羊口瘡病毒 F1L基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

蔣 尊, 安紅艷, 孫創(chuàng)奇, 葛佳儀, 梁 倩, 鮮思美,2

(1. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025;2. 貴州省動(dòng)物疫病研究所,貴州 貴陽(yáng) 550025)

羊口瘡又稱羊傳染性膿皰(Contagious ecthyma,CE),是由羊口瘡病毒(Orfvirus,ORFV)引起的急性、嗜上皮性、高度接觸性人獸共患傳染病,主要感染山羊和綿羊, 臨床主要表現(xiàn)為增生性炎癥,舌、鼻、口、唇等部位出現(xiàn)水皰、膿皰、丘疹、結(jié)痂[1～4]。該病發(fā)病率高,病死率低,分布廣泛,給養(yǎng)羊業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)也威脅人類健康。 ORFV是痘病毒科、副痘病毒屬的線性雙鏈DNA病毒,基因組全長(zhǎng)134～139 kb,高度保守基因88個(gè),大部分可變區(qū)位于基因組末端,中央核心區(qū)基因相對(duì)保守[5]。F1L基因位于病毒基因組的中央高度保守區(qū),編碼大小約39 ku的F1L蛋白;F1L蛋白為單克隆抗體的主要結(jié)合位點(diǎn),可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,具有肝素受體結(jié)合活性,可促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞膜與病毒外膜的融合,與病毒的吸附、成熟及發(fā)病機(jī)理相關(guān)[6]。本研究以O(shè)RFV-DZ分離株基因組為模板,擴(kuò)增其F1L基因,構(gòu)建真核表達(dá)載體,為羊口瘡病毒的致病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

病毒基因組DNA提取試劑盒(購(gòu)自TIANGEN公司),EcoR Ⅰ、XhoⅠ 限制性內(nèi)切酶(購(gòu)自TaKaRa公司),質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒(購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司),PCR Master Mix (2×)、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、PageRuler Prestained Protein Ladder(購(gòu)自Thermo Fisher公司),NeofectTMDNA transfection reagent(購(gòu)自北京碼因科技有限公司),RIPA高效組織細(xì)胞裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑(購(gòu)自Solarbio公司),pEGFP-N1質(zhì)粒、ORFV-DZ毒株、HEK-293t(人胚腎細(xì)胞)、F1L-B2L融合蛋白多抗(由貴州大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.2 主要儀器

PCR儀(型號(hào):9902,Applied Biosystems公司)、核酸電泳儀(型號(hào):BG-POWER 300,BAYGENE公司)、凝膠成像儀(型號(hào):SYDDR4/2752,SYNGENE公司)、倒置熒光顯微鏡(型號(hào):IX73,OLYMPUS公司)。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

以GenBank中ORFV標(biāo)準(zhǔn)株(登錄號(hào):HQ197753.1)的F1L基因?yàn)閰⒖夹蛄?使用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)用于F1L基因的特異引物。F1L-F:5’-CCCTCGAGATGGATCCACCCGAAATCAC-3’(下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn));F1L-R:5’-CGGAATTCGCACAATGGCCGTGAC-3’(下劃線為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)),Tm值59 ℃,預(yù)擴(kuò)增片段1 029 bp。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4 F1L基因的PCR擴(kuò)增

按照病毒基因組DNA提取試劑盒說明書方法提取ORFV-DZ病毒總DNA,以此為模板進(jìn)行F1L基因PCR擴(kuò)增(高保真PCR)。PCR體系20 μL:ddH2O 6 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,2×TaqPCR Master Mix 10 μL,DNA模板2 μL。擴(kuò)增程序:98 ℃ 10 s;59 ℃ 5 s,72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min 。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳,按膠回收試劑盒說明書方法純化回收。

