NCG對熱應激大骨雞精液品質(zhì)影響的研究

李佳慧,張煥琪,施 佐,馬 巍,王春強

(錦州醫(yī)科大學畜牧獸醫(yī)學院,遼寧 錦州 121001)

熱應激是指動物在高溫環(huán)境下無法通過自身的調(diào)節(jié)機制維持正常的體溫,導致生理和行為上的改變[1]。熱應激持續(xù)時間過長或溫度過高時,可以引起動物一系列生理和行為上的反應,如呼吸急促、翅膀張開、身體抽搐、昏昏欲睡、昏迷等現(xiàn)象,對動物造成嚴重影響[2]。熱應激可導致雄性動物精液質(zhì)量、抗氧化指標下降;誘導大骨雞機體產(chǎn)生氧化應激,對大骨雞繁殖性能造成嚴重影響。這些影響可能是由于熱應激導致激素分泌變化而引起的[3]。為了緩解熱應激對動物繁殖性能造成影響,可以在飼料中添加一些抗應激添加劑。

目前N-氨甲酰谷氨酸(N-carbamylglutamate, NCG)已經(jīng)成為動物日糧的常規(guī)添加劑。NCG為白色結(jié)晶粉末或無色透明晶體,化學性質(zhì)穩(wěn)定,是精氨酸的一種有效前體[4]。NCG是N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)的功能類似物,成本低廉,在瘤胃中添加量較小。在妊娠母豬日糧中添加 NCG,能夠顯著降低胚胎死亡率,改善產(chǎn)仔性能,顯著增加窩產(chǎn)活仔數(shù)及窩重[5]。在大骨雞飼糧中添加NCG,可以通過調(diào)節(jié)機體代謝增強機體的抵抗力,減少因熱應激引起的繁殖功能減退等[6]。因此,夏季高溫季節(jié)在大骨雞飼糧中添加NCG可以有效地緩解熱應激造成的不良影響,促進大骨雞生長速度和繁殖性能的提高,提高畜牧業(yè)的經(jīng)濟效益和社會效益[7]。試驗旨在研究熱應激條件下日糧中添加不同濃度NCG對大骨雞精液品質(zhì)的影響,為進一步提高大骨雞精液品質(zhì)及繁殖性能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及分組情況

體重相近的25周齡雄性大骨雞48只,錦州醫(yī)科大學動物實驗中心提供;NCG,江西省元昌工業(yè)有限公司提供。

將48只大骨雞機分成4組,每組12只,對照組飼喂基礎(chǔ)日糧,N1、N2、N3組分別在基礎(chǔ)日糧中添加NCG 0.08%、0.12%、0.16%。

1.2 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)模式采用單層籠養(yǎng),試驗期間于每日08:00、12:00和18:00各喂一次,自由飲水,執(zhí)行常規(guī)免疫程序和飼養(yǎng)管理。試驗共計90 d,其中適應期30 d,飼喂基礎(chǔ)日糧,正試期60 d,進行熱應激處理。每周采集精液對大骨雞精液品質(zhì)進行檢測。舍內(nèi)每天光照12 h。日常舍內(nèi)溫度30 ℃持續(xù)4～6 h,中午溫度可達35 ℃。為了避免溫度過高對大骨雞產(chǎn)生的危害,應及時監(jiān)測舍內(nèi)溫度,保持4～6 h高溫后進行降溫。

1.3 精液的采集

采用腹背式按摩法采集精液,將精液置于37 ℃恒溫箱進行保溫,先取10 μL原精用顯微鏡初步觀察原精的活力與密度,進行精液品質(zhì)評估,活力低于80%的精液棄用,將活力高于80%的精液按照1∶3比例加入稀釋液,再進行各項指標的檢測。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 精子活率

取潔凈試管,滴加1滴新鮮采集的精液和1～2滴伊紅染色液,混勻,靜置30 s后滴加3滴苯胺黑染色液,混勻放置30～60 s。在載玻片上滴加1滴染色后精液,于顯微鏡下計數(shù)。在1 000倍鏡下數(shù)200個精子,分別數(shù)出死精子和活精子,并計算各自的百分率。活精子的頭部不易被染色,顯微鏡下觀察時,精子的頭部呈透明且無色;而死亡精子則因伊紅染色液滲透到了細胞質(zhì),精子頭部被染為紅色,苯胺黑將背景染為黑色,使精子頭部清晰可見。

