苯并[a]芘和慢性壓力應激暴露對小鼠肝臟代謝的影響＊

于景娜 謝 麗 陳志宇,3 鐘慧芳 屠 潔 李 芳 楊甲甲 羅 茜,3**

（1.河北工程大學材料科學與工程學院，邯鄲，056038；2.中國科學院深圳先進技術研究院，深圳，518055；3.中國科學院大學，北京，100049）

中國心理健康調查報告顯示國內精神障礙疾病負擔較重，抑郁和焦慮癥患病率較高[1].心理健康受到社會和環(huán)境等多種因素影響，引發(fā)的炎癥、氧化應激和神經遞質紊亂都可能是神經系統(tǒng)疾病的致病因素.長期壓力應激狀態(tài)會誘發(fā)焦慮、抑郁等精神類疾病，還具有導致器官功能性病變的風險[2].環(huán)境污染也可影響疾病的發(fā)生發(fā)展過程，污染物暴露可通過影響下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）的功能和應激反應而引發(fā)心理疾病[3].研究表明心理應激和交通或工業(yè)空氣污染對健康的不良影響存在明顯協(xié)同效應[4].慢性壓力應激狀態(tài)下，全身易感性增強，環(huán)境污染物的毒性作用更為明顯.據報道，慢性壓力應激和150 mg·kg?1醋酸鉛同時暴露2 個月可顯著影響大鼠基底皮質酮水平與HPA 軸功能[5].Zhou 等[6]發(fā)現妊娠期孕婦社會心理壓力較大時，鉛金屬污染物暴露與嬰幼兒神經缺陷、認知發(fā)育不全等不良健康的關聯(lián)性增加.Clougherty 等[7]研究發(fā)現，處于慢性壓力下的大鼠對濃縮細顆?？諝馕廴镜暮粑磻鼜?，并可能存在不同易感性的途徑.現有流行病學數據無法確定差異易感性的生理機制[8]，因此，本文基于毒理代謝組學闡明慢性壓力應激和污染暴露之間的潛在相互作用.

B[a]P 是環(huán)境和食品中常見的污染物，主要通過呼吸和飲食途徑進入體內，在肝臟蓄積和代謝活化，導致肝功能異?；蚋螕p傷[9].B[a]P 及其代謝物可與體內氨基酸、有機酸、脂質等代謝物相互作用而具有肝毒性效應[10].長期慢性心理應激狀態(tài)下機體生理功能和免疫力顯著降低[11]，因此可能對B[a]P 暴露的應答會產生更復雜影響，但目前未有明確的影響機制研究.本研究選用慢性不可預知溫和刺激（chronic unpredictable mild stimulation，CUMS）作為慢性壓力應激模型，采用靶向代謝組學分析方法研究了不同劑量B[a]P 和CUMS 單獨或兩者同時暴露對雄性C57BL/6J 小鼠肝臟中氨基酸、TCA 循環(huán)和膽汁酸代謝的影響，并通過統(tǒng)計學分析篩選出了差異代謝物，擬從代謝物差異變化初步探討肝臟對B[a]P 和慢性壓力應激的應答和代謝機制.

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 試劑

B[a]P（≥96%，HPLC 級）購自Sigma 化學公司（St Louis，MO，USA）；甲酸（LC-MS 級）、乙腈（LCMS 級）、甲醇（LC-MS 級）和甲酸銨（LC-MS 級）購自J&K 化學公司（Beijing，China）；超純水由美國Milli-Q 超純水系統(tǒng)（Millipore，Billerica，USA）凈化.

1.2 實驗動物

雄性C57BL/6J 小鼠（7 周齡）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司（Beijing，China），并在中國科學院深圳先進技術研究院喂養(yǎng)，保持12 h 光/暗循環(huán)，恒溫20—26 ℃，相對濕度40% —70%.動物實驗經中國科學院深圳先進技術研究院動物實驗和實驗動物福利委員會批準，所有涉及動物的實驗程序都嚴格按照國家動物實驗法律法規(guī)和參考美國國立衛(wèi)生研究院出版的《實驗動物護理和使用指南》執(zhí)行.

