哺乳動物精子磷脂酶C zeta(PLCζ)在受精中作用的研究進展

張樂穎,陳柏達,張 魯*

(1.中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所,北京 102629;2.中國農業(yè)大學動物科學與技術學院,北京 100193)

受精過程是哺乳動物高度特化的配子結合產(chǎn)生新生命的過程。受精不是單一的或孤立的現(xiàn)象,而是由一連串的生物學事件組成的鏈式反應,任何一個步驟的中斷都可能導致受精失敗。其中,精卵融合后引起的卵子激活是最為重要的事件,是啟動胚胎成功發(fā)育的關鍵?，F(xiàn)在已確定,精子通過觸發(fā)細胞質內游離鈣離子(Ca2+)濃度的迅速上升,進而誘導卵子的激活[1]。受精時卵子內的Ca2+信號對哺乳動物和非哺乳動物同樣重要,非哺乳動物如魚類、蛙類和海膽等動物受精中,卵子激活時Ca2+信號表現(xiàn)為單個瞬時峰值升高;而哺乳動物精子引發(fā)Ca2+信號呈周期性瞬時升高,稱為Ca2+振蕩[2]。精子誘導的Ca2+振蕩是激活卵子和啟動胚胎發(fā)育的關鍵。Ca2+振蕩是卵子完成一系列激活事件的必要和充分條件,Ca2+振蕩調控卵子恢復和完成減數(shù)分裂,促進雌雄原核形成和融合及皮質顆粒的釋放,以阻止多精入卵[3]。哺乳動物的卵子在受精前停滯在減數(shù)分裂第二中期(MⅡ),精子誘導的Ca2+振蕩能使細胞周期素B(cyclin B)及其細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK1)活性喪失,減數(shù)分裂恢復,細胞周期轉變?yōu)楹笃?并釋放出第二極體[3]。此后,雌雄原核形成,代表著減數(shù)分裂完成,合子進入有絲分裂細胞周期的第一個間期[3]。此外,卵子胞質內Ca2+的增加可以刺激鈣調蛋白依賴性激酶(CaMKⅡ)和肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK),從而牽引皮質顆粒向卵黃膜移動并與之融合。哺乳動物卵子的激活還涉及皮質顆粒的胞吐,引起透明帶的修飾和卵黃膜的改變,以防止后續(xù)精子的穿透[4]。文章系統(tǒng)地闡述了關于受精過程中精子內誘導Ca2+振蕩分子的鑒定和機制研究,并討論了相關精子缺陷引起的人和動物的生殖障礙,以及相應的人工卵子激活方法,以期為增進人類生殖健康和提高動物繁殖效率提供參考。

1 精子PLCζ的鑒定和功能研究

1.1 “精子因子”假說到磷脂酶C zeta(phospholipase C zeta,PLCζ)的發(fā)現(xiàn)

在受精過程中,Ca2+升高對卵子激活起著至關重要的作用,研究者針對卵子Ca2+變化發(fā)生的機制提出了包括“精子因子”在內的許多假說,鑒定出一系列精子卵母細胞激活因子(sperm oocyte activation factor, SOAF),如三磷酸肌醇(InsP3)、NO和氧化型輔酶Ⅱ(NAADP+),都能引起卵子內Ca2+升高,但都不能完全模擬受精過程的Ca2+振蕩[5-7]。通過顯微操作將倉鼠精子提取物注射到卵子,觀測到持續(xù)的Ca2+振蕩,這是哺乳動物精子因子鑒定的第一份明確證據(jù)[8]。在人和小鼠的研究中,卵胞漿內單精子注射(ICSI)精子胞質提取物或完整精子都能夠啟動Ca2+振蕩,這與觀察到的體外受精(IVF)時Ca2+變化模式相同[9-10]。同時,精子介導的Ca2+振蕩是由卵子內IP3信號通路激活所引起,這提示精子因子本身可能是一種PLC酶,在體外生化試驗中發(fā)現(xiàn),哺乳動物精子提取物能水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2),具有明顯的PLC酶活性[11]。而小鼠卵子顯微注射體細胞PLC異構體的重組蛋白,要么未能引發(fā)任何Ca2+振蕩,要么僅能觀測到一些非特異的Ca2+釋放[12-13]。此外,對精子提取物進行色譜層析檢測,在具有Ca2+振蕩誘導活性的蛋白質部分中,沒有檢測到任何一種當時已知PLC異構體存在[13]。這些證據(jù)表明,有一種新的PLC異構體存在于哺乳動物精子中,在受精過程中誘發(fā)卵子的Ca2+振蕩。隨后,根據(jù)小鼠體細胞PLC基因序列信息進行同源性搜索后,發(fā)現(xiàn)了睪丸表達的新的PLC序列[14]。隨后,從小鼠精子cDNA文庫中成功擴增出一個2.2 kb的產(chǎn)物,其中包含一個1 941 bp的開放閱讀框,編碼一個具有647個氨基酸殘基的蛋白[14-15]。此PLC蛋白與其他哺乳動物的磷脂酶具有明顯的同源性,但其表達局限于睪丸內,這種新的PLC異構體被命名為PLCζ[14-15]。

