微波輔助提取紫甘藍(lán)中花青素工藝優(yōu)化的研究

李艷秋，劉宇欣，李紅利

（1.漯河職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品學(xué)院，河南漯河 462002；2.河南工業(yè)大學(xué)漯河工學(xué)院，河南漯河 462002；3.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州 450001）

紫甘藍(lán)也叫紅甘藍(lán)，俗稱紫包菜，是蕓苔屬十字花科中的一個(gè)植物。甘藍(lán)是歐洲地中海海岸的一種蔬菜[1]，栽培史長達(dá)數(shù)十年。紫甘藍(lán)進(jìn)入中國的時(shí)間相對(duì)較短，只有100 余年的歷史。紫甘藍(lán)營養(yǎng)價(jià)值較高，含有B 族維生素、葉酸、維C、維E、纖維素等。此外，紫甘藍(lán)中還含有豐富的花青素，花青素是一種在水中溶解性較大的細(xì)胞色素[2]，主要見于花、果、葉等中，是一種生物類黃酮物質(zhì)[3]，遇酸堿時(shí)會(huì)發(fā)生變化，當(dāng)細(xì)胞液為酸性時(shí)花青素溶液會(huì)偏紅，細(xì)胞液呈堿性則花青素溶液又變?yōu)樗{(lán)色[4]?；ㄇ嗨卦谑称分?、化妝品、染料、醫(yī)藥等方面應(yīng)用廣泛。

花青素抗氧化功能較好，是一種極好的自由基清除劑及脂質(zhì)過氧化抑制劑[5]。據(jù)調(diào)查，花青素的抗氧化能力是普通抗氧化劑能力的數(shù)十倍，在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。大量資料顯示，花青素在某些方面有抗腫瘤的效果；許多科學(xué)家也從不同的研究發(fā)現(xiàn)花青素對(duì)預(yù)防和治療直腸癌、前列腺癌、胃癌、食道癌、皮膚癌等都有很好的療效?；ㄇ嗨乜梢酝ㄟ^提高人體的抗氧化能力，調(diào)節(jié)血清甘氨酸甘油三酯、總膽固醇和高低密度脂蛋白等功能來達(dá)到降低血糖和血脂的作用，如紫薯花青素、葡萄花青素、菊花花青素等[6]。大量的數(shù)據(jù)顯示，花青素除了具有以上作用之外，還具有保護(hù)肝臟、對(duì)睪丸的靶向作用[7]及保護(hù)視力等作用。還有報(bào)道稱其具有延緩細(xì)胞衰老、增強(qiáng)人體免疫、抗炎、抗疲勞及抗菌等多種功能[8]，但這些作用機(jī)制至今還不清楚，有待進(jìn)一步的研究。

近年來，花青素的上述多種功效引起了廣大科研者的關(guān)注?；ㄇ嗨氐奶崛》椒ㄖ饕形⒉ㄝo助提取法、超聲波輔助提取法、酶輔助提取法、有機(jī)溶劑提取法、水浴提取法等。微波輔助提取法是最經(jīng)濟(jì)、快捷、最有價(jià)值的一種提取工藝[9]。然而，微波輔助提取法也存在一些弊端，其提取設(shè)備比較昂貴，并且所選擇的溶劑也有很大的限制。欒娜等人[10]在超聲輔助提取紫甘藍(lán)中原花青素工藝的優(yōu)化試驗(yàn)中，在提取原花青素時(shí)，超聲波萃取對(duì)花青素浸出率影響最大的是料液比。超聲波輔助提取法的優(yōu)點(diǎn)是提取效率較高，提取原料范圍較廣泛，提取后所得雜質(zhì)較少等；缺點(diǎn)是對(duì)提取設(shè)備要求較高，提取時(shí)間較微波比略高等。利用生物酶萃取相對(duì)來說是一種比較省事、效率高、溫和且環(huán)保的提取方法[11]。采用生物酶輔助提取工藝具有條件溫和、操作環(huán)境安全、對(duì)環(huán)境污染比較小、提取效果高效的特點(diǎn)；缺點(diǎn)是對(duì)溫度有著較高的要求、提取成本比較高等。有機(jī)溶劑提取法是目前世界上應(yīng)用最廣的一種提取花青素的方法。該方法相對(duì)來說對(duì)儀器要求比較低，操作比較簡(jiǎn)單；但也有很多不足之處，其中最嚴(yán)重的就是大多數(shù)有機(jī)溶劑的毒副作用大，會(huì)對(duì)人體健康造成危害，并且產(chǎn)物提取率低。