1.3 動物實驗

小鼠適應環(huán)境一周后被隨機分成6 組（n=7）：對照組（給予等體積橄欖油）、低劑量B[a]P 暴露組（2.0 mg·kg?1·d?1）、高劑量B[a]P 暴露組（20.0 mg·kg?1·d?1）、CUMS 組（給予等體積的橄欖油和CUMS 刺激）、低/高劑量B[a]P 和CUMS 同時暴露組（不同劑量B[a]P 暴露基礎上進行CUMS 刺激）.B[a]P 溶于橄欖油中采用口服灌胃方式暴露；低/高劑量B[a]P 和CUMS 同時暴露組在灌胃2 h 后以隨機排序給予以下CUMS 刺激操作：①小鼠置于相對濕度40%—70%的潮濕環(huán)境中12 h，②每只小鼠置于50 mL 管中禁食禁水2 h 進行約束處理，③將4 只小鼠同時置于3 cm × 5 cm × 7 cm 的盒子中2 h，并禁食禁水.持續(xù)暴露21 d，暴露實驗開始和結束時記錄小鼠體重.暴露結束后頸部脫臼法處死小鼠，立即切除肝組織，稱取肝臟濕重用于計算肝臟臟器系數（肝臟臟器系數=肝臟濕重/體重 × 100%），隨后在液氮中速凍、轉移至-80 ℃冰箱儲存.

1.4 靶向代謝組學分析

1.4.1 樣品前處理

取適量肝臟組織樣本置于2.0 mL 離心管中，加入超純水（肝組織重量:水重量=4:1），在高通量組織研磨儀（SCIENTZ-48L，Scientz，China）中進行研磨（4 ℃,2.0 min）.稱取約15 mg 肝組織勻漿轉移至1.5 mL 新離心管中，加入0.2 mL 甲醇，渦旋振蕩20 min，在4 ℃和12000 r·min?1條件下離心15 min，取上清液進行儀器分析.

1.4.2 儀器分析

使用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜儀（UPLC-MS/MS 8060，Shimadzu，Japan）對肝臟組織中75 種氨基酸、有機酸和膽汁酸類相關代謝物（表1、表2 和表3）進行測定，采用外標法進行定量.具體分析條件如下.

表1 氨基酸代謝物的質譜參數Table 1 Mass spectrometry parameters for amino acid metabolites

表3 膽汁酸代謝物的質譜參數Table 3 Mass spectrometry parameters for bile metabolites

色譜參數：色譜柱柱溫為40 ℃，流動相流速為0.2 mL·min?1，進樣量為1.0 μL.

氨基酸類：Waters ACQUITY UPLC?HSS T3 色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm），流動相A 為0.1%甲酸-水，流動相B 為0.1%甲酸-乙腈，梯度洗脫程序為：0 — 0.5 min，0% B；6.0 min，75% B；6.1 min，0% B，維持2.0 min.

有機酸類：Waters ACQUITY UPLC?HSS C18 色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm），流動相A 為0.01mol· L?1甲酸銨-水，流動相B 為0.01mol· L?1甲酸銨-甲醇，梯度洗脫順序為：0 min，5% B；2.0 min，60% B；2.1 min，5% B，維持2 min.

膽汁酸類：Waters ACQUITY UPLC?BEH C18 色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm），流動相A 為0.1%甲酸-水，流動相B 為0.1%甲酸-乙腈，梯度洗脫程序：0.0 min，40%B；0.5 min，45%B；1.0 min，50%B；2.0 min，52%B；2.5 min，53%B；4.5 min，54%B；5.0 min，55%B，維持1.0 min；7.0 min，70%B；8.0 min，95%B；8.5 min，100%B，維持1.0 min；10.5 min，40% B，平衡2.0 min.

質譜參數：正離子和負離子模式下電噴霧電壓分別為4.0 kV 和-3.0 kV，霧化氣體流量3.0 L·min?1，干燥氣流量10 L·min?1，加熱氣體流量10 L·min?1，接口溫度300 ℃，DL 溫度250 ℃，加熱模塊溫度400 ℃.各代謝物具體質譜參數如表1、表2 和表3 所示，定量限為0.02—220.44 μg·L?1，檢出限為0.01—77.44 μg·L?1.

1.5 代謝擾亂度計算

代謝擾亂度（Metabolic effect level index,MELI）是一種用于評估暴露后生物體代謝產物、特定代謝途徑或整體代謝反應的定量終點指標[12].首先根據公式（1）計算不同組別樣品中每個代謝物的變化（MCi）.其中，Ai為暴露組與對照組中單個代謝物i平均濃度的比值，ln（1）用于抵消對照組代謝水平.