1.4.2 質(zhì)膜完整性

低滲腫脹試驗(HOST)是一種評估精子質(zhì)膜完整性的試驗方法,當精子在低滲溶液中時水分子可以通過精子膜進入精子,使精子體積增大而膨脹。因此,通過觀察精子的低滲膨脹情況可以評估精子膜的完整性。

質(zhì)膜完整率(%)=卷尾精子數(shù)/總精子數(shù)×100。

1.4.3 精子形態(tài)學

采用G250染色法染色,觀察精子形態(tài)是否為正常。

畸形率(%)= 畸形精子數(shù)/計數(shù)精子總數(shù)×100。

1.4.4 精子運動性能

使用邁朗動物精子全自動分析儀檢測精子活力、鞭打頻率、直線速率、路徑速率、曲線速率、側(cè)擺幅值、移動角度、前向性。

1.4.5 抗氧化指標

將解凍后的精子按比例稀釋至檢測樣品濃度,按試劑盒說明測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進行分析,平均數(shù)比較采用方差分析檢驗,結(jié)果以“平均值±標準差(Mean±SD)”表示,P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 精子活率檢測與分析

大骨雞適應期飼養(yǎng)30 d后,每周進行精液品質(zhì)檢測,試驗結(jié)束時取各周測定的平均值進行分析。精子活率測定結(jié)果見表1,伊紅-苯胺黑染色圖見圖1。由表1可以看出:與對照組相比,添加NCG的3個試驗組精子活率均提高,其中N2、N3組顯著高于對照組(P<0.05),N1組與對照組差異不顯著(P>0.05)。

注:箭頭所示紅色精子為死亡精子,白色精子為活精子。

表1 精子活率測定結(jié)果

2.2 熱應激對精子質(zhì)膜完整性和畸形率的影響

精子質(zhì)膜完整性和畸形率結(jié)果見表2。由表2可以看出:與對照組相比,N1、N2、N3組精子質(zhì)膜完整性均有提高,其中N3組顯著高于對照組(P<0.05),N1、N2組與對照組差異不顯著(P>0.05);N1、N2、N3組精子畸形率均顯著低于對照組(P<0.05)。

表2 精子質(zhì)膜完整性、畸形率測定結(jié)果

2.3 添加不同濃度NCG在熱應激下對精子運動性能的影響

采用邁郎精子分析系統(tǒng)分析了熱應激條件下大骨雞精子的活力、活率和運動性能,結(jié)果見表3。 精子運動軌跡見圖2。由表3可以看出:與對照組相比,N1、N2、N3組精子活力均有提高,其中N2、N3組顯著高于對照組(P<0.05);N1、N2、N3組鞭打頻率、直線速率、路徑速率均有提高,但與對照組相比均差異不顯著(P>0.05);N1、N2、N3組精子曲線速率均有提高,其中N3組顯著高于對照組(P<0.05); N1、N2、N3組側(cè)擺幅值與對照組均差異不顯著(P>0.05);N2、N3組移動角度顯著高于對照組(P<0.05); N3組前向性顯著高于N1組(P<0.05)。說明大骨雞精液中添加NCG能夠顯著提高精子的運動性能,減緩高溫下熱應激對大骨雞精液品質(zhì)造成的危害。

注:A圖上面箭頭處為活精子運動路徑,為綠色;下面箭頭處為死亡精子,為紅色。

表3 精子運動性能測定結(jié)果

2.4 熱應激對精液抗氧化指標的影響

熱應激對精液抗氧化指標的影響見表4。由表4可以看出:N1、N2、N3組MDA含量均低于對照組(P>0.05),其中N3組最低; N3組SOD活性最高,顯著高于N1組,但與對照組差異不顯著(P>0.05);N1、N2、N3組CAT活性均高于對照組,但均與對照組無顯著差異(P>0.05)。

表4 精液抗氧化指標測定結(jié)果

3 討 論

在高溫熱應激條件下大骨雞的精液品質(zhì)受到極大損害,嚴重影響其繁殖性能的發(fā)揮。本試驗結(jié)果表明,飼糧中添加不同濃度NCG,使高溫應激狀態(tài)下大骨雞的精子活率、運動性能、質(zhì)膜完整性、畸形率均有所改善。有研究顯示,在飼糧中添加NCG能夠促進內(nèi)源精氨酸合成,生成NO和多胺,NO 催化鳥苷酸(GMP)的產(chǎn)生[8],導致血管內(nèi)皮肌肉放松、血流量增大。多胺是一種促進細胞生長和分裂的物質(zhì),有助于促進動物的生長和發(fā)育[9],還可以增加蛋白質(zhì)的合成,提高動物的營養(yǎng)吸收能力,這些物質(zhì)在動物體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用[5]。因此,日糧中添加NCG可以改善動物的生長性能和繁殖性能,提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益;NCG參與性行為的調(diào)控、睪丸微循環(huán)的調(diào)節(jié)、睪酮的分泌,這些對大骨雞精子的產(chǎn)生及活力都具有重要的調(diào)控作用。