1.2 精子PLCζ是受精時卵子激活的關鍵蛋白

功能性試驗也證明了PLCζ在不同哺乳動物的卵子激活中都起著關鍵作用,是決定受精成敗的關鍵蛋白[14-16]。而特異性抗體對精子提取物中的PLCζ進行干擾,其不能再觸發(fā)小鼠卵子的Ca2+振蕩[14]。給卵子注射PLCζ 蛋白或其互補RNA,不僅能誘發(fā)Ca2+振蕩,而且激活卵子可以發(fā)育到囊胚階段[17-18]。對注射cRNA后的小鼠卵子中表達的PLCζ蛋白進行定量,發(fā)現(xiàn)PLCζ達到40 fg時,能有效地觸發(fā)生理模式的Ca2+振蕩,與單個小鼠精子內測得的PLCζ蛋白量相似[17-18]。此外,通過RNA干擾(RNAi)技術生產(chǎn)的轉基因小鼠產(chǎn)生的精子,PLCζ表達顯著減少,受精時的Ca2+振蕩過早終止,雖然沒有發(fā)生不育,但這些精子中PLCζ含量低的小鼠表現(xiàn)出產(chǎn)仔數(shù)減少[19]。一些臨床報告也證實了PLCζ在哺乳動物受精中的重要性,人類精子PLCζ的缺陷(表達水平降低或突變)與男性不育癥的記錄有關[20-22]。在兩個不育的兄弟中發(fā)現(xiàn)了第一個同源的PLCζ突變,即489處氨基酸殘基處異亮氨酸代替了脯氨酸(I489P),使用這種PLCζ突變的精子受精卵子Ca2+信號異常,無法激活卵子,導致早期胚胎發(fā)育停止[23-25]。但是, I489P突變的雜合子男性可以生育[23-25],這表明PLCζ功能受到特定的干擾才會導致不孕,但相關的機制仍未有待深入的研究。

近年來,兩個利用PLCζ基因敲除小鼠的獨立研究發(fā)現(xiàn),在卵胞漿內單精子注射后,缺乏功能性PLCζ蛋白的精子不能引起Ca2+振蕩[26-27]。然而,這兩種不同類型的PLCζ基因敲除的小鼠,雄性仍然可以生育后代,但產(chǎn)仔的數(shù)量顯著減少[26-27]。體外受精試驗發(fā)現(xiàn),缺乏PLCζ的精子仍可引起約70%的卵母細胞激活,僅可以觀測到有限數(shù)量的Ca2+振蕩,而且原核形成顯著延遲、多精入卵比例升高[26-27]。敲除PLCζ雄性未完全喪失生育能力,但卵子激活受影響,PLCζ可能是受精時卵子激活的主要因子。但不排除精子中可能存在其他補償機制,在缺乏PLCζ時仍能部分完成卵子的激活,但它們在引起Ca2+釋放方面似乎不如PLCζ有效。這些研究表明,精子PLCζ是人們長期尋找的哺乳動物“精子因子”,其在哺乳動物受精時誘發(fā)Ca2+振蕩,決定卵子激活,并影響早期胚胎發(fā)育。