將各代謝物的代謝變化匯總為累積代謝變化，根據公式（2）計算MELI 值：

當MELIComb值接近MELIB[a]P和MELICUMS平方和的算術平方根時，B[a]P 和CUMS 的聯(lián)合效應類型為加和效應；當MELIComb值大于MELIB[a]P和MELICUMS之和時，聯(lián)合效應類型為協(xié)同效應；當MELIComb值小于MELIB[a]P或MELICUMS時，聯(lián)合效應類型為拮抗效應.

1.6 統(tǒng)計分析

使用MetaboAnalyst 5.0 在線分析軟件進行多變量統(tǒng)計分析，基于KEGG 數據庫進行代謝通路分析（https://www.metaboanalyst.ca/），GraphPad Prism 9.0 軟件進行統(tǒng)計學分析和繪圖.使用單因素方差分析P＜ 0.05，偏最小二乘判別分析模型變量影響重要性因子（Variable importance in the projection，VIP）值 ＞1.0 和ROC 曲線下面積（Area under curve，AUC）值 ＞ 0.75，作為顯著差異代謝物的篩選準則.所有數據均以平均數 ± 標準差（Mean ± SD）表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）分析組間差異，P＜0.05 為組間差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果和討論（Results and discussion）

2.1 不同暴露條件對小鼠體重和肝臟臟器系數的影響

暴露實驗結束時小鼠體重增加系數見圖1a.連續(xù)暴露21 d，除2.0 mg·kg?1·d?1的B[a]P 暴露組外，20.0 mg·kg?1·d?1B[a]P 與CUMS 單獨暴露及不同劑量B[a]P 與CUMS 共同暴露的小鼠體重平均增長系數均低于對照組，表明高劑量B[a]P 與CUMS 單獨暴露及B[a]P 與CUMS 同時暴露均可在一定程度上抑制小鼠的體重增長，減緩小鼠的生長速率.如圖1b 所示，不同劑量B[a]P 與CUMS 單獨或二者同時暴露的小鼠肝臟臟器系數均低于對照組，表明B[a]P 與CUMS 均可引發(fā)肝臟出現一定程度萎縮，說明肝臟是B[a]P 與CUMS 暴露的重要靶器官.

圖1 不同劑量B[a]P 和CUMS 單獨或同時暴露后變化情況（a）小鼠體重；（b）肝組織臟器系數數據以均值 ± 標準差表示，n=7，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01 為組間具有顯著差異Fig.1 Different doses of B[a]P and CUMS alone or in combination with post-exposure mouse body weight（a）and changes in the coefficients of liver tissue organs（b）Data were shown in Means ± SD,n=7,*P ＜ 0.05 and **P ＜ 0.01 represented significant differences among each group

2.2 B[a]P 暴露對小鼠肝臟代謝的影響

采用PLS-DA 評估不同劑量B[a]P 暴露后小鼠肝臟氨基酸、TCA 循環(huán)和膽汁酸代謝的變化.模型累計貢獻率（R2）和模型預測能力（Q2）分別為0.947 和0.676，置換檢驗P值為0.021，表明建立的PLSDA 模型具有良好的解釋和預測能力，且不存在過擬合情況.如圖2a 所示，兩個暴露組和對照組在第一主成分上得到良好區(qū)分，說明兩個劑量B[a]P 暴露均可引起小鼠肝臟代謝紊亂.

篩選出兩種B[a]P 暴露劑量下的顯著差異代謝物，結果如圖2b 所示（篩選準則見1.6 節(jié)所述）.與對照組相比，2.0 mg·kg?1·d?1B[a]P 可使小鼠肝臟中精氨琥珀酸、精氨酸、丙氨酸水平顯著上升（P＜0.05）而谷氨酰胺水平顯著下降（P＜ 0.01）；20.0 mg·kg?1·d?1B[a]P 導致小鼠肝臟中谷氨酰胺水平顯著降低（P＜ 0.01）和丙氨酸顯著升高（P＜ 0.05）.以往研究也發(fā)現，腹腔注射1 mg·kg?1·d?1的B[a]P 可使SD 大鼠肝臟組織中氨基酸代謝發(fā)生紊亂，導致谷氨酰胺顯著下降，精氨酸、丙氨酸等顯著升高，谷草轉氨酶顯著升高[13].作為細胞增殖分化的必需營養(yǎng)物質，肝臟中谷氨酰胺含量下降可能與癌細胞增殖攝取有關，并有可能促發(fā)肝細胞凋亡[14].Wang 等[15]發(fā)現，10 mg·kg?1和20 mg·kg?1B[a]P 暴露3 個月大鼠肝癌發(fā)生率分別為26.3%和35.3%，Michurina 等[16]也發(fā)現，200 mg·kg?1B[a]P 暴露3 d 后可致大鼠肝細胞凋亡.同時，谷氨酰胺與丙氨酸還是肝糖原異生的重要底物[17]，推測B[a]P 暴露也會影響小鼠肝臟中糖異生能量轉化途徑.此外，精氨酸與精氨琥珀酸是尿素循環(huán)的中間代謝產物，2.0 mg·kg?1B[a]P 暴露后兩者顯著上升表明尿素循環(huán)代謝被擾亂，可能會引發(fā)肝功能衰竭、化學性肝損傷等肝臟疾病[18].

