LIF調(diào)控奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞容受性基因表達研究

王紅戰(zhàn),陳艷茹,李 琦,唐 穎,李 博,鄭 鵬

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,哈爾濱 150030)

胚胎的成功植入需要活化狀態(tài)的胚胎和處于接受狀態(tài)的子宮相互作用,并建立緊密的聯(lián)系[1-2]。此外,胚胎植入階段需要許多因子協(xié)調(diào)參與,需要囊胚黏附的穩(wěn)定性、滋養(yǎng)層細胞的侵襲和免疫調(diào)節(jié)才能實現(xiàn)妊娠和胚胎發(fā)育所需的平衡[3]。 一些分子生物途徑可以調(diào)節(jié)胚胎植入和子宮內(nèi)膜容受性。白血病抑制因子(LIF)是白細胞介素-6(IL-6)細胞因子家族的一部分,在人類、小鼠、豬、反芻家畜的研究中表明,在胚胎植入期間子宮內(nèi)膜LIF表達顯著增加[4-6]。因此,在胚胎植入過程中,LIF可能起到積極的作用。LIF與LIF受體(LIFR)結(jié)合后,激活子宮管腔上皮細胞(LE)中Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)信號通路,將LE轉(zhuǎn)變?yōu)榻邮軤顟B(tài),使胚胎得以植入、發(fā)育[7]。胚胎滋養(yǎng)層細胞和子宮內(nèi)膜上皮細胞在植入過程中相互作用形成新組織[8]。血管生成的刺激為植入提供所需的血流,使子宮內(nèi)膜細胞附著并在間皮表面生長。血管生成主要由血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體VEGFR介導(dǎo)[9]。HOXa10是一種含有同源盒的轉(zhuǎn)錄因子,能調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜上皮細胞中子宮內(nèi)膜接受性生物標(biāo)記基因的蛋白水平,包括血管內(nèi)皮生長因子、骨橋蛋白(OPN)、環(huán)氧合酶2(COX-2)和催乳素受體(PRLR)[10]。除了胚胎與子宮內(nèi)膜容受性同步的挑戰(zhàn)之外,炎癥在植入部位也起著至關(guān)重要的作用。Toll樣受體4(TLR4)在母胎界面中廣泛表達,既是膜受體,也是核因子Kappa-B(NF-κB)激活劑[11]。TLR4通過NF-κB調(diào)節(jié)炎癥因子的產(chǎn)生,影響胚胎的著床和子宮的生理環(huán)境[12]。

因此,本試驗探討了LIF對子宮內(nèi)膜容受性基因表達的影響,以及LIF能否通過STAT3信號通路改變子宮內(nèi)膜的容受性和炎癥反應(yīng),為研究LIF調(diào)控子宮內(nèi)膜細胞的機制提出新的見解,為進一步研究奶牛的妊娠生理學(xué)和指導(dǎo)奶牛的實際生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑

牛子宮內(nèi)膜上皮細胞,東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實驗室冷凍保存;0.25%胰酶,購自Amresco公司; DMEM/F12,購自Sigma公司;胎牛血清(FBS),購自Gibco公司;雙抗(每毫升含10 000 U青霉素和10 mg鏈霉素),購自Biosharp公司;LIF,購自Sangon Biotech公司;STAT3抑制劑Stattic,購自Selleck公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理

參照前期試驗的方法[8],使用基礎(chǔ)培養(yǎng)液(DMEM/F12 + 10% 胎牛血清+ 1%雙抗),在37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下,在60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)子宮內(nèi)膜上皮細胞,細胞生長密度達到80%時進行試驗。設(shè)3個組,即對照組、LIF處理(150 ng/mL)組、LIF (150 ng/mL)+STAT3(1.5 μmol)共處理組。處理24 h后,用于下一步的試驗。STAT3抑制劑使用DMSO配制成濃縮液,LIF使用無菌純化水配制成濃縮液,使用時用培養(yǎng)液稀釋成所需的濃度(DMSO濃度小于0.1%)。

1.3 實時熒光定量RT-PCR分析

采用實時定量RT-PCR檢測TLR-4、NF-κB、HOXa10、VEGF和β-actin的表達量。參考Zheng等[13]的方法,用TRIzol試劑提取RNA,使用TaKaRa試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA用于PCR試驗。檢測基因的引物序列如表1所示。由華大基因公司合成,內(nèi)參基因為β-actin,用2-ΔΔCT法計算靶基因的表達水平。

表1 基因檢測的引物序列

1.4 免疫蛋白印跡分析

參考Zheng等[2]的方法提取蛋白。用RIPA裂解緩沖液提取蛋白,使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)目的蛋白的大小不同使用10%和12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白樣品,每孔上樣30 μg蛋白樣品進行電泳;將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,按照抗體說明書加入一抗(TLR4、NF-κB、HOXa10、VEGF和β-actin;1∶1 000),4 ℃孵育過夜;再用TBST洗滌3次,每次5 min;隨后加入二抗(HRP標(biāo)記,1∶3 000),室溫孵育2 h;再用TBST洗滌3次,每次5 min),使用ECL發(fā)光液進行曝光;再用ECL Western印跡檢測系統(tǒng)檢測。使用 Image J 軟件對條帶進行分析。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0軟件,分別采用獨立樣本t檢驗以及鄧肯氏法進行數(shù)據(jù)比較分析。所有數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準誤”,P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 LIF對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞基因和蛋白表達的影響

