前蛋白轉化酶枯草溶菌素9在慢性肝病的作用與機制研究進展

方開晗，彭秀達，費書珂

（南華大學衡陽醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院 肝膽胰脾外科，湖南 衡陽 421001）

前蛋白轉化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）是前蛋白轉化酶家族第九個成員，屬于絲氨酸蛋白酶[1]。PCSK9通過降解肝細胞膜表面低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）而升高血漿低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C），促進慢性肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展[2-3]。近年來，越來越多的研究表明，PCSK9在脂質(zhì)代謝及腫瘤免疫中發(fā)揮關鍵作用，包括家族性遺傳性高膽固醇血癥（familial hypercholesterolemia，F(xiàn)H）[4]、肝癌[5]、肺癌[6]、乳腺癌[7]等。通過使用PCSK9抑制劑可有效減少高膽固醇血癥所致的慢性肝臟疾病的發(fā)生，并且參與抑制多種腫瘤的作用[8]。本綜述重點闡述PCSK9在慢性肝臟疾病進展中的作用與機制，探索靶向PCSK9在慢性肝臟疾病治療中的潛在價值。

1 PCSK9概述

1.1 PCSK9結構與作用

PCSK9蛋白由前結構域、信號肽、催化結構域和C端結構域組成，主要在肝臟中合成與分泌，在胃腸道、胰腺、腎臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也有表達[9]。PCSK9基因位于人類染色體1p32.3上，其基因突變分為兩種類型：功能獲得性突變（gain of function，GOF）和功能喪失性突變（loss of function，LOF），其中PCSK9的GOF突變體與LDLR親和力較強。在循環(huán)系統(tǒng)中，血漿LDL-C主要通過肝細胞膜表面LDLR轉運至肝細胞內(nèi)，小部分參與肝細胞的生理活動，大部分靶向溶酶體降解。其中攜帶膽固醇的LDLR在肝細胞內(nèi)與膽固醇解聚，并被分選經(jīng)LDLR內(nèi)循環(huán)重新回到肝細胞膜表面，以供重復使用，或被分選至溶酶體降解[10]。

PCSK9作用靶點眾多，常見參與脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)的分子靶點包括LDLR、低密度脂蛋白受體相關蛋白1（low-density lipoprotein receptor-related protein 1，LRP1）、載脂蛋白E受體2（apolipoprotein E receptor-2，ApoER2）、極低密度脂蛋白受體（very low density lipoprotein receptor，VLDLR）、載脂蛋白B（apolipoprotein B，ApoB）和白細胞分化抗原36（cluster of differentiation 36，CD36）等[11-12]。PCSK9結合靶點發(fā)揮作用分為胞外和胞內(nèi)兩種途徑，胞外途徑指PCSK9競爭性地與肝細胞表面LDLR、VLDLR、LRP1、ApoER2和CD36結合形成復合物，并以囊泡的形式定位溶酶體降解，減少LDLR內(nèi)循環(huán)及肝細胞表面LDLR、VLDLR、LRP1、ApoER2和CD36的數(shù)量，并升高外周血LDL-C水平[13]；胞內(nèi)途徑是指已成熟的PCSK9在分泌至胞外之前，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進入高爾基體與新生成的LDLR、ApoER2和CD36結合為復合物靶向溶酶體降解[12-13]。細胞內(nèi)PCSK9還直接與ApoB蛋白和微粒體甘油三酯轉運蛋白（microsomal triglyceride transfer protein，MTP）酶相互作用，并抑制B細胞淋巴瘤-2蛋白相互作用中心卷曲螺旋蛋白1（B-cell lymphoma-2-interacting myosin-like coiled-coil protein 1，Beclin1）/自噬相關蛋白（autophagy related proteins，ATG）14L復合物介導的自噬過程，最終上調(diào)肝細胞ApoB的含量和穩(wěn)定性，增加VLDL、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）水平[14]。在單個LDLR或LDLR/PCSK9雙基因敲除小鼠表現(xiàn)出相似的膽固醇變化，表明PCSK9主要通過LDLR調(diào)節(jié)肝臟膽固醇動態(tài)平衡[15]，并且PCSK9抑制劑的藥理作用著重于PCSK9與LDLR之間的關系，本文將著重介紹PCSK9與LDLR在慢性肝病中的研究。

