嗜酸乳桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建及其甘露聚糖酶的表達(dá)

顧斌濤，郭建軍，曾 靜，聶俊輝，王 通，熊大維，袁 林*

（江西省科學(xué)院 微生物研究所，江西 南昌 330096）

β-1,4-甘露聚糖酶（β-1,4-mannanase）EC 3.2.1.78，簡稱β-甘露聚糖酶或甘露聚糖酶，是一類水解甘露聚糖分子內(nèi)β-1,4糖苷鍵的內(nèi)切型水解酶[1-3]。甘露聚糖酶廣泛應(yīng)用于飼料添加劑、石油開采、紙漿加工、果汁澄清、生物質(zhì)糖化、洗滌添加劑和甘露寡糖的制備等[4-7]。甘露聚糖酶存在于各類微生物、動物和植物中，其中微生物來源的甘露聚糖酶具有種類豐富、生產(chǎn)成本低、酶活性高和耐極端環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)[8-10]。

產(chǎn)甘露聚糖酶的微生物包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、曲霉屬（Asperillus）、腐質(zhì)霉屬（Humicola）、青霉菌屬（Penicilium）和籃狀菌屬（Talaromyces）等[11-13]，但基于生物制品安全性的風(fēng)險，常用野生產(chǎn)酶菌株無法滿足飼料和食品安全性的要求。嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）是乳酸菌中被廣泛研究的安全菌株之一，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡[14]、提高動物體免疫力[15]、促進(jìn)宿主動物健康生長[16]、參與機(jī)體重要生理活動[17]、安全無毒等益生優(yōu)點(diǎn)，是替代抗生素使用的優(yōu)良微生物飼料添加劑[18]。研究表明，嗜酸乳桿菌等益生菌制劑可降低腸道有害菌的數(shù)量，改善腸道健康，有利于肉仔雞的生長[19]。

目前報道能產(chǎn)酶的乳酸菌有乳桿菌屬和片球菌屬（Pediococcus）等，干酪乳桿菌產(chǎn)甘露聚糖酶酶活能達(dá)到75.8 U/mL[3]。嗜酸乳桿菌產(chǎn)甘露聚糖酶目前還鮮見報道。為構(gòu)建產(chǎn)甘露聚糖酶嗜酸乳桿菌菌株，本研究將甘露聚糖酶基因與嗜酸乳桿菌表達(dá)載體連接，構(gòu)建嗜酸乳桿菌分泌表達(dá)載體，以期獲得含分泌表達(dá)甘露聚糖酶的嗜酸乳桿菌制劑，本研究旨在拓展產(chǎn)甘露聚糖酶的乳酸菌菌株，為甘露聚糖酶在飼料、食品等安全性要求高的行業(yè)進(jìn)一步應(yīng)用提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）XW118、質(zhì)粒pDX、質(zhì)粒pDXAO3：本實(shí)驗(yàn)室保藏[20-21]。

1.1.2 化學(xué)試劑

T4脫氧核糖核酸連接酶、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）限制性內(nèi)切酶、TaqDNA 聚合酶、DNA Marker：大連寶生物公司；胰蛋白酶（酶活180 U/mg）：生工生物工程（上海）股份有限公司；胃蛋白酶（酶活15 U/mg）：阿拉丁生化科技股份有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；甘露聚糖：美國Sigma-Aldrich公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉4 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸三銨2g/L，硫酸鎂七水0.2 g/L，硫酸錳一水0.05 g/L，吐溫-80 1 g/L。115 ℃高壓滅菌30 min。

MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉18 g/L。115 ℃高壓滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

GI54DS自動壓力蒸汽滅菌器：致微（廈門）儀器有限公司；ZWY-2102C恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；T100聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Micro Pulser電穿孔儀：美國Bio-Rad公司；EPS600電泳儀：上海天能科技有限公司；ZF-288凝膠成像系統(tǒng)：上海嘉鵬科技有限公司；UV-6100紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；H1650-W離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；QuantStudio實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-fqPCR）儀：美國賽默飛世爾科技公司；Scientz-IID超聲波細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 載體的構(gòu)建