1.5 F1L基因的克隆及篩選

以內(nèi)切酶XhoⅠ、EcoRⅠ分別雙酶切pEGFP-N1質(zhì)粒(攜帶熒光標(biāo)簽)、純化PCR產(chǎn)物。酶切體系30 μL:XhoⅠ、EcoRⅠ各2 μL,10×K Buffer 3 μL,pEGFP-N1 10 μL(純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 12 μL),ddH2O 13 μL(ddH2O 11 μL),37 ℃酶切3 h。純化酶切產(chǎn)物16 ℃連接過夜,連接體系10 μL:酶切pEGFP-N1 1 μL,酶切PCR產(chǎn)物4 μL,SolutionⅠ5 μL。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化方法:感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)50 μL與連接產(chǎn)物10 μL混勻,冰浴30 min,42 ℃熱擊90 s,冰浴1 min,加入LB液體培養(yǎng)基800 μL,37 ℃振蕩培養(yǎng)40～60 min,8 000 r/min離心2 min,留上清液200 μL,涂布于含卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基,37 ℃過夜培養(yǎng),隨機(jī)挑取3個(gè)單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(5 mL),37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,PCR、雙酶切篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒,送上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.6 pEGFP-F1L重組質(zhì)粒的表達(dá)

將HEK-293t細(xì)胞接種于6孔板中,細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)按照Neofect轉(zhuǎn)染試劑說明書方法,將pEGFP-F1L重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK-293t細(xì)胞。設(shè)置HEK-293t細(xì)胞、pEGFP-N1質(zhì)粒為對(duì)照。轉(zhuǎn)染24 h于倒置熒光顯微鏡下觀察。以蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)冰浴裂解30 min,12 000 r/min,4 ℃離心后收集蛋白上清,Western blotting檢測(cè)融合蛋白的特異表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 F1L基因PCR

由圖1可見:PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 029 bp,與預(yù)期相符。

M:DL 2 000 DNA Marker;1～2:F1L基因

2.2 pEGFP-F1L重組質(zhì)粒

由圖2、圖3可見:EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切PCR陽(yáng)性質(zhì)粒產(chǎn)生2個(gè)條帶,分別為4 723 bp的線性pEGFP-N1、1 029 bp的F1L基因條帶,與預(yù)期相符。

M:DL 2 000 DNA Marker;1～2:F1L基因雙酶切產(chǎn)物;3:pEGFP-N1空載體雙酶切產(chǎn)物

M:DL 5 000 DNA Marker;1～3:重組質(zhì)粒pEGFP-F1L雙酶切產(chǎn)物

2.3 pEGFP-F1L的細(xì)胞轉(zhuǎn)染及表達(dá)

由圖4可見:pEGFP-N1對(duì)照組和pEGFP-F1L轉(zhuǎn)染組可觀察到大量綠色熒光斑,而HEK-293t對(duì)照組未見熒光。由圖5可見:Western Blotting檢測(cè)到pEGFP-F1L轉(zhuǎn)染組于約65 ku處有1條蛋白條帶,與預(yù)期相符。

A:HEK-293t對(duì)照組;B:pEGFP-N1對(duì)照組;C:pEGFP-F1L重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組

M:PageRuler Prestained Protein Ladder;1:HEK-293t對(duì)照組;2:pEGFP-F1L轉(zhuǎn)染組;3:pEGFP-N1對(duì)照組

3 結(jié)論

試驗(yàn)構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-F1L,并成功在HEK-293t細(xì)胞中表達(dá)。

4 討論

目前市場(chǎng)上對(duì)于ORFV亞單位疫苗的開發(fā)大多針對(duì)已知的F1L篩管蛋白和B2L囊膜蛋白2種保護(hù)性抗原蛋白。其中F1L蛋白參與組成病毒表面微管,可作為抗原蛋白激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答,誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體,介導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫[7],具有較大的疫苗開發(fā)潛力。F1L蛋白具有肝素結(jié)合活性,能結(jié)合宿主細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)受體,推測(cè)可能參與病毒的吸附、侵入過程[8]。另一方面,F1L基因可通過影響宿主的PI3K-AKt信號(hào)通路[9～11],促進(jìn)ORFV在宿主細(xì)胞中的復(fù)制增殖,但F1L蛋白是否能直接影響病毒的增殖和復(fù)制還需要進(jìn)一步探究。F1L蛋白雖然是ORFV的獨(dú)有蛋白,但其他病毒可能存在類似作用的蛋白,比如通過調(diào)控宿主細(xì)胞周期促進(jìn)病毒復(fù)制,這一假設(shè)也需要進(jìn)一步驗(yàn)證。