDKN2A和DLAT在肝癌中的表達(dá)，缺乏臨床樣本的驗(yàn)證；第三，對于CDKN2A和DLAT與肝癌免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性，僅采用生物信息學(xué)方法分析，沒有進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究全面分析了銅死亡相關(guān)基因在肝癌中的表達(dá)特征。其中銅死亡相關(guān)基因CDKN2A和DLAT在肝癌中表達(dá)顯著升高，基于CDKN2A和DLAT構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)因子圖能夠很好地預(yù)測肝癌患者預(yù)后，CDKN2A和DLAT表達(dá)與肝癌臨床分期、免疫細(xì)胞浸潤和免疫檢查點(diǎn)表達(dá)等顯著相關(guān)。因此，CDKN2A和DLAT有望成為肝癌新的預(yù)后生物標(biāo)志物和免疫治療的新靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：陳偉毅負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)、起草論文和修改論文；胡柯和劉雨負(fù)責(zé)起草論文和修改論文；彭靖、李小成和陳立軍負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)獲取、整理和分析，段紹毅和楊騏彰負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析和作圖。