通過基因合成氨芐青霉素抗性基因表達(dá)盒及pMB1復(fù)制子序列，連接到嗜酸乳桿菌的內(nèi)源性質(zhì)粒pDX中，獲得可在大腸桿菌和嗜酸乳桿菌穿梭的載體pDXA。合成與質(zhì)粒pDX中的ORF3啟動子相接的四環(huán)素抗性基因，并連接到載體pDXA的ORF3啟動子處，構(gòu)建獲得載體pDXAO3。合成甘露聚糖酶基因，連入載體pDXAO3中的ORF4啟動子序列的下游，獲得載體pDX34M。

1.3.2 嗜酸乳桿菌的轉(zhuǎn)化

將嗜酸乳桿菌在MRS固體平板上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后取5 mL嗜酸乳桿菌培養(yǎng)液接種到45 mL MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)90 min，收集菌體用冰水浴預(yù)冷的10%甘油溶液重懸洗滌兩次，收集菌體，加入冰水浴預(yù)冷的緩沖液（0.4 mol/L蔗糖，2 mmol/L MgCl2，5 mmol/L KH2PO4），分別依次加80 μL嗜酸乳桿菌和20 μL表達(dá)載體到電擊杯中，混合均勻后冰浴4 min，迅速電擊（電擊轉(zhuǎn)化參數(shù)為1.8 kV、200 Ω、25 μF，脈沖時間4.0 ms）后轉(zhuǎn)移到MRS液體培養(yǎng)基，29 ℃活化4 h，涂布于含50 μg/mL四環(huán)素的MRS固體平板，在29 ℃條件下培養(yǎng)至有嗜酸乳桿菌轉(zhuǎn)化子的菌落，對嗜酸乳桿菌轉(zhuǎn)化子的甘露聚糖酶基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定酶基因是否轉(zhuǎn)入嗜酸乳桿菌。

1.3.3 嗜酸乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)甘露聚糖酶及其酶活測定

挑取重組嗜酸乳桿菌單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)30 h，按5%接種量進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵，每隔4 h取樣，離心棄上清，取菌體沉淀用7 g/L氯化鈉溶液洗滌兩次，用超純水重懸，于冰浴條件下超聲破碎細(xì)胞15 min，4 ℃、11 000 r/min條件下離心15 min，取上清酶液測定重組甘露聚糖酶活性。甘露聚糖酶活性測定方法采用DNS法[22]。甘露聚糖酶活性定義：在37 ℃和pH值5.5條件下，每分鐘水解甘露聚糖釋放1 μmol的還原糖所需要的酶量為1個酶活單位（U）。

1.3.4 重組甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)

最適反應(yīng)pH值：用適合的緩沖體系分別把底物溶液的pH值調(diào)到3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0（其中pH 3.0用甘氨酸-鹽酸緩沖體系，pH 3.0、pH 4.0、pH 4.5和pH 5.0用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系，其他用磷酸鈉緩沖體系），分別測定樣品在不同pH值條件下的重組甘露聚糖酶活力，以酶活最高酶液作為對照計算相對酶活。

pH穩(wěn)定性：用適合的緩沖體系分別把酶液的pH值調(diào)到3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，37 ℃條件下保溫60 min后，分別測定樣品在不同pH值條件下的重組甘露聚糖酶活力，未經(jīng)保溫處理的酶液作為對照計算相對酶活。

最適溫度：酶促反應(yīng)溫度分別設(shè)置為30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃，分別測定樣品在不同溫度條件下的重組甘露聚糖酶活力，以酶活最高的酶液作為對照計算相對酶活。

溫度穩(wěn)定性：分別在溫度為30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃的條件下保溫60 min，然后立即用4 ℃水浴冷卻，分別測定樣品在不同溫度條件下重組甘露聚糖酶酶活力，未經(jīng)保溫處理酶液作為對照計算相對酶活。

