基于LC-MS/MS 技術(shù)的水蛭配方顆粒中7 種堿基和核苷成分分析方法的建立

姜 俊 程春雷 楊 昊

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院（國(guó)家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），濟(jì)南，250000）

水蛭為水蛭科動(dòng)物螞蝗（WhitmaniapigraWhitman）、水蛭（HirudonipponicaWhitman）或柳葉螞蝗（WhitmaniaAcranulataWhitman）的干燥全體，具有破血通經(jīng)、逐瘀消癥等功效，臨床上具有很高的藥用價(jià)值[1].針對(duì)水蛭藥材，采用液相色譜法對(duì)其進(jìn)行黃嘌呤、尿苷、尿嘧啶、次黃嘌呤中1—4 種堿基及核苷成分的含量測(cè)定已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[2?4].堿基是嘌呤和嘧啶的衍生物，是合成核苷、核苷酸和核酸的基本組成單位.核苷是是核酸合成的前體，具有保護(hù)神經(jīng)、抗病毒和抗菌等生物活性.李桃運(yùn)用多種色譜分離手段從水蛭中提取并分離鑒定出38 個(gè)化合物[5]，荊文光等從水蛭甲醇提取物中分離鑒定了18 個(gè)化合物[6]，除上述4 種成分外，還包含其他幾種成分，如腺苷、腺嘌呤、次黃嘌呤苷（肌苷），但未均建立此類成分的含量測(cè)定方法.

水蛭配方顆粒是由水蛭飲片經(jīng)水加熱提取、濃縮、干燥、制粒而成的一種顆粒.目前，水蛭配方顆粒暫未出臺(tái)相應(yīng)的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)，廣東、山東、湖南等地公布了水蛭配方顆粒的省級(jí)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，這些標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定項(xiàng)主要涉及抗凝血活性、水蛭胺C、次黃嘌呤的測(cè)定.除此之外，未見水蛭配方顆粒中多種堿基和核苷成分同時(shí)測(cè)定的相關(guān)報(bào)道.堿基和核苷化合物絕大部分是強(qiáng)極性的小分子，僅依靠傳統(tǒng)的疏水作用機(jī)制難以進(jìn)行較好的色譜保留，該類化合物也一直是分析技術(shù)的難點(diǎn).本試驗(yàn)通過多重保留機(jī)制的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立同時(shí)快速測(cè)定水蛭配方顆粒中7 種堿基和核苷類成分的含量方法，該方法具有分析快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的特點(diǎn)，可為水蛭配方顆粒甚至水蛭藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑：尿嘧啶、次黃嘌呤、腺苷、腺嘌呤、肌苷對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司），黃嘌呤對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院），尿苷對(duì)照品（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司），純度均大于98%.水蛭配方顆粒來源于廣東一方制藥有限公司，每袋1.5 g，每1 g 配方顆粒相當(dāng)于2 g 藥材.

儀器：超高效液相色譜儀Nexera X2 與三重四極桿質(zhì)譜LCMS-8050 聯(lián)用系統(tǒng)（島津，日本）.

1.2 樣品的制備

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：精密稱取7 種堿基和核苷對(duì)照品各適量，除黃嘌呤用20 mmol·L?1氫氧化鈉溶解外，其余均采用10%甲醇溶液溶解，最終用10%甲醇溶液配制成系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，待上機(jī)分析.

樣品前處理：取水蛭配方顆粒5 袋，研細(xì)，稱取約0.1g（精確到0.0001g），加入10%的甲醇溶液100 mL，渦旋混勻1 min，50 ℃超聲30 min，4000 r·min?1離心10 min，上清液用0.22 μm 的尼龍濾膜濾過，取續(xù)濾液即得.樣品的稀釋：精密量取制備好的樣品續(xù)濾液1 mL，用10%甲醇溶液定量稀釋至10 mL.

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

液相色譜條件：色譜柱為Discovery?HS F5-3（150 mm×2.1 mm,3 μm），流動(dòng)相：A 為0.15%甲酸水溶液，B 為甲醇；流速0.35 mL·min?1，梯度洗脫，0—1min，2%—5%B，1—5 min，5%B—50%B，5—5.5 min，50%B—90%B，5.5—7 min，90%B，7.01—10 min，2%B；柱溫40 ℃，進(jìn)樣體積：1 μL.

質(zhì)譜條件：ESI 正負(fù)離子模式同時(shí)監(jiān)測(cè)；接口電壓：+0.5 kV（正離子），?0.5 KV（負(fù)離子）；霧化氣流速：氮?dú)?.0 L·min?1；加熱氣流速：空氣15 L·min?1；干燥氣流速：氮?dú)? L·min?1；脫溶劑管溫度：150 °C；加熱模塊溫度：300 °C；離子源接口溫度：350 °C；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；駐留時(shí)間：25 ms；MRM 參數(shù)見表1.