RT-PCR和Western blot分析結(jié)果顯示,與對照組相比,LIF處理組奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞的容受性相關(guān)基因HOXa10、VEGF表達水平顯著升高(P<0.05),炎癥相關(guān)基因TLR4、NF-κB的表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖1。

注:標(biāo)注字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 LIF和STAT3抑制劑對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞基因和蛋白表達的影響

LIF和STAT3抑制劑對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞基因和蛋白表達的影響見圖2。由圖2可以看出:與LIF處理組比較,LIF+STAT3共處理組奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞的容受性相關(guān)基因HOXa10、VEGF表達量顯著降低(P<0.05),但與對照組沒有差異(P>0.05),說明LIF需要經(jīng)過STAT3磷酸化激活HOXa10、VEGF的表達;與LIF處理組比較,LIF+STAT3共處理組奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞的炎癥相關(guān)基因TLR4、NF-κB的表達無顯著差異(P>0.05),但二者均顯著高于對照組(P<0.05)。說明LIF通過膜受體直接激活TLR4、NF-κB,不經(jīng)過STAT3磷酸化的通路。

注: 標(biāo)注字母不同表示差異顯著(P<0.05),相同表示差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

胚胎附植過程中,子宮內(nèi)膜經(jīng)歷重塑過程,達到容受狀態(tài)以接受胚胎。調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性的重要因素之一是LIF,這是一種屬于IL-6超家族的多效性細胞因子,在廣泛的生理過程中起主要作用。在子宮接受期,LIF支持囊胚附著、侵襲以及蛻膜化過程[14]。植入前,LIF在小鼠的囊胚和滋養(yǎng)外胚層中表達[15]。在小鼠交配后第4天,子宮內(nèi)膜腺中也發(fā)現(xiàn)了LIF表達,隨后證明雌性LIF基因敲除小鼠具有生育能力,但囊胚未能植入,并且小鼠LIF受體(LIFR)的破壞與胚胎異常發(fā)育、死亡有關(guān)[16]。豬的子宮內(nèi)膜中LIF和LIFR表達在發(fā)情周期內(nèi)波動,在發(fā)情后期表達升高,并在胚胎發(fā)育的第11～12 d升高[17]。綿羊妊娠第16～20 d觀察到子宮內(nèi)膜LIF表達最高,在第17天綿羊囊胚中發(fā)現(xiàn)LIF蛋白[18]。這些研究提供了強有力的證據(jù)證明LIF影響胚胎植入過程,并且參與了家畜胚胎與子宮內(nèi)膜的交流。

HOXa家族是胚胎植入、子宮蛻膜和免疫調(diào)節(jié)的內(nèi)在組成部分,是胚胎著床調(diào)控主要候選基因。上調(diào)子宮內(nèi)膜中HOXa10 mRNA和蛋白的表達,可提高胚胎著床率和臨床妊娠率,相反,如若敲除HOXa10,胚胎著床率和成活率均降低[19]。血管內(nèi)皮生長因子VEGF在子宮內(nèi)膜新生血管形成中起重要作用,直接參與調(diào)控子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)控[20]。這都表明HOXa10和VEGF在著床期子宮內(nèi)膜中高表達,二者都是子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志性分子,在胚胎植入過程中起重要作用。本試驗結(jié)果表明,LIF能夠上調(diào)HOXa10、VEGF基因的表達,對奶牛的胚胎植入具有促進作用。

STAT3是LIF下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,通常以非活性狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中,當(dāng)被磷酸化激活時,可將刺激信號傳遞入細胞核內(nèi),LIF與gp130復(fù)合受體結(jié)合可以激活下游STAT3,促進基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[21]。研究表明,LIF通過對STAT3的磷酸化影響子宮內(nèi)膜上皮細胞。體內(nèi)STAT3活化僅由LIF誘導(dǎo),使得STAT3特異性定位于子宮管腔上皮細胞的細胞核,這些都與子宮內(nèi)膜容受性相吻合[22]。本試驗中的蛋白印跡結(jié)果顯示,使用LIF處理子宮內(nèi)膜上皮細胞后,與子宮內(nèi)膜上皮細胞容受性相關(guān)的基因、蛋白表達量均顯著增加,而使用STAT3抑制劑處理后減少。以上結(jié)果都表明,LIF可以激活STAT3信號通路、增強子宮容受性,進而影響牛的胚胎植入過程。

適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答在胚胎植入期間的子宮內(nèi)膜中起著至關(guān)重要的作用[23]。在子宮內(nèi)膜的母胎界面進行精確的免疫平衡,可以獲得積極的妊娠結(jié)果。目前的研究表明,著床和早孕是一種促炎狀態(tài),局部炎癥反應(yīng)有助于植入[24]。白血病誘導(dǎo)因子LIF是促炎IL-6家族的一種多效性細胞因子[25]。研究發(fā)現(xiàn),在植入窗口期,LIF免疫反應(yīng)較弱的女性比LIF表達較高的女性懷孕的可能性更小。因此,LIF可能調(diào)控局部炎癥反應(yīng),以確保植入成功[26]。TLR4、NF-κB是調(diào)控機體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答過程中的重要細胞因子[27]。本試驗結(jié)果表明,LIF上調(diào)了TLR4和NF-κB的表達,但是其具體調(diào)控機制還需進一步研究。

4 結(jié) 論

LIF通過激活STAT3信號通路調(diào)控奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞容受性相關(guān)基因HOXa10、VEGF的表達,預(yù)期增強子宮內(nèi)膜的容受性,并促進牛胚胎附植。