1.3 其他“精子因子”候選分子的鑒定

研究者也報道了其他哺乳動物的“精子因子”候選分子。首先是一個大小為33 ku稱為oscillin的蛋白,定位在人、小鼠和豬的精子赤道帶[28-32]。但顯微注射人的oscillin蛋白不能引起小鼠卵子呈現(xiàn)受精時典型模式的Ca2+振蕩[32],后續(xù)沒有對其進行基因敲除或者其他同源蛋白在受精機制方面的研究。另一個蛋白是一個截短形式的kit受體(truncated c-kit tyrosine kinase, tr-kit),其在小鼠精子發(fā)生的晚期積累,將tr-kit重組蛋白顯微注射到卵子內能引起類似孤雌激活的效應,但不呈現(xiàn)受精時典型模式的Ca2+振蕩[33-34]。最近,有研究鑒定出一種精子頭部的蛋白,即post-acrosomal sheath WW domain-binding protein(PAWP),位于精子核周膜的頂體后鞘區(qū)域,能夠引發(fā)人類和小鼠卵子的Ca2+振蕩和原核形成[35-36]。共同注射一種能與PAWP蛋白的WWI結構相結合的肽段可以阻斷精子誘導的Ca2+振蕩,這種肽段是PAWP蛋白的競爭性抑制劑[35-36]。盡管這些研究發(fā)現(xiàn)PAWP在哺乳動物卵子激活中的潛在作用一致,但這些數(shù)據(jù)尚未在其他研究中得到驗證。有研究發(fā)現(xiàn),PAWP不能引起卵子中的Ca2+釋放[35-36]。重要的是,更多的試驗顯示PAWP衍生的抑制性肽段不能阻斷IVF或ICSI后精子誘導的Ca2+振蕩[37]。最近,對缺失PAWP雄性小鼠的受精能力進行分析,用PAWP缺失小鼠的精子進行ICSI,與對照組相比,PAWP的缺失并沒有引起Ca2+振蕩或胚胎后續(xù)發(fā)育的任何定量差異,顯示PAWP在小鼠受精中并不發(fā)揮重要作用[38-39]。臨床研究顯示PLCζ、PAWP和TR-KIT的表達在圓頭精子癥患者的精細胞內表達都降低[40],但PLCζ目前仍是哺乳動物受精時唯一能引發(fā)卵子Ca2+振蕩、成功激活卵子而啟動早期胚胎發(fā)育的蛋白,其他蛋白的作用及其之間的關系仍不清楚,有待進一步研究。

2 PLCζ在哺乳動物精子內的定位與分布

蛋白質在細胞內的定位與其生物學功能相適應,PLCζ在精子特定區(qū)域的定位可以使酶迅速擴散到卵子的胞質中,在精卵融合后快速啟動Ca2+振蕩。利用抗體觀測人類精子,發(fā)現(xiàn)PLCζ主要定位于精子頭部的頂體后緣和赤道區(qū),在頸部和中段有少量定位[41-42]。在對小鼠、倉鼠和豬的精子進行的免疫熒光成像研究中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩種不同的PLCζ定位群體,即頂體和頂體后[43-44]。然而,在馬精子中的PLCζ存在于頂體、赤道段和頭部中段及鞭毛的主要部分[45]。研究人員將分離的馬精子尾部顯微注射到小鼠卵子中引發(fā)Ca2+振蕩[45]。而使用多克隆抗體觀測發(fā)現(xiàn),PLCζ定位于小鼠和人類精子的頂部,在附睪內精子成熟期間PLCζ分泌后會在精子頭部進一步聚集[46]。盡管PLCζ在精子中的濃度比卵子內高一個數(shù)量級,尚不確定其在精子中是如何保持無酶活性的?？梢酝茰y,在精子內PLCζ可能被包裹,以確保其遠離催化底物,或者精子內有抑制因子專門與PLCζ結合,并使其處于非活性狀態(tài)。另外,精子PLCζ也可能有翻譯后修飾,導致其活性受到抑制,一旦PLCζ被遞送到卵子內,抑制就解除[47]。盡管在誘導運動、獲能和頂體反應期間存在明顯的Ca2+上升,但精子中PLCζ活性的抑制可能是防止早期和不受控制的頂體反應所必需的。