在查閱大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上以紫甘藍(lán)為研究對(duì)象，利用微波法從紫甘藍(lán)中提取花青素。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

新鮮紫甘藍(lán)，購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.1.2 試驗(yàn)試劑

將無水乙醇配制為體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇，檸檬酸配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的檸檬酸溶液。

無水乙醇500 mL，天津市富宇精細(xì)化工有限公司提供；檸檬酸500 g，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600 型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司產(chǎn)品；FA2004 型電子分析天平，上海上平儀器有限公司產(chǎn)品；TGL-16G 型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；HH-8 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司產(chǎn)品；DHG-9101.1SA 型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；EG823LA3-NR 型微波爐，佛山市順德區(qū)美的微波電器制造有限公司產(chǎn)品；FW177 型高速萬能粉碎機(jī)，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

以檸檬酸與乙醇混合溶液為提取劑，對(duì)紫甘藍(lán)中的花青素通過微波輔助提取法進(jìn)行提取，并根據(jù)吸光度來確定花青素含量，并對(duì)紫甘藍(lán)花青素的穩(wěn)定性進(jìn)行了探討。

1.3.1 預(yù)處理

將采購的新鮮紫甘藍(lán)清洗切碎，放入60 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干，再打碎成粉，用60 目網(wǎng)篩過篩，過濾后的粉末放入密封袋內(nèi)，密閉保存。

1.3.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

（1）配制0.8%鹽酸-乙醇混合溶液。在250 mL容量瓶中用移液管準(zhǔn)確移入2 mL 的濃鹽酸，用無水乙醇定容。

（2）配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。將矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品在10 mL 的棕色容量瓶中精確稱量2 mg，用0.8%鹽酸-乙醇混合溶液定容。

（3）所使用標(biāo)準(zhǔn)溶液。在10 mL 棕色容量瓶中分別移取0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.8%的鹽酸-乙醇溶液進(jìn)行定容，最終得到的質(zhì)量濃度為4，6，8，10，12 μg/mL 的溶液。

（4）測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。取所使用標(biāo)準(zhǔn)溶液分別于比色皿中，以乙醇-鹽酸混合溶液為空白，于波長520 nm 處測(cè)定其吸光度。3 組平行試驗(yàn)也在同一時(shí)間進(jìn)行。以矢車菊-3 -O-葡萄糖苷的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，所對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制了矢車菊-3-O-葡萄糖苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終得出其回歸方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=0.050 5X+0.034 2（R2=0.999 2）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度見表1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度 /μg·mL-1

1.3.3 花青素的提取及含量的計(jì)算

在電子分析天平上準(zhǔn)確稱取2.000 0 g 紫甘藍(lán)粉末于錐形瓶中，用所選擇的料液比將乙醇和檸檬酸混合，然后在設(shè)定的提取時(shí)間和提取功率下進(jìn)行提取。以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心20 min，將0.4 mL離心后的上清液置于10 mL 容量瓶中，用提取劑稀釋25 倍并定容。同時(shí)，做3 組平行試驗(yàn)，測(cè)定其吸光度，采用公式計(jì)算了其含量?；ㄇ嗨睾坑?jì)算公式如下：

式中：C——測(cè)定吸光度所對(duì)應(yīng)的花青素質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——提取劑體積，mL；