如圖2c 和2d 所示，通過對顯著差異代謝物進行KEGG 代謝通路分析發(fā)現，兩個不同劑量B[a]P 暴露主要影響小鼠肝臟丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、氨基?；?tRNA 生物合成、氮代謝、精氨酸代謝合成，而2.0 mg·kg?1·d?1B[a]P 影響的9 個代謝通路，20.0 mg·kg?1·d?1B[a]P 影響的8 個代謝通路.這些結果表明，B[a]P 經口暴露后主要影響肝臟氨基酸代謝，低劑量B[a]P 暴露的影響更為明顯.

2.3 B[a]P 與慢性壓力應激暴露對小鼠肝臟代謝影響

如圖3a 所示，從PLS-DA 因子得分圖（R2=0.729，Q2=0.357，P＜ 0.001）可以看出，CUMS 單獨暴露和與B[a]P 同時暴露對小鼠肝臟氨基酸和膽汁酸代謝都有明顯影響.根據差異代謝物篩選準則，發(fā)現CUMS 刺激后，小鼠肝組織中同型半胱氨酸水平顯著下降（P＜ 0.05），這與以往有關CUMS 刺激后小鼠肝臟組織代謝變化的結果一致[19].同時，發(fā)現兩個劑量B[a]P 和CUMS 同時暴露小鼠肝臟的氨基酸和膽汁酸代謝物變化，如圖3b 中所示，2.0 mg·kg?1·d?1B[a]P 與CUMS 同時暴露使得小鼠肝組織中5-羥基吲哚乙酸、同型半胱氨酸、組氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、絲氨酸水平顯著降低（P＜ 0.05）；而20.0 mg·kg?1·d?1B[a]P 與CUMS 同時暴露則主要干擾肝臟膽汁酸代謝途徑，表現為甘膽酸、?；切苊撗跄懰帷⑴；悄懰?、膽酸和α-鼠膽酸水平顯著升高（P＜ 0.05）.即2.0 mg·kg?1·d?1B[a]P 與CUMS 共同暴露后肝臟氨基酸代謝紊亂而20.0 mg·kg?1·d?1B[a]P 與CUMS 共同暴露后肝臟膽汁酸代謝異常.作為參與機體膽固醇和脂質代謝的內源性小分子代謝物，膽汁酸在肝組織中的累積會誘導肝損傷的發(fā)生[20].此外，次級膽汁酸如甘膽酸、牛磺熊脫氧膽酸的水平變化與肝性腦病和2-型糖尿病有關[21].同時氨基酸代謝與肝臟正常生理功能密切相關，其紊亂還與肝炎、肝硬化等疾病的發(fā)生有關[22].已有文獻報道，CUMS 和B[a]P 暴露都可使小鼠肝功能血清生化指標天冬氨酸氨基轉移酶和丙氨酸氨基轉移酶活性升高[23?24]，且肝組織HE 染色后可觀察到明顯的組織病理學變化[25?26]，表明CUMS 和B[a]P 可導致肝功能異常和肝損傷.因此，推測B[a]P 與CUMS 暴露引發(fā)的小鼠肝臟氨基酸和膽汁酸代謝物的變化是其誘導肝功能異常和肝損傷可能的機制之一.