3 精子PLCζ蛋白結構研究

哺乳動物精子PLCζ是已知13種PLC同工酶中的分子質量最小的,其具有最基本的功能結構域,誘導Ca2+振蕩活性明顯優(yōu)于其他體細胞表達的PLC。PLCζ的主要結構域與其他PLC異構體(β、δ、λ、η和ε)相同, PLCζ與PLCδ同構體的結構最為相似,與PLC δ1的序列一致性最大(33%),與PLCε的一致性最小(9%)[48]。但PLCζ的結構域更加離散,使其具有獨特的生理特性。首先,PLCζ具有4個串聯(lián)的能與Ca2+結合的螺旋-環(huán)-螺旋拓撲結構,像人類拇指和食指,稱為EF “手型”結構域[49]。相對于其他體細胞PLC異構體,PLCζ的EF結構域有較高的Ca2+敏感性,是PLCδ1的100倍,其半數(shù)效應濃度(EC50)達到80 nmol,PLCζ在卵子胞質靜止的Ca2+水平(100 nmol)時已經(jīng)達到一半的最大活性[50-51]。敲除兩個EF后,PLCζ的EC50急劇變到30 nmol,導致其完全喪失誘導卵子Ca2+振蕩的活性[51]。此外,PLCζ的EF結構域的N端富含堿性殘基,第一個EF結構域和XY-連接體多堿基區(qū)有靜電相互作用,被吸引到含陰離子的PIP2上[51]。

其次,XY結構域是PLC蛋白負責催化底物PIP2水解,具有高度保守性。所有的PLC異構體的XY結構域的相似度為60%,PLCζ的XY結構域與PLCδ1的XY有64%的相似性[52-53]。然而,用PLCδ1的XY替換PLCζ的,這種 PLCζ/PLCδ1蛋白嵌合體無法誘導小鼠卵子Ca2+振蕩[54]。對PLCζ的XY結構域的氨基酸殘基進行誘導突變,其酶活性完全喪失,引發(fā)哺乳動物卵子Ca2+振蕩的能力[55]。PLCζ的XY結構域的點突變與人類精子功能喪失有關,導致男性不育癥的發(fā)生[22-23]。X和Y之間具有連接序列稱為XY連接體,具有調節(jié)PLCζ的酶活性、靶向PIP2脂質底物和核轉位等的功能[56]。與PLCδ1相比,PLCζ的XY連接體更長,富含堿性殘基[57]。PLCζ的XY連接體的缺失會顯著降低水解PIP2和誘導Ca2+振蕩的活性[58]。PLCζ的XY連接體區(qū)域內帶正電的殘基能通過與帶負電荷的底物PIP2產(chǎn)生靜電相互作用,直接參與其在生物膜上的定位[59]。據(jù)報道,小鼠PLCζ的XY連接區(qū)含有一個有八氨基酸殘基(KKRKRKMK)核定位信號(NLS)序列,位于Y結構域的起點附近[60-61]。而豬的PLCζ在XY連接區(qū)斷裂后仍然具有功能活性,完整的多肽對PIP2底物的水解可能并不重要,PLCζ在XY連接區(qū)域內的蛋白裂解可能在哺乳動物受精過程中具有重要的調節(jié)功能[62]。不同物種PLCζ的XY連接序列整體上都是凈正電荷,XY連接序列在物種之間保守性最差的區(qū)域[63]。用小鼠PLCζ的XY連接域替換人類的相應區(qū)域,會使蛋白質的穩(wěn)定性明顯下降[64]。表明XY連接體的多樣性可能是不同物種PLCζ對PIP2水解效率和誘導Ca2+振蕩能力差異的原因。

最后,PLCζ的另一端是一段約有120個殘基的C2結構域[49]。目前,對C2結構域的確切作用仍未得到清晰的解釋,敲除C2結構域或用PLCδ1的對應序列替換,都能導致PLCζ完全喪失誘導卵子Ca2+振蕩的活性,但水解PIP2的能力及其Ca2+敏感性不受影響[65]。C2結構域與PI3P的相互作用可能在PLCζ的定位中起作用,甚至可能在調節(jié)酶的活性中起作用,因為PI3P的存在已被證明會降低PLCζ在體外水解PIP2的活性[49]。盡管對C2結構域的潛在生理特性有了這些推測,仍需進一步深入研究。