PCSK9抑制劑已在臨床用于治療PCSK9過表達所致的高膽固醇血癥，通過競爭性地結合PCSK9，減少LDLR的降解，維持正常的血漿膽固醇水平[16]。目前臨床上使用的阿利西尤單抗（alirocumab）、依洛尤單抗（evolocumab）已被用于治療FH、他汀類藥物不耐受或需要額外降低LDL-C的高危動脈粥樣硬化相關心血管疾病的患者[17-18]。有文獻[19]報道，雖然PCSK9抑制劑可使遺傳性和獲得性高膽固醇血癥患者的血漿LDL-C濃度平均下降50%～60%，但因肝細胞內(nèi)感應回路反饋性增加PCSK9分泌，卻使血漿PCSK9濃度上升約10倍。高濃度的血漿PCSK9是否會在停用PCSK9抑制劑后誘導更高水平的血漿LDL-C，導致患者病情復發(fā)甚至加重？這需要對PCSK9抑制劑進行更深入的研究，也將對臨床使用PCSK9抑制劑的劑量、不良反應及停藥方式具有重要指導意義。

1.2 PCSK9相關調(diào)控因子

甾醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2，SREBP-2）與維持膽固醇穩(wěn)態(tài)密切相關[20]。細胞內(nèi)膽固醇減少和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子丟失激活SREBP-2，觸發(fā)其向細胞核的移位，并誘導膽固醇調(diào)節(jié)基因的激活，包括PCSK9、LDLR和三羥基三甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A，HMG-CoA）基因[21]。研究[22]發(fā)現(xiàn)，硫化氫氣體處理降低了高脂飲食喂養(yǎng)小鼠升高的血液膽固醇水平。在肝細胞中，硫化氫氣體以時間和濃度依賴的方式激活磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶（protein-serine-threonine kinase，Akt）信號通路下調(diào)SREBP-2轉錄，抑制PCSK9的表達，從而調(diào)節(jié)肝癌HepG2細胞的脂質(zhì)代謝[23]。有趣的是咖啡因能夠提高肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子水平，阻斷負責調(diào)節(jié)PCSK9的SREBP-2基因的轉錄激活，增加LDLR的表達和LDL-C的清除[24]。

2 PCSK9與慢性肝病的相關性

既往PCSK9在脂質(zhì)代謝、動脈粥樣硬化領域得到廣泛關注，PCSK9抑制劑在治療家族性高膽固醇血癥、減輕動脈粥樣硬化疾病中取得了良好成效。肝臟在維持機體膽固醇代謝平衡中發(fā)揮關鍵作用，PCSK9在肝細胞中大量合成，參與肝細胞的膽固醇代謝。這一作用失調(diào)將導致一系列肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展。著眼于PCSK9與肝臟疾病之間相關性的研究日益增多，深入研究PCSK9在肝臟疾病中的作用機制及靶向PCSK9治療肝臟疾病具有重要臨床意義。

2.1 酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）

2.1.1 PCSK9與ALD ALD是指因長期過量飲酒導致的肝臟代謝性疾病，疾病早期表現(xiàn)為肝細胞脂肪變性，繼而可進展為脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝癌[25]。肝臟脂質(zhì)代謝紊亂是ALD的一個關鍵特征，慢性酒精暴露促進肝細胞PCSK9轉錄和翻譯，降低肝細胞對血漿LDL-C的攝取，導致高膽固醇血癥[26]。同時慢性酒精喂養(yǎng)不僅可以增加小鼠促炎細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-22、IL-33、IL-17α、IL-2）和趨化因子（巨噬細胞炎性蛋白2、血清單核細胞趨化蛋白1等）的表達，還可通過增加PCSK9表達增強肝臟髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性，共同促進肝臟氧化應激和炎癥反應[27]。

2.1.2 PCSK9抑制劑與ALD PCSK9單克隆抗體治療可以抑制SREBP-2基因的轉錄而顯著降低肝臟PCSK9表達，改善ALD所致的高膽固醇血癥；同時PCSK9單克隆抗體能夠抑制脂肪酸合酶活性，恢復酒精導致的脂肪酸分解代謝調(diào)節(jié)因子過氧化物酶體增殖物激活受體α和肉堿棕櫚酰轉移酶I的表達下調(diào)，從合成和分解兩方面減少肝細胞的脂質(zhì)積累，減輕酒精誘導的肝臟脂肪變性。PCSK9單克隆抗體抑制PCSK9介導的MPO活性，改善ALD的炎癥、氧化應激和肝細胞損傷[28]。綜上所述，抗PCSK9治療可能為ALD的治療提供一種新的治療思路，但仍需大規(guī)模臨床試驗來評估抗PCSK9治療在ALD治療中的有效性和安全性。