M——所取紫甘藍(lán)粉末的質(zhì)量，g；

X——稀釋倍數(shù)。

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 乙醇與檸檬酸體積比

在錐形瓶中分別準(zhǔn)確稱取5 份2.000 0 g 樣品，再分別加入體積比為3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3 的乙醇和檸檬酸混合物，在微波功率為240 W，料液比為1∶20（g∶mL），提取時(shí)間為3 min 條件下進(jìn)行提取。以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心20 min，在10 mL棕色容量瓶中置于0.4 mL 上清液，稀釋25 倍，定容，搖晃均勻后測(cè)定吸光度，并根據(jù)上述公式計(jì)算出花青素含量，從而確定最佳體積比。

1.4.2 料液比

在錐形瓶中分別準(zhǔn)確稱取5 份2.000 0 g 樣品，將料液比分別確定為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（g∶mL）并固定最佳體積比，設(shè)置微波功率為240 W，提取時(shí)間為3 min 提取。以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心20 min，在10 mL 棕色容量瓶中置于0.4 mL 上清液，使其稀釋25 倍，定容，通過測(cè)量吸光度計(jì)算出花青素含量，最后得出最佳料液比。

1.4.3 提取時(shí)間

在錐形瓶中分別準(zhǔn)確稱取5 份2.000 0 g 樣品，固定最佳料液比和體積比，按照微波功率為240 W，分別在微波爐中提取1，2，3，4，5 min。以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心20 min，在10 mL 棕色容量瓶中置于0.4 mL 上清液，使其稀釋25 倍，定容，通過測(cè)量吸光度來計(jì)算出花青素含量，最后得出最佳提取時(shí)間。

1.4.4 微波提取功率

在錐形瓶中分別準(zhǔn)確稱取5 份2.000 0 g 樣品，固定最佳料液比、體積比和提取時(shí)間，分別在微波爐中以80，240，400，640，800 W 的功率下提取。以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心20 min，收集上清液，在10 mL 容量瓶中加入0.4 mL 上清液，使其稀釋25 倍，定容，通過測(cè)定吸光度計(jì)算出花青素含量，最終確定最佳微波提取功率。

1.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過以上的單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，料液比、提取功率、乙醇和檸檬酸的體積比、提取時(shí)間這4 個(gè)因素對(duì)花青素的提取率影響最大。因此，設(shè)計(jì)這4 個(gè)因素做四因素三水平正交試驗(yàn)。以紫甘藍(lán)中花青素含量為參考，研究出提取紫甘藍(lán)花青素的最佳工藝條件。當(dāng)正交試驗(yàn)方法得出的最佳組合與極差分析結(jié)果不同時(shí)，必須進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 乙醇與檸檬酸體積比對(duì)紫甘藍(lán)花青素含量的影響

乙醇與檸檬酸體積比對(duì)花青素含量的影響見圖2。

圖2 乙醇與檸檬酸體積比對(duì)花青素含量的影響

由圖2 可知，在研究體積比這一因素時(shí)，當(dāng)固定其他因素不變時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的不斷增加和檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不斷下降，紫甘藍(lán)中花青素含量大體保持降低。其中在二者體積比從3∶7 變?yōu)?∶6 的過程中，紫甘藍(lán)花青素含量保持上升，在乙醇和檸檬酸體積比為4∶6 時(shí)，紫甘藍(lán)中花青素含量達(dá)到最大。超過這一比例，花青素含量又繼續(xù)降低。這是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)過高會(huì)破壞花青素結(jié)構(gòu)，從而使得測(cè)得花青素含量變低。因此，選擇乙醇與檸檬酸最佳體積比為4∶6。

2.1.2 料液比對(duì)紫甘藍(lán)花青素含量的影響

料液比對(duì)花青素含量的影響見圖3。

圖3 料液比對(duì)花青素含量的影響

由圖3 可知，在料液比這一因素中，當(dāng)固定其他因素不變時(shí)，隨著料液比的不斷升高，紫甘藍(lán)花青素含量持續(xù)升高，在料液比為1∶25 時(shí)，其含量最高，過此峰值后，紫甘藍(lán)中花青素含量又在逐漸下降。這一現(xiàn)象產(chǎn)生的原因可能是隨著料液比的增加，紫甘藍(lán)中的其他雜質(zhì)也隨之增多，從而使得所提取出來的花青素含量降低，在料液比為1∶25 時(shí)，花青素含量最多。因此，選擇1∶25 為最佳料液比。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)紫甘藍(lán)花青素含量的影響