4 PLCζ活性的物種特異性

盡管哺乳動物精子PLCζ的序列具有較高的保守性,但PLCζ的催化活性存在明顯的物種差異。比較人和小鼠的PLCζ在誘導未受精小鼠卵子Ca2+振蕩的相對效力時發(fā)現(xiàn),重組純化的人PLCζ蛋白的活性比小鼠PLCζ高76%[66]。此外,對人/小鼠PLCζ嵌合體蛋白的分析表明,EF結構域在PLCζ活性的物種特異性中發(fā)揮重要的作用[66]。對PLCζ活性表現(xiàn)的明顯物種特異性的生理作用需要進一步研究。對猴和人PLCζ的主要結構進行比較發(fā)現(xiàn),氨基酸序列幾乎完全相同,只有XY連接區(qū)存在差異,人PLCζ缺少一個外顯子[56]。大多數(shù)哺乳動物的PLCζ相對分子質量為74,人類PLCζ在XY連接區(qū)缺失單個外顯子導致其相對分子質量降至70[56]。猴子和狨猴XY-linker中的單外顯子相對應的33個氨基酸序列含有大量帶負電荷,這會改變XY-linker區(qū)域內正/負電荷殘基的比例[56]。XY連接區(qū)域外顯子所編碼的殘基在PLCζ的酶或靶向活動中的確切功能還需要進一步研究。研究還發(fā)現(xiàn),不同物種的精子中PLCζ的相對溶解度存在差異[66-67]。這可能與觀察到的Ca2+振蕩的啟動時間有關,倉鼠精子含有高度可溶性的PLCζ,在精子與卵子融合后10 s內開始出現(xiàn)Ca2+振蕩,而小鼠PLCζ的溶解度相對較低,精卵融合和第一個Ca2+峰值之間有數(shù)分鐘的延遲[67]。

5 哺乳動物精子PLCζ的下游信號

5.1 卵子PIP2的分布和作用

精子的PLCζ與體細胞的PLC異構體相似,可以作用于細胞膜上豐富的PIP2,推測PLCζ也會以受精卵的質膜為靶點[47]。然而,研究發(fā)現(xiàn)PLCζ專門作用于卵子胞質中均勻分布的囊泡[68]。試驗觀測到小鼠卵子膜上的PIP2數(shù)量在受精后沒有明顯的減少[69]。此外,利用二酰甘醇(DAG)探針實時檢測發(fā)現(xiàn),當用Ca2+載體處理卵子或者注射PLCζ時,卵子的質膜上沒有檢測到DAG的增加[70]。這兩項研究表明,精子和PLCζ沒有在卵子質膜上水解PIP2。而利用免疫化學技術觀測小鼠卵子中的PLCζ分布,發(fā)現(xiàn)重組PLCζ定位于小于1 μm的細胞質囊泡[70]。使用PIP2特異性抗體進行觀測,也發(fā)現(xiàn)小鼠卵子中的PIP2似乎同樣定位于小囊泡中[70]。使用磷酸肌醇脂質磷酸酶來消耗細胞內的PIP2,并不能抑制或阻止精子或PLCζ介導的Ca2+振蕩[70],表明卵子質膜上的PIP2可能對受精時的Ca2+振蕩并不重要。相反,通過標記無功能的PLCζ突變體,將肌醇磷酸酶靶向到細胞質的小囊泡中,顯著抑制了精子或PLCζ介導的Ca2+振蕩[70]。有趣的是,PLCζ轉染的CHO細胞提取物能表現(xiàn)出明顯的體外PLC酶活性,但利用ATP來誘導的Ca2+釋放,并沒有觀測到明顯的Ca2+變化[71]。相反,將PLCζ轉染的CHO細胞或由這些細胞制成的細胞提取物注入小鼠卵子中,引發(fā)了類似受精的Ca2+振蕩[71]。而用PIP2抗體進行免疫化學觀測,CHO細胞的胞質中沒有PIP2的囊泡[71]。盡管可以確定PLCζ能水解細胞質內的PIP2,但精確靶向機制尚不清楚。

5.2 內質網(wǎng)InsP3受體 (InsP3R)