表1 7 種堿基和核苷的MRM 參數(shù)列表Table 1 MRM parameters for 7 nucleobases and nucleosides

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

依據(jù)待測(cè)化合物的溶解性及參考相關(guān)文獻(xiàn)[4，7]，本實(shí)驗(yàn)嘗試了使用水、10%甲醇、70%甲醇、0.1%甲酸及10 mmol·L?1氫氧化鈉在50 ℃下進(jìn)行超聲提取30 min，考察不同溶劑的提取效率.結(jié)果顯示：70%甲醇、0.1%甲酸及10 mmol·L?1氫氧化鈉提取條件下，肌苷的峰面積偏低，且70%甲醇提取條件下色譜峰會(huì)展寬.水和10%甲醇對(duì)大部分化合物的提取效率相當(dāng)，但10%甲醇對(duì)腺苷的提取效率要優(yōu)于水.綜合考慮，確定樣品溶液的制備方式為10%甲醇50 ℃條件下超聲30 min.

2.2 分析條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)曾比較了不同流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)色譜峰及質(zhì)譜響應(yīng)的影響，如乙腈－0.02%甲酸和1 mmol·L?1乙酸銨水溶液、乙腈－0.1%甲酸水溶液、甲醇－0.1%甲酸水溶液、甲醇－0.15%甲酸水溶液.最后確定采用甲醇－0.15%甲酸水溶液的流動(dòng)相體系，該體系下各化合物色譜保留較好且質(zhì)譜信號(hào)較強(qiáng).

7 種待測(cè)堿基和核苷化合物的屬于極性較強(qiáng)的化合物，傳統(tǒng)反相色譜保留效果欠佳.董萌等嘗試用親水色譜對(duì)食品中的堿基、核苷和核苷酸類物質(zhì)進(jìn)行色譜保留[8].親水色譜對(duì)強(qiáng)極性化合物保留較好，但要得到較好的峰形和重復(fù)性，方法開發(fā)的難度往往比普通反相色譜的難度要大.本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了Discovery?HS F5-3、Shim-pack GIST C18 和ShimNex UP C18 色譜柱對(duì)分析測(cè)試的影響.結(jié)果顯示Discovery?HS F5-3 色譜柱對(duì)待測(cè)化合物的保留最好，且質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)相對(duì)更高.Discovery?HS F5-3 是一款在硅膠基質(zhì)上鍵合了五氟苯基的色譜柱，提供了疏水作用、氫鍵作用、離子作用等多重保留機(jī)制，對(duì)強(qiáng)極性化合物的保留和異構(gòu)體的分離優(yōu)于常規(guī)C18 柱.

2.3 精密度試驗(yàn)

將10 ng·mL?1的混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，尿苷、肌苷、腺苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶和黃嘌呤7 種化合物測(cè)得峰面積的RSD 分別為4.50%、5.83%、1.84%、3.35%、4.27%、2.08%、3.54%，表明精密度良好.

2.4 線性范圍和靈敏度

取系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測(cè)定，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制校準(zhǔn)曲線，得到7 種堿基和核苷的線性方程、判定系數(shù).以各化合物信噪比（S/N）約為3時(shí)計(jì)算對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限（LOD），各對(duì)照品信噪比（S/N）約為10 時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為定量限（LOQ），結(jié)果如表2 所示.由表2 可知，7 種堿基和核苷在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，判定系數(shù)（R2）≥0.996，檢出限在0.13—1.18 μg·g?1范圍內(nèi)，定量限在0.43—3.94 μg·g?1范圍內(nèi)，該方法靈敏度較高.

表2 7種堿基和核苷的線性范圍及靈敏度Table 2 Linear range and sensitivity of 7 nucleobases and nucleosides

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

取“1.3”項(xiàng)下樣品溶液上機(jī)測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算7 種堿基和核苷的含量.尿苷、肌苷、腺苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶和黃嘌呤的含量分別為41.42、7.11、1.24、314.87、4.89、55.83、53.95 μg·g?1.本品中尿苷、次黃嘌呤、尿嘧啶和黃嘌呤的含量相對(duì)較高，肌苷、腺苷和腺嘌呤有檢出，但含量較低.另精密稱取已測(cè)知含量的水蛭配方顆粒約0.1g，精密加入適量的對(duì)照品儲(chǔ)備液，按“1.3”項(xiàng)方法制成加樣回收樣品溶液，平行制備6 份.進(jìn)行次黃嘌呤回收率測(cè)試時(shí)，將以上加樣回收樣品溶液稀釋10 倍上機(jī)進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算平均回收率，結(jié)果見表3.7 種堿基和核苷的平均回收率在87.09%—105.81%之間，RSD%在1.35%—4.70%之間，表明方法的準(zhǔn)確性高.

表3 7種堿基和核苷的加樣回收率（n=6）Table 3 The recovery data of 7 nucleobases and nucleosides

續(xù)表3

2.6 殘留實(shí)驗(yàn)

高濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000 ng·mL?1）分析完成后，進(jìn)樣10%甲醇試劑空白，考察殘留情況.結(jié)果表明，7 種堿基和核苷化合物檢測(cè)通道中均無明顯目標(biāo)化合物干擾.

3 結(jié)論

本文建立了一種使用島津超高效液相色譜儀Nexera X2 和三重四極桿質(zhì)譜儀LCMS-8050 聯(lián)用測(cè)定水蛭配方顆粒中7 種堿基和核苷成分的分析方法.該方法分析速度快，重復(fù)性好，靈敏度和準(zhǔn)確度較高，適合水蛭配方顆粒中堿基和核苷類化合物的快速定量檢測(cè)，可為水蛭配方顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考.