1.3.5 嗜酸乳桿菌的耐酸性研究

分別將嗜酸乳桿菌及其轉(zhuǎn)化子單菌落接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃液體培養(yǎng)24 h后收集菌體，分別在pH為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5的緩沖液（其中pH 2.0用氯化鉀-鹽酸緩沖體系，pH 2.5、pH 3.0用甘氨酸-鹽酸緩沖體系，pH 3.0、pH 4.0、pH 4.5用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系）中孵育2 h，適當(dāng)稀釋后在MRS培養(yǎng)基平板培養(yǎng)計數(shù)，計算存活率，其計算公式如下：

式中：N0為孵育前菌懸液的活菌數(shù)，CFU/mL；Nx為孵育后菌懸液的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.6 甘露聚糖酶抗蛋白酶水解研究

將嗜酸乳桿菌轉(zhuǎn)化子發(fā)酵的甘露聚糖酶液分別與胃蛋白酶、胰蛋白酶在37 ℃水解，反應(yīng)pH分別為2.5和7.6，每隔20 min取樣立即置冰浴并迅速將溶液pH調(diào)節(jié)至6.5。對水解產(chǎn)物直接進(jìn)行甘露聚糖酶活力測定。將未經(jīng)過蛋白酶處理甘露聚糖酶液作為對照樣品按相同條件處理，計算甘露聚糖酶液的相對酶活。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。采用Excel 2019進(jìn)行分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

合成甘露聚糖酶基因，連接到質(zhì)粒pDXAO3的ORF4啟動子下，獲得表達(dá)載體pDX34M見圖1。由圖1可知，載體pDX34M具有氨芐青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、pMB1復(fù)制子序列和嗜酸乳桿菌內(nèi)源性質(zhì)粒復(fù)制蛋白基因，可以在大腸桿菌或嗜酸乳桿菌中進(jìn)行復(fù)制。

圖1 甘露聚糖酶表達(dá)載體pDX34M的構(gòu)建Fig.1 Construction of mannanase expression vector pDX34M

2.2 表達(dá)載體pDX34SM轉(zhuǎn)化嗜酸乳桿菌

將表達(dá)載體pDX34SM電轉(zhuǎn)化嗜酸乳桿菌，在MRS液體培養(yǎng)基孵育活化后，涂布MRS固體抗性平板，挑選抗性菌落，獲得含甘露聚糖酶基因的重組嗜酸乳桿菌，PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，重組嗜酸乳桿菌含甘露聚糖酶基因序列。重組嗜酸乳桿菌菌落形態(tài)見圖2。由圖2可知，重組嗜酸乳桿菌在MRS固體抗性平板上生長。

圖2 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化嗜酸乳桿菌Fig.2 Transformation of expression vector in Lactobacillus acidophilus

將重組嗜酸乳桿菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定菌體破碎后的上清酶液的甘露聚糖酶活及OD600nm值，結(jié)果見圖3。由圖3可知，發(fā)酵時間為0～16 h時，重組嗜酸乳桿菌快速生長；發(fā)酵時間16～24 h時，重組嗜酸乳桿菌生長開始減緩；發(fā)酵時間＞24 h之后，重組嗜酸乳桿菌生長趨于平穩(wěn)。發(fā)酵時間為0～8 h時，甘露聚糖酶緩慢增加；發(fā)酵時間8～24 h時，甘露聚糖酶酶活增加較快；發(fā)酵為24 h時，甘露聚糖酶酶活最高，為353 U/mL；發(fā)酵＞24 h之后，甘露聚糖酶酶活有所下降。因此，重組嗜酸乳桿菌最適培養(yǎng)時間為24 h。測試宿主嗜酸乳桿菌破碎后的上清液，并未測出甘露聚糖酶活性，表明重組嗜酸乳桿菌成功表達(dá)甘露聚糖酶。

圖3 重組嗜酸乳桿菌的生長曲線及產(chǎn)酶曲線Fig.3 Growth curve and enzyme production curve of recombinant Lactobacillus acidophilus