精子PLCζ進入卵子內催化PIP2水解,產(chǎn)生DAG和InsP3,之后InsP3與內質網(wǎng)膜上的受體InsP3R結合使其釋放Ca2+[72]。在體細胞中,InsP3R的活性受激酶PKA、磷酸酶蛋白、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和鈣調蛋白的調節(jié)[73-75]。InsP3R在哺乳動物卵子內是如何調控的還有待確定,但目前對其他細胞的研究發(fā)現(xiàn)這個機制是高度復雜的。InsP3R的數(shù)量與Ca2+水平相關,在受精后,由于InsP3水平的持續(xù)增加導致InsP3R的下調[76-77]。盡管InsP3R在觸發(fā)卵子Ca2+振蕩中起著關鍵作用,但可能存在其他補償路徑調控Ca2+的存儲和釋放[78]。InsP3R除了參與調控卵子Ca2+振蕩,在卵母細胞成熟過程中也起著重要作用[79-81]。InsP3R1是InsP3R亞型之一,在人類卵母細胞生發(fā)泡(GV)中呈現(xiàn)彌漫、不規(guī)則的顆粒狀分布,但MⅡ期時其定位變化為網(wǎng)狀和外周分布[82]。在2～4細胞期胚胎中,InsP3R1存在于中心和外圍,發(fā)育到6～8細胞期胚胎時,InsP3R1在整個細胞質重新分布,這些定位變化伴隨著該受體水平的增加而發(fā)生[82]。目前的研究證明,InsP3R在卵母細胞成熟、卵子激活和胚胎發(fā)育的信號傳遞過程中起關鍵作用,但相關的分子機制需要進一步的試驗來揭示。

6 PLCζ缺陷和卵子激活技術的應用

目前,全球超過15%的夫婦受到不孕不育的困擾,其中20%～35%的病例是由女性因素引起的,25%～40%的病例涉及男女共同因素,10%～25%的病例無法解釋[83]。自從1978年第一個IVF嬰兒誕生以來,輔助生殖技術已經(jīng)成為尋求不孕不育治療的夫婦的有力工具[84]。IVF失敗的患者可以選擇ICSI,但仍有1%～5%接受ICSI的患者受精失敗,原因尚不明確[85-87]。ICSI失敗的病例通常表現(xiàn)為卵母細胞激活失敗或流產(chǎn),可能與精子中PLCζ相對缺乏或與PLCζ突變有關[20-25]。在部分ICSI反復失敗的患者中發(fā)現(xiàn)的PLCζ突變,圓頭精子癥患者的精子缺乏頂體和頭部周圍的其他結構,造成PLCζ的缺乏,這與Dpy1912基因突變有關[88]。在Dpy1912基因缺失的小鼠模型中,精子頭部缺乏PLCζ,雄性精子不能激活卵母細胞[88]。這些研究表明,PLCζ缺乏或活性降低可能是ICSI后受精失敗的原因之一,可以以此為靶點,開發(fā)提高輔助生殖技術效率的策略。目前臨床上已經(jīng)證實,鈣離子載體A23187可用于輔助激活卵子,這在試驗中和臨床治療中得到了證實[89]。而直接利用PLCζ的mRNA注射可以輔助激活人類卵子,注射重組蛋白可以激活小鼠卵子并形成囊胚[90-92]。這可以作為開發(fā)中人工輔助卵子激活技術的新策略,但其激活效率和安全性需要確認。

7 小結與展望

哺乳動物受精時卵子內的Ca2+振蕩是一個獨特和關鍵的信號,精子PLCζ在觸發(fā)Ca2+振蕩中起關鍵作用。本文總結哺乳動物卵子受精和激活過程中涉及的精子PLCζ蛋白的鑒定、表達規(guī)律和作用原理。由于PLCζ觸發(fā)的級聯(lián)反應依賴于卵子內部的復雜的信號網(wǎng)絡,相關的研究對解析動物個體發(fā)生的原理至關重要。目前,一系列研究成果的積累,為解析卵子細胞周期恢復、母源mRNA降解、染色質配合、皮質顆粒釋放和阻止多精入卵提供了候選分子,但哺乳動物卵子激活的信號轉導網(wǎng)絡還有待進一步研究。未來對卵子激活的信號網(wǎng)絡關鍵分子的鑒定和作用機制的解析是重要的研究領域,可由此開發(fā)高效人工卵母細胞激活的新手段,提高胚胎移植的成功率,為提高輔助生殖技術和動物體外胚胎生產(chǎn)效率提供新方法。