2.2 非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver diseases，NAFLD）

NAFLD是世界上最常見的肝病之一，與肥胖、糖尿病、代謝綜合征、胰島素抵抗和高脂血癥有關[29]。其疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）和肝硬化，部分患者會進展為肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[30-31]。

2.2.1 PCSK9與NAFL呈正相關 高脂飲食加重C57BL/6J小鼠肝臟脂肪變性導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)生，誘導肝臟PCSK9表達和循環(huán)PCSK9水平升高[32]。高膽固醇飲食飼養(yǎng)的PCSK9基因敲除小鼠較野生型小鼠肝臟游離膽固醇明顯增加，進展為脂肪性肝纖維化、肝癌的風險更高[33]。究其原因，PCSK9可以通過甾醇調(diào)節(jié)元件（sterol regulatory element，SRE）及非SRE途徑調(diào)控NAFL中肝細胞的脂質(zhì)代謝。在脂肪生成的SRE途徑方面，PCSK9減少肝細胞表面LDLR的表達，降低細胞內(nèi)膽固醇水平，導致肝細胞內(nèi)參與SRE途徑和膽固醇合成的關鍵物質(zhì)增加，包括甾醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白1（sterol regulatory element binding protein 1，SREBP1）和HMG-CoA還原酶的轉錄調(diào)控，以及脂肪酸合成酶的轉錄后調(diào)控，脂肪酸合成酶是新生脂肪生成的限速酶[14]。在脂肪生成的非SRE途徑方面，PCSK9誘導ApoB/ApoE和MTP蛋白的表達增加，促進脂肪生成[34]。最近對中國人群的一項臨床研究[35]表明，PCSK9的LOF突變體與NAFLD風險降低相關。

總之，在NAFL中，PCSK9通過誘導脂質(zhì)生成，加重NAFL的疾病進程，PCSK9與NAFL呈正相關。

2.2.2 PCSK9與NASH呈負相關 在合并NASH的C57BL/6J小鼠體內(nèi)，循環(huán)PCSK9水平及肝臟PCSK9基因和蛋白的表達均顯著降低[36]，提示在NASH疾病進展中PCSK9表達水平被顯著抑制。一項動物實驗[37]顯示，PCSK9基因敲除的C57BL/6J小鼠的NASH與PCSK9基因過表達組相比，能誘導更多甘油三酯和膽固醇積累，導致更嚴重的脂肪性肝炎并加劇肝纖維化進程。研究[38]表明，NASH誘導的炎癥反應可以通過抑制E2F轉錄因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）和激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）下調(diào)PCSK9的表達，從而導致膽固醇在肝細胞中積聚，加速NASH的進展。

PCSK9抑制小鼠肝細胞CD36的表達，減輕肝細胞的脂質(zhì)蓄積，在PCSK9基因敲除小鼠中，表達增加的CD36介導脂肪酸和三酰甘油（triacylglycerol，TAG）儲存于肝細胞，促進NASH進展[39-40]。既往研究[41]表明，PCSK9在肝再生過程中轉錄及翻譯水平顯著上調(diào)，并在肝再生中發(fā)揮重要作用。由此可以推測，PCSK9缺乏在NASH進展中的有害影響可能是由于PCSK9下調(diào)抑制肝細胞再生所致。

綜上所述，NASH抑制PCSK9表達，加重肝細胞的膽固醇負荷，而低表達的PCSK9誘導CD36表達上調(diào)并干擾肝細胞再生，進一步加重NASH進展。

2.2.3 PCSK9抑制劑與NAFLD 炎癥反應在肝細胞由NAFL演變?yōu)镹ASH、肝纖維化及肝硬化的過程中起重要作用[42]。抑制PCSK9可以減輕NAFL大鼠肝臟病理損傷，減少肝細胞凋亡，同時還可減少Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路的激活及炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，表明PCSK9調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路加重大鼠NAFLD嚴重程度[43-44]。對于臨床上常見的膽源性肝硬化，使用PCSK9抑制劑可以降低膽源性肝硬化小鼠的血漿膽固醇水平，減輕膽源性肝硬化并發(fā)的全身炎癥反應，但不影響小鼠的肝功能、側支循環(huán)的建立及肝性腦病的發(fā)生率[45]。一項臨床研究[46]表明，11例肥胖糖尿病患者經(jīng)過大約18個月的PCSK9抑制劑治療后，肝臟脂肪變性得到完全緩解，肝功能情況得到改善。