2.3 重組甘露聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)

分別在不同的pH緩沖體系和溫度條件下測定甘露聚糖酶酶活力，結(jié)果分別見圖4和圖5。

圖4 重組甘露聚糖酶的最適pH（a）及pH穩(wěn)定性（b）Fig.4 Optimal pH (a) and pH stability (b) of recombinant mannanase

圖5 重組甘露聚糖酶的最適溫度（a）及溫度穩(wěn)定性（b）Fig.5 Optimal temperature (a) and temperature stability (b) of recombinant mannanase

由圖4a可知，重組甘露聚糖酶的最適作用pH為5.5，該酶在pH 5.0～6.0范圍內(nèi)催化活性保留在80%以上。由圖4b可知，重組酶在pH 5.0～7.0之間穩(wěn)定性較好。當(dāng)pH高于7.0甘露聚糖酶穩(wěn)定性隨pH的升高而下降。由圖5a可知，重組甘露聚糖酶的最適作用溫度為55 ℃；由圖5b可知，重組甘露聚糖酶在溫度50～60 ℃范圍內(nèi)有較好的催化活性，該酶在溫度＜35 ℃時較為穩(wěn)定，當(dāng)溫度＞65 ℃之后，穩(wěn)定性急劇下降，可能是由于甘露聚糖酶在高溫下發(fā)生蛋白熱變性而失活[23-25]。

2.4 重組嗜酸乳桿菌的耐酸性

研究嗜酸乳桿菌對動物胃液pH值的耐酸性，對嗜酸乳桿菌益生作用的實(shí)際發(fā)揮具有重要的意義。重組嗜酸乳桿菌耐酸性測定結(jié)果見圖6。由圖6可知，重組嗜酸乳桿菌在pH 2.0時的存活率為77.3%。在pH 2.0～4.5范圍內(nèi)重組嗜酸乳桿菌的耐酸性與出發(fā)菌無明顯差異，說明轉(zhuǎn)化對嗜酸乳桿菌的耐酸性無顯著影響。

圖6 重組嗜酸乳桿菌的酸耐受性Fig.6 Acid resistance of recombinant Lactobacillus acidophilus

2.5 重組甘露聚糖酶的抗蛋白酶性質(zhì)

用胃蛋白酶和胰蛋白酶分別對重組甘露聚糖酶酶液進(jìn)行耐受性研究，結(jié)果見圖7。由圖7可知，重組甘露聚糖酶對胃蛋白酶的耐受性比胰蛋白酶更好，胰蛋白酶處理160 min后酶液甘露聚糖剩余28%的酶活。胃蛋白酶處理160 min后甘露聚糖仍剩余65%的酶活，表明該甘露聚糖酶具有一定的抗胃蛋白酶和部分抗胰蛋白酶降解的能力。

圖7 重組嗜酸乳桿菌的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶活性Fig.7 Anti-pepsin and anti-typsin activities of recombinant Lactobacillus acidophilus

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建甘露聚糖酶基因的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化嗜酸乳桿菌，研究重組嗜酸乳桿菌產(chǎn)甘露聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)，并測定重組嗜酸乳桿菌的耐酸性及甘露聚糖酶的抗蛋白酶活性。結(jié)果表明，重組嗜酸乳桿菌發(fā)酵24 h甘露聚糖酶活性為353 U/mL。甘露聚糖酶的最適催化pH值為5.5，最適催化溫度為55 ℃。重組嗜酸乳桿菌在pH 2.0～4.5有一定的耐酸性，在pH 2.0條件下2 h的存活率為77.3%。甘露聚糖酶液用胃蛋白酶、胰蛋白酶處理160 min后，甘露聚糖酶剩余相對酶活分別為65%、28%。表明該甘露聚糖酶具有一定的抗胃蛋白酶和部分抗胰蛋白酶降解的能力，可作為候選益生菌株在食品和飼料方面作進(jìn)一步的功能性應(yīng)用研究。