本試驗通過檢測大骨雞精子活率、運動性能、質(zhì)膜完整性、畸形率,判斷精液品質(zhì)的優(yōu)劣程度。精子向前運動的能力一般分a、b、c、d四級,a級為精子快速前向運動,b級是指慢或呆滯地前向運動,c級為非前向運動,d級是不動的精子,本試驗主要參考a級、b級精子的運動軌跡。熱應激下添加不同濃度NCG使大骨雞精液品質(zhì)均有提升,其中添加0.16% NCG的N3組的a級精子運動性能提高最為顯著;對照組b級精子較多。添加NCG的3個試驗組精子活率較對照組精子顯著升高,畸形率下降,質(zhì)膜完整性升高。精子質(zhì)膜是精子最易損傷的部位,精子質(zhì)膜損傷、精子膜滲透性增加會使細胞內(nèi)離子(如鈣離子)泄漏和抗氧化酶等酶活性降低[10],發(fā)生嚴重代謝紊亂,影響精子的運動和活力。精子的質(zhì)膜完整性能直接反映精子損傷的程度。在本試驗中,添加NCG的3個試驗組精子頭膜與尾膜的完整性都有所提高。頭膜與尾膜結(jié)構(gòu)都完整的精子活力和受精能力最強。綜上所述,添加NCG的3個試驗組精子活率、運動性能、質(zhì)膜完整性都有提高。

精液及精子的抗氧化相關(guān)酶類參與雞的熱應激反應[11]。飼糧中添加NCG能有效提高精子過氧化氫酶活性,也可減緩脂質(zhì)過氧化的程度。研究發(fā)現(xiàn),當細胞內(nèi)的脂質(zhì)被氧化時會產(chǎn)生大量的MDA,這進一步加劇了細胞內(nèi)的氧化應激程度。脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生大量的MDA,引發(fā)精子的過氧化反應,飼糧添加NCG可以降低精液中MDA含量,減少過氧化應激對精子造成的損害[12]。SOD在精子中起著重要的抗氧化作用。它可以清除超氧陰離子并將超氧化物轉(zhuǎn)化為氧和過氧化氫[13],從而調(diào)控多種活性氧(ROS)水平。這有助于保護精子免受氧化應激的傷害[14],維持其正常的形態(tài)和功能。在精漿中,SOD可以防止精子樣本中的磷脂和與磷脂結(jié)合的脂肪酸過氧化[15],這是精子發(fā)育和成熟過程中的重要保護機制[16]。此外,SOD還可以減少氧化核酸損傷,這對于維持基因組的穩(wěn)定性非常重要,缺乏SOD等抗氧化酶可能會導致DNA損傷的修復機制受損[17]。CAT在精子中催化過氧化氫分解成水和氧氣的反應、維持較高過氧化氫酶活性,可以使精子免受氧化應激損害。過氧化氫是一種強氧化劑,可以對精子造成氧化損傷,影響精子的運動能力、形態(tài)和遺傳物質(zhì)的完整性。CAT通過分解過氧化氫維持細胞的穩(wěn)態(tài),不僅可以反映細胞的抗氧化水平,還可以與其他抗氧化酶協(xié)同作用,共同抵御氧化應激對精子的損傷,維持精子的正常功能。本試驗結(jié)果表明,在飼糧中添加不同濃度NCG對熱應激下精子抗氧化指標均有不同程度的緩解作用。

在高溫天氣應采取適當措施緩解熱應激對動物繁殖功能的影響[16],飼糧中添加不同濃度的NCG可有效緩解精子氧化反應,提高精子活率、質(zhì)膜完整性、運動性能,從而緩解熱應激對大骨雞精液品質(zhì)造成的危害。

4 結(jié) 論

大骨雞飼糧中添加不同水平NCG后,均可緩解由于熱應激導致的精液品質(zhì)及繁殖性能下降,其中0.16% NCG對緩解動物熱應激效果最佳。