提取時(shí)間對(duì)花青素含量的影響見圖章4。

由圖4 可知，在選定最佳乙醇和檸檬酸體積比和料液比情況下，固定微波提取功率時(shí)，花青素提取時(shí)間越長，花青素含量先增后減。在提取3 min 時(shí)所提取出的花青素含量達(dá)到最高。其主要原因可能是由于提取時(shí)間過短時(shí)，未充分萃取花青素，而隨著提取時(shí)間的繼續(xù)延長，長時(shí)間加熱又會(huì)破壞花青素的結(jié)構(gòu)，并且對(duì)花青素的穩(wěn)定性也會(huì)產(chǎn)生一定的損害。因此，選擇3 min 為最佳提取時(shí)間。

圖4 提取時(shí)間對(duì)花青素含量的影響

2.1.4 微波功率對(duì)紫甘藍(lán)花青素含量的影響

微波功率對(duì)花青素含量的影響見圖5。

圖5 微波功率對(duì)花青素含量的影響

由圖5 可知，在選定最佳乙醇和檸檬酸體積比、最佳提取時(shí)間、最佳料液比的前提下，在微波功率為80～240 W 時(shí)，紫甘藍(lán)花青素含量升高，并且在240 W時(shí)，花青素含量達(dá)到最高。在之后更高的微波提取功率下，花青素含量又突然持續(xù)下降。這是因?yàn)榛ㄇ嗨夭荒蜔?，?duì)熱非常敏感，溫度升高會(huì)使花青素的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使花青素含量大幅度降低。因此，選擇240 W為最佳微波提取功率。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了L9（34）正交試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析

由表5 可知，A1B2C2D2是9 組正交試驗(yàn)最佳組合，即微波功率為240 W，乙醇和檸檬酸體積比為3∶7，提取時(shí)間為3 min，料液比為1∶25。對(duì)紫甘藍(lán)花青素提取含量結(jié)果影響的主次順序?yàn)橐掖己蜋幟仕狍w積比（A）＞微波功率（D）＞提取時(shí)間（C）＞料液比（B）。

表5 正交結(jié)果和方差分析得到的花青素含量 /mg·g-1

由表6 可知，乙醇與檸檬酸體積比（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）、微波功率（D）對(duì)紫甘藍(lán)花青素提取結(jié)果均有極顯著影響。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

正交結(jié)果和方差分析得到的花青素含量見表5。

由表7 可知，用正交試驗(yàn)和極差分析得出的結(jié)果是不同的，所以必須進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。以A1B2C2D2為最佳的正交試驗(yàn)方案，并進(jìn)行3 組平行試驗(yàn)，再計(jì)算花青素含量，取平均值。A1B2C2D3是極差分析得出的最優(yōu)組合，做3 組平行試驗(yàn)，取平均值。將兩者所得的結(jié)果進(jìn)行比較可知，極差分析得出的組合花青素含量較高，所以A1B2C2D3即料液比為1∶25，乙醇與檸檬酸體積比為3∶7，微波提取功率為400 W，提取時(shí)間為3 min 為最優(yōu)提取組合。

3 結(jié)論

采用微波法，以乙醇檸檬酸混合溶液為提取劑，提取紫甘藍(lán)中的花青素。通過單因素試驗(yàn)得出各個(gè)因素對(duì)紫甘藍(lán)花青素含量的影響，在單因素的基礎(chǔ)上又設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)。通過正交試驗(yàn)和極差分析得到了2 種不同的最優(yōu)組合，最后又通過驗(yàn)證試驗(yàn)得出最優(yōu)組合為A1B2C2D3。該方法具有操作簡(jiǎn)便、時(shí)間短、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。紫甘藍(lán)花青素作為一種安全無毒的天然色素，其在食品、化妝品和醫(yī)藥等方面有很好的前景。相信在未來隨著提取方法的不斷發(fā)展，紫甘藍(lán)花青素將會(huì)應(yīng)用在更多的領(lǐng)域，更好地為人類服務(wù)。