綜上所述，PCSK9抑制劑在NAFLD中的作用是雙重而又矛盾的，抑制PCSK9能緩解NAFL病情，卻對NASH起促進作用。因此，臨床上PCSK9抑制劑對NAFLD的綜合影響仍存在爭議，需要更為準確診斷患者屬于NAFL還是NASH，同時也需要更多的基礎實驗和大量臨床數(shù)據(jù)分析來探討其中的機制，這也將對未來使用PCSK9抑制劑治療NAFLD提供理論依據(jù)。

2.3 PCSK9與丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）

慢性HCV感染是肝硬化和肝癌的重要病因[47-48]。HCV的生命周期與宿主的脂質(zhì)代謝密切相關，HCV通過載脂蛋白進入宿主細胞，引起宿主細胞膜脂質(zhì)組成變化，從而為HCV復制提供適宜環(huán)境。成熟的病毒以脂蛋白樣顆粒的形式釋放到循環(huán)中，稱為脂蛋白-病毒顆粒（LVP），LVP中包含不同的肝細胞合成的載脂蛋白。目前認為LVP顆粒相關載脂蛋白參與脂蛋白受體介導的病毒感染，并對HCV病毒顆粒的細胞內(nèi)成熟起關鍵作用[49]。PCSK9可抑制HCV進入肝細胞的四種表面蛋白，包括LDLR、VLDLR、白細胞分化抗原81（cluster of differentiation 81，CD81）和B型1類清道夫受體（scavenger receptor class B type1，SR-B1）。細胞實驗[50]證明，PCSK9在超生理濃度（7 μg/mL）時，可減少肝癌HU-7細胞表面LDLR和CD81的表達，從而阻止HCV病毒的感染。另一實驗[45]表明，HCV感染的肝細胞中甾醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白（sterol regulatory element binding protein，SREBP）和肝細胞核因子1（hepatocyte nuclear factor 1，HNF1）表達增加，促進PCSK9翻譯而增加血漿PCSK9濃度，但對HCV感染患者血漿總膽固醇（total cholesterol，TC）、LDL-C和TAG水平無明顯影響，其機制為HCV已被證明可刺激肝癌Huh7細胞和HCV患者的肝組織中的LDLR表達而中和PSCK9誘導的LDLR降解。

由此可見，通過外源性補充重組PCSK9特異性降解肝細胞膜表面LDLR水平似乎對HCV感染患者的治療具有積極意義。但仍需深入研究HCV病毒和PCSK9之間錯綜復雜的聯(lián)系及PCSK9特異性靶向肝臟的治療方法，以期為正確使用靶向PCSK9的治療方法提供理論依據(jù)。

2.4 HCC

2.4.1 PCSK9與HCC 肝癌是全球常見的惡性腫瘤之一，其中HCC是主要的原發(fā)性肝癌，高侵襲性、易轉移和復發(fā)是預后差的主要原因[51]。PCSK9調(diào)控腫瘤細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、線粒體死亡、腫瘤微環(huán)境等參與腫瘤進展，識別PCSK9在腫瘤中的作用機制及靶向PCSK9在腫瘤治療中具有重要臨床價值。

文獻[52]報道，PCSK9在結直腸癌、黑色素瘤、乳腺癌中高表達，通過與腫瘤細胞膜表面的主要組織相容性復合體I（the major histocompa-tibility complex class-I，MHC-I）結合形成PCSK9-MHC-I復合物，該復合物靶向腫瘤細胞溶酶體降解，降低腫瘤細胞膜表面MHC-I含量，導致CD8+T淋巴細胞表面T細胞受體（T cell receptor，TCR）特異性識別腫瘤細胞膜表面MHC-I位點減少，引發(fā)腫瘤細胞免疫逃逸。PCSK9在肝癌中的高表達，不僅與患者的預后不良有關，而且在體外促進肝癌細胞的增殖與遷移，在體內(nèi)也促進了肝癌的進展。抑制PCSK9導致肝癌細胞內(nèi)脂質(zhì)的過度積累及明顯的脂毒性，可抑制肝癌細胞增殖[5,53]。相反，有學者[54-55]報道，PCSK9在肝癌組織中的表達水平明顯低于癌旁非腫瘤樣本，且惡性度越高的肝癌細胞表達的PCSK9水平越低，PCSK9促進谷胱甘肽硫-轉移酶P1（glutathione S-transferase P1，GSTP1）與c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）的結合，抑制JNK磷酸化，起到抑制肝癌細胞增殖和轉移。