2.4 B[a]P 與慢性壓力應激同時暴露的作用效應類型

環(huán)境污染和心理健康是疾病發(fā)生與發(fā)展的兩大因素，流行病學調查發(fā)現空氣污染暴露對處于慢性壓力狀態(tài)機體的不良影響顯著增加[27]，但具體的生理機制及兩者間相互作用尚不完全清楚.毒理代謝組學可從代謝物角度揭示壓力應激和環(huán)境污染暴露之間的效應，代謝擾亂度（MELI）可將信息量豐富的代謝組學數據轉化成一個綜合的定量終點，目前已被用于評估反映PM2.5、氯化石蠟等污染物暴露后細胞代謝的的總體變化情況[28?29].小鼠肝組織中氨基酸代謝、TCA 循環(huán)和膽汁酸代謝在B[a]P 與CUMS 單獨或同時暴露后MELI 值見圖4.

圖4 不同劑量B[a]P 與CUMS 單獨或二者同時暴露后小鼠肝組織中代謝擾亂度值（a）氨基酸代謝，（b）TCA 循環(huán)，（c）膽汁酸代謝（數據以均值 ± 標準差表示，n=7）Fig.4 The MELI of amino acids metabolism（a）TCA cycle（b）and bile acids metabolism（c）of mice liver after single or combined exposure to CUMS and B[a]P with different dose Data were shown in Mean ± SD,n=7

從圖4 中看出，20.0 mg·kg?1·d?1的B[a]P 對氨基酸代謝、TCA 循環(huán)和膽汁酸代謝的影響更大.如圖4a 所示，氨基酸代謝MELILow-CUMS值小于MELILow和MELICUMS表明低劑量B[a]P 與CUMS 同時暴露對小鼠肝臟氨基酸代謝的聯(lián)合效應為拮抗效應；MELIHigh-CUMS值接近于MELILow2+MELICUMS2算術平方根的值，說明高劑量B[a]P 與CUMS 同時暴露對小鼠肝臟氨基酸的聯(lián)合效應為加和效應.TCA 循環(huán)的MELILow-CUMS值大于MELILow+MELICUMS，而MELIHigh-CUMS值小于MELIHigh且大于MELICUMS（圖4b），說明低劑量B[a]P 與CUMS 同時暴露對小鼠肝臟TCA 循環(huán)具有協(xié)同效應，而高劑量B[a]P 與CUMS 同時暴露對小鼠肝臟TCA 循環(huán)具有拮抗效應.不同劑量B[a]P 與CUMS 同時暴露對小鼠肝臟氨基酸代謝和TCA 循環(huán)的聯(lián)合效應均不同，其效應的類型與共同暴露時B[a]P 的劑量有關.此外，膽汁酸代謝的MELILow-CUMS與MELIHigh-CUMS值分別接近MELILow2+MELICUMS2和MELIHigh2+MELICUMS2（圖4c），表明不同劑量B[a]P 與CUMS 同時暴露對小鼠肝臟膽汁酸代謝的聯(lián)合效應類型均為加和效應.

3 結論（Conclusion）

本研究通過靶向代謝組學分析方法，發(fā)現了暴露在B[a]P 下主要影響氨基酸代謝且不同劑量條件下小鼠肝臟代謝應答存在明顯差異.不同劑量B[a]P 均可導致谷氨酰胺水平顯著下降，丙氨酸顯著上升；同時2.0 mg·kg?1·d?1B[a]P 還可使精氨琥珀酸、精氨酸顯著上升.不同劑量B[a]P 對肝臟代謝影響的機制是不同的.慢性壓力應激影響小鼠肝臟氨基酸代謝，同型半胱氨酸含量顯著下降.B[a]P 與CUMS 同時暴露，使得小鼠肝臟氨基酸和膽汁酸代謝發(fā)生顯著變化，差異的代謝物與兩者單獨暴露明顯不同.利用MELI 評估污染物和精神因素對小鼠肝臟代謝的聯(lián)合作用，不同劑量B[a]P 與CUMS 對氨基酸代謝、TCA 循環(huán)和膽汁酸代謝具有不同的作用，差異的機制還需要進一步研究.本研究初步闡明了兩大因子對肝臟氨基酸、有機酸和膽汁酸代謝的影響，但對脂質、激素等代謝的影響及具體作用機制還需進一步研究.綜上，本研究發(fā)現的代謝異常與肝損傷、肝功能異常、肝細胞炎癥和肝癌等病變的發(fā)生有關，這有助于進一步理解環(huán)境污染物與精神因素對機體健康的作用.