在腫瘤殺傷細胞方面，PCSK9干擾T淋巴細胞攝取LDL，抑制T淋巴細胞克隆擴增成為細胞毒性T淋巴細胞，從而減少細胞毒性顆粒的產(chǎn)生及釋放，減弱T淋巴細胞的抗腫瘤能力。同時，PCSK9減少CD8+T淋巴細胞膜表面LDLR，使得LDLR以膜蛋白形式與TCR的CD3亞基結合減少；并且PCSK9抑制TCR循環(huán)，減少CD8+T淋巴細胞膜表面TCR，進一步減弱CD8+T淋巴細胞抗原識別能力。二者共同作用使得CD3亞基及其下游通路磷酸化水平下降，抑制了細胞毒性T淋巴細胞的毒性顆粒釋放，減弱對肝癌細胞的殺傷能力[56]。

在腫瘤微環(huán)境方面，PCSK9調(diào)節(jié)腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）表型轉化，在腫瘤微環(huán)境中，M1型巨噬細胞促進炎癥反應，M2型巨噬細胞能夠分泌IL-4、IL-10、IL-13、轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）等多種免疫抑制因子促進腫瘤細胞生長，抑制TAMs 向M2型巨噬細胞極化具有重要臨床價值。最新的一項研究[57]發(fā)現(xiàn)PCSK9在體外通過促進肝癌細胞表達OX40配體（OX40 ligand，OX40L）進而抑制人單核細胞白血病細胞（human monocyte leukemia cells，THP-1）來源巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化，從而對肝癌細胞起抑制作用。

2.4.2 PCSK9抑制劑與HCC 近年來，免疫治療已在臨床抗腫瘤治療中取得良好成效，PCSK9也顯示出其在癌癥免疫療法中的潛在價值。使用PCSK9抑制劑能夠：⑴ 抑制PCSK9對MHC-I降解，增加腫瘤細胞膜表面MHC-I，使腫瘤細胞更易被腫瘤殺傷細胞識別，減少腫瘤免疫逃逸。⑵ 抑制PCSK9對CD8+T淋巴細胞膜LDLR的降解，恢復CD8+T淋巴細胞膜LDLR的數(shù)量，進而恢復細胞毒性T淋巴細胞對腫瘤的殺傷能力。研究[52]表明，程序性死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）單克隆抗體聯(lián)合PCSK9抑制劑治療荷瘤小鼠，其療效顯著優(yōu)于單用PD-1單克隆抗體或PCSK9抑制劑。

綜上所述，是肝癌細胞內(nèi)PCSK9抑制JNK信號通路磷酸化而減弱肝癌細胞的增殖與侵襲作用更強，還是肝癌細胞外PCSK9介導的腫瘤免疫逃逸作用更強？需要未來進一步研究PCSK9在肝癌患者中的表達水平，以評估針對肝癌治療是外源性補充PCSK9還是使用PCSK9單克隆抗體。針對肝癌現(xiàn)有的PD-1靶向免疫治療[58]，未來聯(lián)合使用PCSK9抑制劑有望加強肝癌的治療效果。

3 小結與展望

綜上所述，PCSK9參與肝細胞膜表面LDLR的降解并升高血漿膽固醇，間接介導肝細胞脂質(zhì)蓄積，誘導肝臟病理改變，并且通過激活炎癥通路，促進炎癥因子釋放，進一步增加肝臟負荷。同時PCSK9還可直接參與肝臟炎癥反應、肝癌的發(fā)生發(fā)展。PCSK9抑制劑現(xiàn)已在臨床上批準用于治療家族性高膽固醇血癥，靶向PCSK9有望成為治療ALD、NAFLD、病毒性肝炎等慢性肝臟疾病的新療法。此外，PCSK9影響腫瘤動物模型中巨噬細胞、T淋巴細胞、NK細胞、B淋巴細胞的浸潤與功能，提示PCSK9在腫瘤免疫治療中的潛在價值，靶向PCSK9對肝癌的治療效果、給藥劑量、對免疫細胞的影響以及聯(lián)合現(xiàn)有的腫瘤靶向免疫藥物是否能取得更好的治療效果，有待進一步探索。PCSK9相關調(diào)控藥物有望為慢性肝臟疾病的治療提供新方向。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：方開晗負責撰寫文章，文獻資料收集及文章修改；彭秀達、費書珂負責文章的思路設計、寫作指導、研究經(jīng)費支持與對論文的修訂。